董佳妮 趙龍山 薄彧坤 楊丹 楊雪苗 譚誼萌 安明 鄔國棟

關鍵詞天然低共熔溶劑;肉蓯蓉;苯乙醇苷類成分;響應曲面法;遺傳算法;抗氧化活性;提取效率

肉蓯蓉為列當科植物肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma 或管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight的干燥帶鱗葉的肉質，主產(chǎn)于內蒙古、新疆、寧夏和甘肅等地區(qū)，素有“沙漠人參”之美譽[1]。研究表明，苯乙醇苷類成分是肉蓯蓉的主要功能性成分，且其含量最高，具有抗氧化、抗病毒、保護神經(jīng)和保肝等作用[2]。其中，松果菊苷是文獻記載的首個，也是植物界具有代表性的苯乙醇苷類成分，同時其也是肉蓯蓉中主要的指標性成分[3]。支雅婧等[4]從化學成分特有性、可測性、傳統(tǒng)功效和藥性等方面進行預測，指出毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷和松果菊苷可作為肉蓯蓉的質量標志物。

目前，針對肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分提取的研究大多采用50%甲醇為溶劑，具有毒性大、易揮發(fā)、易造成環(huán)境污染及提取效率低等缺點[5-6]。Abbott 等[7]于2003 年首次發(fā)現(xiàn)一種可替代傳統(tǒng)溶劑和離子液體的新型綠色低共熔溶劑（deep eutectic solvents，DESs），其具有低蒸汽壓、低成本、良好的生物降解性和生物相容性等優(yōu)點。隨著研究的深入，Choi 等[8]又發(fā)現(xiàn)了DESs 的類似物——天然低共熔溶劑（natural deep eutectic solvents，NADESs）。與DESs 相比，NADESs 的組成成分均為天然化合物或生物體初級代謝產(chǎn)物，因此，其經(jīng)濟性和環(huán)境保護作用均優(yōu)于DESs，已作為一種綠色可調節(jié)的提取介質應用于藥物活性成分的提取中[9]。

響應曲面法（response surface methodology，RSM）是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，被廣泛用于多因素的實驗優(yōu)化。箱式組合設計（Box-Behnken Design，BBD）是RSM中最常用的實驗設計方案，具有實驗次數(shù)少、簡單和經(jīng)濟的優(yōu)點[10]。遺傳算法（genetic algorithm，GA）具有全局尋優(yōu)的特點，能取得較好的優(yōu)化和預測效果，在生物活性物質提取方面具有很大潛力[11]。鑒于此，本研究擬采用RSM結合GA優(yōu)化NADESs 提取肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分（松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷）的工藝，以期為肉蓯蓉的綠色提取和高值化利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Thermo U3000 型高效液相色譜儀、Multiskan GO 型酶標儀（美國Thermo FisherScientific 公司），BSA224S-CW型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司），TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司），KQ-500E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

肉蓯蓉藥材（批號190802003）購自內蒙古聚誠中藥飲片有限公司，由包頭醫(yī)學院藥學院安明教授鑒定為肉蓯蓉C. deserticola Y.C.Ma 的干燥帶鱗葉的肉質。將其干燥，粉碎（過四號篩），備用。

松果菊苷對照品（批號AF20051710，純度98%）、毛蕊花糖苷對照品（批號AF20110904，純度98%）、異毛蕊花糖苷對照品（批號AF20051701，純度98%）均購自成都埃法生物技術有限公司;1，3- 丁二醇（批號C11230698，純度99%）購自上海麥克林生化科技有限公司;氯化膽堿（批號RH221064，純度98%）、1，3-丙二醇（批號RH210167，純度98%）、1，4- 丁二醇（批號RH273071，純度99%）、丙二酸（批號RH246485，純度99.5%）、DL-蘋果酸（批號RH246485，純度99.5%）、硫酸亞鐵（批號RH246512，純度98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）（ 批號RH207202，純度≥98.5%）均購自上海易恩化學技術有限公司;維生素C（vitamin C，VC）（批號20210525，純度≥99.7%）購自天津市鼎盛鑫化工有限公司;尿素（批號20190410，純度≥99%）、葡萄糖（批號20190529，純度≥99%）均購自天津市凱通化學試劑有限公司;乳酸（批號980826，純度90%）購自天津市化學試劑一廠;乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷含量測定

