陳丹陽 陳壽明 梅運(yùn)鵬 甘 勇 楊章明 杜 曉 馬應(yīng)超李 斌 安德榮

（1西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病毒和資源微生物實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；

2四川省煙草公司攀枝花市公司，四川攀枝花 617000；3中國煙草總公司陜西省公司，陜西西安 710000；4中國煙草總公司四川省公司，四川成都 610000）

煙草野火病，又稱火燒病，是由丁香假單胞菌煙草致病變種（Pseudomonas syringae pv.tabaci）侵染引起的細(xì)菌性病害，在煙草上發(fā)生較為普遍。該病害首次由美國人Wolf和Foster在1917年報(bào)道[1]，隨后在美國、澳大利亞、德國、法國、意大利等國家相繼發(fā)生，嚴(yán)重影響了烤煙的質(zhì)量和產(chǎn)量[2]。

20世紀(jì)40年代末在我國云南煙區(qū)首次發(fā)現(xiàn)少數(shù)煙株感染了煙草野火病[3]，隨后在多省份煙區(qū)都有發(fā)現(xiàn)，但危害性不是很嚴(yán)重。直到20世紀(jì)80年代，煙草野火病才開始逐漸從北向南真正傳播，在陜西煙區(qū)和山東煙區(qū)的發(fā)生面積較大，在黑龍江煙區(qū)的發(fā)病率更是達(dá)到100%，使烤煙價(jià)值喪失，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，已經(jīng)上升為煙區(qū)主要病害[4]。本文針對(duì)煙草野火病的發(fā)病癥狀、病原菌的生物學(xué)特征、流行規(guī)律、病原菌鑒定方法及綜合防治等方面的研究進(jìn)行了闡述。

1 煙草野火病田間發(fā)病癥狀

煙草野火病在幼苗期、團(tuán)棵期和旺長期均可發(fā)生，主要危害葉片，莖稈、果實(shí)和萼片偶爾也會(huì)發(fā)病[5]。發(fā)病初期，葉片上出現(xiàn)褐色小圓點(diǎn)，隨后周圍形成明顯的黃色暈圈，這是由野火病病原物分泌的毒素導(dǎo)致的（圖1a）。在高溫高濕的適宜條件下，病斑迅速擴(kuò)大，并大面積連接在一起，像火燒一樣，同時(shí)黃色暈圈也隨之變大。當(dāng)遭遇連續(xù)降雨、濕度較大時(shí)，病斑大面積擴(kuò)展，葉片背面還會(huì)有菌膿產(chǎn)生[6]。當(dāng)天氣少雨干燥時(shí)，葉片上的病斑容易脆落，高溫有利于野火病的發(fā)生。

田間煙草野火病與角斑病、赤星病、靶斑病經(jīng)?；旌习l(fā)生，在癥狀上很相似，難以分辨（表1）。有研究表明：煙草野火病菌會(huì)產(chǎn)生毒素，使病斑周圍產(chǎn)生黃色暈圈；而煙草角斑病菌不會(huì)產(chǎn)生毒素，病斑沒有被黃色暈圈包圍[4]。煙草野火病病斑輪紋成不規(guī)則形和多角形，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)大片病斑連接在一起，同時(shí)天氣潮濕時(shí)葉片背部會(huì)有菌膿產(chǎn)生；而煙草赤星病是真菌性病害，不會(huì)產(chǎn)生菌膿，其病斑呈現(xiàn)同心輪紋狀，顏色深（多為深褐色），病斑獨(dú)立分布。煙草感染靶斑病后，葉片會(huì)出現(xiàn)同心輪紋不規(guī)則斑，病斑被褪綠暈圈包圍，病斑壞死部位容易碎裂，類似打靶打出的洞孔[7]。因此，煙農(nóng)要做好田間病害的監(jiān)控調(diào)查工作，以便于采取相應(yīng)的防治措施，取得較好的防治效果。

表1 煙草野火病與煙草角斑病、赤星病、靶斑病等相似葉部病害比較

2 煙草野火病病原菌生物學(xué)特性

煙草野火病菌是由丁香假單胞菌煙草致病變種引起的一種細(xì)菌性病害，發(fā)病較為普遍[8]。丁香假單胞菌煙草致病變種可侵染多個(gè)種屬的植物，但在宿主煙草植物上會(huì)引發(fā)野火病，在其他非寄主中誘導(dǎo)超敏反應(yīng)，因而認(rèn)為煙草才是其真正的寄主[9]。煙草植株感染煙草野火病后，野火病病原菌可分泌一種煙毒素，結(jié)構(gòu)為α-乳酸氨基-β-羥基-Σ-氨基庚二酸內(nèi)酯，它能夠破壞煙草葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致葉片上生成褪綠暈圈和病斑[10]。煙毒素也會(huì)干擾寄主組織的遺傳因子代謝和生物膜的谷氨酸代謝，從而導(dǎo)致煙株幼苗發(fā)育不良甚至凋亡[11]。徐 玲等[12]采用注射法將煙草野火病毒素注射到煙葉內(nèi)，觀察處理后的變化，發(fā)現(xiàn)從葉綠體形態(tài)變化到部分細(xì)胞出現(xiàn)質(zhì)壁分離再到細(xì)胞器逐漸解體，細(xì)胞變成碎片，細(xì)胞壁斷裂。

蔡訓(xùn)輝[13]對(duì)煙草野火病病原菌進(jìn)行分離與鑒定，結(jié)果表明，野火病病原菌短桿狀，無莢膜，無芽孢，兩端鈍圓，2～5根單極生鞭毛，革蘭氏染色陰性（圖1b）。煙草野火病病原菌在NA培養(yǎng)基上生長菌落特征是圓形微隆起，整齊，邊緣半透明白色，中心不透明暗黃色。在PDA培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)灰白色或者乳白色，圓形微隆起。在LB培養(yǎng)基上野火病病原菌菌落呈圓形微隆起，邊緣整齊，顏色從乳白色過渡到灰白色，整體半透明（圖1c）。在金氏B培養(yǎng)基上生長的菌落呈乳白色隆起，在320 nm的紫外燈照射下能夠觀察到綠色熒光[14]。煙草野火病菌的最適生長溫度是28℃，其菌株可以選擇用KB斜面繁殖，然后加入已滅菌的液體石蠟，在4～8℃條件下保存，半年轉(zhuǎn)移1次。

3 煙草野火病流行規(guī)律

煙草野火病的主要初侵染來源是田間越冬病殘?bào)w和種子[15]。在我國有學(xué)者利用血清學(xué)技術(shù)驗(yàn)證了煙草野火病的初侵染來源是種子和煙草根圍，沒有發(fā)現(xiàn)越冬病殘?bào)w帶菌[16]。田間煙草野火病病原菌是通過風(fēng)雨傳播、氣孔侵染和傷口侵染，其中最主要是通過傷口侵染，病菌擴(kuò)散到細(xì)胞間隙后分泌煙草野火病毒素，從而導(dǎo)致葉綠素合成受阻，周圍產(chǎn)生黃色暈圈[17]。

煙草野火病的發(fā)生受多種因素的影響，如煙草品種、栽培技術(shù)、氣候條件等。我國種植的多數(shù)煙草品種對(duì)野火病都沒有抗性或抗性較低，容易感染該病并造成大流行。此外，多施氮肥容易降低煙株對(duì)野火病的抗性，而多施磷、鉀肥能夠提高煙株的抗病性[18]。最關(guān)鍵的影響因素是氣候條件，其中濕度決定了煙草是否會(huì)感染野火病，濕度大尤其是下雨時(shí)，氣孔的開放程度較高，土壤中的病菌會(huì)通過雨水傳播從氣孔侵入煙株體內(nèi)，造成病害大流行[19]；惡劣氣候如暴風(fēng)雨和冰雹等，會(huì)對(duì)煙草產(chǎn)生很大的傷害，造成的傷口加快了病情的流行。

4 煙草野火病的鑒定方法

煙草野火病最直觀的鑒定方法就是田間癥狀觀察，但由于煙草野火病的發(fā)病癥狀與角斑病比較相似，即使是經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員一般也是在普遍發(fā)病之后才能鑒定出來，很難達(dá)到預(yù)報(bào)效果。煙草野火病與煙草赤星病、靶斑病田間發(fā)病癥狀相似，因而癥狀鑒定法非常耗時(shí)，效果極差[20]。

目前，常采用組織分離法對(duì)煙草野火病病原菌進(jìn)行分離鑒定：剪取病斑消毒后直接研磨，吸取汁液稀釋成不同濃度并采用涂布平板法進(jìn)行涂布，放置在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d長出單菌落；隨后開展相關(guān)的生理生化試驗(yàn)等進(jìn)行鑒定，如煙草野火病能在金氏B培養(yǎng)基上生長，在紫外燈照射下能觀察到綠色熒光[14]。但是，這種方法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、鑒定準(zhǔn)確率還低，不再適用于煙草病害的鑒定[21]。

細(xì)菌學(xué)最常見的鑒定方法是細(xì)菌16S測(cè)序，這種技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)病原菌的快速鑒定，但只能鑒定到分類學(xué)上的種的級(jí)別，對(duì)于有專化型的屬以下的小種病害難以鑒定[22]。