采用高效液相色譜法進行測定。色譜條件：采用Supersil ODS2（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～9min，90%B→83%B;9～18 min，83%B→80%B;18～30min，80%B）;流速為1.0 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測器為紫外檢測器;檢測波長為330 nm;進樣量為10 μL。按照2020 年版《中國藥典》（四部）“9101 分析方法驗證指導原則”進行方法學考察[12]，結果均滿足要求。

2.2 NADESs的篩選

2.2.1 不同組成NADESs 的制備根據(jù)文獻[13]方法，分別以氯化膽堿、多元醇和有機酸等為原料，以水為溶劑，制備11 種NAEDSs（表1），具體方法為：按照組成成分摩爾比將原料置于各自錐形瓶中，在80 ℃下加熱攪拌，直至形成均勻透明的液體，冷卻至室溫后備用。

2.2.2 樣品溶液的制備及提取效率的計算取肉蓯蓉粉末0.3 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，分別加入不同組成的NADESs 及傳統(tǒng)溶劑（50%甲醇，對照）適量，混勻后在一定溫度下超聲（功率為500 W，頻率為40kHz）提取一定時間，冷卻至室溫后，以5 000 r/min 離心10 min，取上清液，用水稀釋4 倍，然后過0.45 μm濾膜，收集濾液，即得樣品溶液。按“2.1”項下方法測定各樣品溶液中松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的含量，并計算各成分的提取效率：提取效率（%）=（C×V×N/M×1 000）×100%。式中，C為樣品中被測物質的質量濃度（mg/mL），V 為樣品溶液的體積（mL），N為稀釋倍數(shù)，M為肉蓯蓉粉末的質量（g）。

2.2.3 最佳NADESs 的篩選NADESs 的組成成分會影響其理化性質，如極性、黏度、溶解度及表面張力等，從而決定其對目標成分的提取效率[14]。因此，本研究以松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的總提取效率為考察指標篩選NADESs。結果顯示，除NADES-7 和NADES-8 外，其余NADESs對目標成分的提取效率均優(yōu)于50%甲醇。其中，以1，4-丁二醇和丙二酸為原料合成的NADES-11 對松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的總提取效率達到最大值。因此，本研究選擇NADES-11 作為最佳提取溶劑。結果見圖1。

2.3 單因素實驗優(yōu)化提取工藝

在肉蓯蓉提取的過程中，NADESs 組成成分的摩爾比、NADESs 含水量和液料比等因素對提取效率有著重要影響[15-16]。因此，本工藝優(yōu)化實驗中，筆者選擇NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比、NADES-11含水量、液料比、提取時間和提取溫度為因素進行考察。

2.3.1 NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比固定NADES-11 含水量為30%、液料比為15 mL/g、提取溫度為30 ℃、提取時間為40 min，考察不同比例1，4-丁二醇和丙二酸（摩爾比1 ∶ 1、1 ∶ 2、1 ∶ 3、1 ∶ 4、1 ∶ 5）組成的NADES-11 對提取效率的影響，結果見圖2A。如圖2A所示，當NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比為1 ∶2 時，松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的總提取效率達到最大值。因此，本實驗確定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比為1 ∶2。

2.3.2 NADES-11 含水量固定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比為1 ∶2、液料比為15 mL/g、提取溫度為30 ℃、提取時間為40 min，考察不同含水量（10%、20%、30%、40%、50%）的NADES-11 對提取效率的影響，結果見圖2B。如圖2B所示，當NADES-11 含水量為20%時，松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的總提取效率達到最大值。因此，本實驗確定NADES-11 的含水量為20%。

2.3.3 液料比固定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比為1 ∶2、提取溫度為30 ℃、NADES-11 含水量為20%、提取時間為40 min，考察不同液料比（10、20、30、40、50 mL/g）對提取效率的影響，結果見圖2C。如圖2C所示，當液料比為30 mL/g 時，松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的總提取效率達到最大值。因此，本實驗確定液料比為30 mL/g。