PCR技術(shù)可以很好地解決上述問題，包括實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)、巢式PCR技術(shù)和多重PCR技術(shù)。其中多重PCR是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入2對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核苷酸序列的反應(yīng)[23]。這種方法操作簡單、方便快捷，能夠快速鑒定出煙草病害，還能一次檢測(cè)2種以上病原物，但它對(duì)于模板DNA的濃度有要求，需要經(jīng)過提取基因組DNA的步驟，耗費(fèi)時(shí)間較長。

2000年日本學(xué)者建立了一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LAMP），恒溫條件下，1 h左右就能完成病原菌的檢測(cè)鑒定[24]。該擴(kuò)增技術(shù)的反應(yīng)成本低廉，特異性較強(qiáng)，反應(yīng)的2對(duì)引物是針對(duì)目標(biāo)序列中的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)的，靈敏度高，只需要微量的底物就能完成該反應(yīng)，鑒定的結(jié)果也很容易判斷，加入特殊物質(zhì)就能發(fā)生特殊顏色變化[20]。

5 煙草野火病的防治

5.1 抗病品種選育

培育抗病新品種是控制煙草野火病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。我國對(duì)于煙草野火病抗病品種的研究較少，且推廣的抗病品種其抗病性也沒有取得很好的防治效果。黃杏娥等[25]選擇24個(gè)普通煙草品種和2個(gè)野生品種進(jìn)行煙草野火病抗性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：遼煙15、C28等表現(xiàn)為高感，云南廣泛種植的K326、云煙85表現(xiàn)為中感，對(duì)煙草野火病的抗性均較低；而黃花煙和長花煙均表現(xiàn)為高抗，可以作為新的種質(zhì)資源來種植。夏緯躍[26]選擇75個(gè)煙草品種進(jìn)行抗性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高抗品種、抗病品種、感病品種和高感品種分別有6、25、35、9個(gè)；吉林省主栽品種云煙87、吉煙7號(hào)等都是感病品種，抗性較差，從而成為病害流行的關(guān)鍵因素。高 崇等[27]對(duì)收集到的38個(gè)煙草品種采用針刺結(jié)合無針頭注射法進(jìn)行抗性檢測(cè)，將其分為中抗、中感和感病3個(gè)抗性類型，其中中抗品種14個(gè)、中感品種20個(gè)、感病品種4個(gè)。由于供試菌株不同，環(huán)境、氣候和試驗(yàn)地點(diǎn)也有一定差別，每個(gè)研究者的試驗(yàn)結(jié)果都會(huì)有一些差異?？偠灾?，國內(nèi)煙草野火病的抗性品種研究還有很長的路要走。

5.2 農(nóng)業(yè)防治

目前，煙草野火病的農(nóng)業(yè)防治主要是采取以下幾種方法：一是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上要注重肥料的施用，少施氮肥、多施磷鉀肥，能有效提高煙株的抗病性；二是及時(shí)摘除感病的下層葉片，田間病殘物的清理要徹底，減少病害流行的初侵染來源；三是采取煙稻輪作的方法，減輕病害大面積的發(fā)生。

5.3 化學(xué)防治

化學(xué)藥劑防治煙草野火病的研究比較多，它也是防治該病害的主要手段。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上使用較多的藥劑有波爾多液、農(nóng)用硫酸鏈霉素、四環(huán)素、細(xì)菌清、福美雙、硫酸銅、銅高尚、浸種靈等。前人通過室內(nèi)防效和大田防效試驗(yàn)，為煙草野火病的化學(xué)防治提供了一些思路。魏代福等[28]采用紙碟法測(cè)定了福美雙可濕性粉劑等多種藥劑抑制煙草野火病菌的效果，結(jié)果顯示，農(nóng)用鏈霉素與福美雙等5種組合復(fù)配使用，抑菌效果比較顯著。劉起業(yè)等[29]通過使用波爾多液、農(nóng)用鏈霉素、氫氧化銅、80%必備波爾多液和自配波爾多液防治山東煙區(qū)的野火病，結(jié)果顯示，在團(tuán)棵期、旺長期和打頂前各噴施1次自制波爾多液，自配波爾多液中硫酸銅、生石灰和水配比為1∶1∶150時(shí)預(yù)防效果最好。唐 明等[30]研究了4種化學(xué)藥劑和3種噴藥時(shí)期對(duì)煙草野火病發(fā)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4%春雷霉素對(duì)煙草野火病的防治效果最好，其次是20%噻菌銅、3%噻霉銅、50%氯溴異氰尿酸，不同噴藥時(shí)期防治效果以旺長末期最佳，其次是下部葉成熟期、團(tuán)棵期。

王振國等[31]采取單獨(dú)使用和復(fù)配使用的方法研究野火病的最佳防治方案，結(jié)果表明：煙苗生長前期批次使用噻菌銅懸浮液、諾爾霉素水劑+能量金+斯德考普，能有效控制團(tuán)棵前野火病的發(fā)生；后期批次使用噻菌銅懸浮劑+菌核凈、噻菌銅懸浮劑、諾爾霉素，能夠有效控制后期野火病的發(fā)生。蔡訓(xùn)輝[13]研究表明，代森錳鋅、多菌靈和多粘類芽孢桿菌對(duì)野火病菌有很好的抑制效果。

5.4 生物防治

針對(duì)煙草野火病的生物防治研究比較少，主要是研究拮抗菌對(duì)煙草野火病的抑制作用?；瘜W(xué)農(nóng)藥的應(yīng)用帶來了很嚴(yán)重的“3R”問題，因而目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上對(duì)綠色防控的重視程度越來越高。研究并應(yīng)用拮抗菌和生物工程是煙草野火病生物防治的重要手段，可從發(fā)生煙草野火病的煙田中采集健康煙株的葉片、莖和根際土壤分離篩選和鑒定拮抗菌，為煙草野火病的防治提供新的種質(zhì)資源，從而提高烤煙的產(chǎn)量和質(zhì)量，獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。王玲玲[32]從土壤分離到127個(gè)菌株，通過平板對(duì)峙法篩選出3株對(duì)煙草野火病菌抑制效果最佳的菌株，其中枯草芽孢桿菌w-5233對(duì)煙草野火病的防治效果最顯著，達(dá)80%左右。王娜娜[33]采用平板對(duì)峙法及氯仿熏蒸法測(cè)定了120株菌株對(duì)煙草野火病菌的抑菌作用，結(jié)果篩選到有拮抗作用的菌株共計(jì)35株，其中放線菌21株、細(xì)菌14株。陳燾[34]利用濾紙法從煙草莖、葉片和土壤中篩選到10株對(duì)煙草野火病菌有拮抗作用的菌株，其中16SF34的抑菌圈直徑達(dá)到了7.25 mm。蔡訓(xùn)輝通過平板紙碟法發(fā)現(xiàn)了10株對(duì)煙草野火病有拮抗作用的菌株，其中最大的抑菌圈直徑達(dá)到了0.73 cm，被鑒定為芽孢桿菌屬。劉天波等[35]從健康煙草葉片上分離到對(duì)煙草野火病菌有較好抑制作用的3種拮抗菌群，包括寡養(yǎng)單胞菌、假單胞菌和芽孢桿菌，田間防治效果均在50%以上，其中芽孢桿菌的防治效果顯著優(yōu)于化學(xué)藥劑。眾多學(xué)者逐漸地意識(shí)到生物資源對(duì)煙草野火病防治有著明顯的效果，尤其是將生物菌劑和化學(xué)藥劑進(jìn)行復(fù)配使用，能夠揚(yáng)長避短，防治效果較好，可提高烤煙的質(zhì)量，增加經(jīng)濟(jì)效益。

6 展望

煙草野火病已成為全國性煙草病害，已經(jīng)上升為煙草生產(chǎn)上的重要病害之一。煙草野火病的田間發(fā)病癥狀與角斑病、真菌性赤星病等病害相似，容易混淆，因而要系統(tǒng)地掌握煙草野火病的鑒定方法，并對(duì)各煙區(qū)煙草野火病菌的生理小種進(jìn)行劃分，以期為煙草抗病品種的選育提供指導(dǎo)?；瘜W(xué)藥劑防治煙草野火病成為控制該病害流行的重要手段，但長期使用化學(xué)藥劑會(huì)對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，導(dǎo)致煙株產(chǎn)生抗藥性，烤煙質(zhì)量變差，煙農(nóng)經(jīng)濟(jì)效益受到嚴(yán)重影響。近幾年來，綠色防控管理深入人心，須找到有利于環(huán)境、有利于煙株、有利于經(jīng)濟(jì)發(fā)展的防治方法。經(jīng)過科研人員的探索，假單胞菌屬、芽孢桿菌屬等在病害防治方面的應(yīng)用也取得了一定的成果，為后人指明了方向。目前，芽孢桿菌在生物防治方面的應(yīng)用較多，這是由于它產(chǎn)生的芽孢具有耐高溫、耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿、耐紫外線、耐藥性等特性，能適應(yīng)不良環(huán)境而得到研究人員的青睞。未來，我們要更重視生物種質(zhì)資源的探索，為煙草野火病的防治提供更有效的方法。