2.3.4 提取時間固定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比為1 ∶2、提取溫度為30 ℃、NADES-11 含水量為20%、液料比為30 mL/g，考察不同提取時間（20、30、40、50、60 min）對提取效率的影響，結果見圖2D。如圖2D所示，當提取時間為30 min 時，松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的總提取效率達到最大值。因此，本實驗確定提取時間為30 min。

2.3.5 提取溫度固定NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比為1 ∶2、提取時間為30 min、NADES-11 含水量為20%、液料比為30 mL/g，考察不同提取溫度（30、40、50、60、70 ℃）對提取效率的影響，結果見圖2E。如圖2E所示，不同提取溫度對松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取效率影響差別不大。因此，本研究從降低能耗的角度考慮，選擇在30 ℃下進行樣品提取。

2.4 BBD實驗聯(lián)合GA優(yōu)化提取工藝

2.4.1 BBD實驗設計及結果本研究在單因素實驗基礎上，選擇對松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷提取效率影響顯著的3 個因素——NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比（X1）、NADES-11 含水量（X2）和液料比（X3）為自變量，以肉蓯蓉中松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷總提取效率（Y）為響應值，使用DesignExpert 12.0 軟件設計3 因素3 水平的BBD實驗。BBD實驗的因素與水平見表2，實驗方案與結果見表3。

2.4.2 統(tǒng)計分析及模型擬合采用Design Expert 12.0軟件對表3的實驗數(shù)據(jù)進行多元線性回歸擬合，得到3種目標成分的二次多項回歸方程：Y=1.221 54+0.003 64X1+0.018 18X2 + 0.029 30X3 - 0.001 71X1X2 + 0.003 17X1X3 +0.000 06X2X3 - 0.013 38X12 - 0.000 43X22 - 0.000 64X32。同時，采用Design Expert 12.0軟件對表3的實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結果見表4。由表4 可知，模型回歸系數(shù)R2為0.993 1、Radj2為0.984 2，表明該模型相關度良好，且與實測值能較好地擬合;總模型P<0.000 1，表明此模型的建立顯著;此外，模型失擬項P>0.05，表明模型擬合良好。

2.4.3 響應面分析在響應曲面圖中，曲面坡度越陡，表明該因素影響越顯著;等高線圖的形狀反映了兩兩因素交互影響的強弱，橢圓形表示顯著，圓形表示不顯著[17]。運用Design Expert 12.0 軟件繪制各因素對目標成分總提取效率影響的響應曲面圖和等高線圖（圖3）。通過響應曲面圖可知，3 個響應曲面均為開口向下的凸性曲面，表明最佳提取條件均在設定的條件范圍內，且各因素對目標成分影響的強弱順序為：X3>X1>X2。通過等高線圖可知，X1與X2、X1與X3的交互影響較為顯著。

2.4.4 GA優(yōu)化及驗證實驗利用BBD 實驗所建立的模型作為GA的適應度函數(shù)，使用Matlab R2020b 軟件中的GA優(yōu)化工具箱進一步對實驗數(shù)據(jù)進行優(yōu)化。在迭代57 次后，最佳適應度與平均適應度均基本保持穩(wěn)定，表明總提取效率已達到最大值（圖4）。GA優(yōu)化求解的結果為：NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比1 ∶2.49、NADES-11 含水量18.11%、液料比29.74 mL/g，最佳適應度（目標成分的總提取效率）為1.83%。為便于操作，本研究將實驗條件修正為：NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比1 ∶2.5、NADES-11 含水量18%、液料比30 mL/g。按修正后的實驗條件進行3 次平行驗證實驗，得到3 種目標成分的總提取效率為（1.82 ±0.01）%，與預測值1.83%接近，表明優(yōu)化的工藝條件準確、可行。

2.5 NADES-11 與傳統(tǒng)溶劑的提取效果比較

2.5.1 提取效率的比較分別以NADES-11 為溶劑按“2.4.4”項下最優(yōu)條件和以2020 年版《中國藥典》（一部）肉蓯蓉項下傳統(tǒng)溶劑（50%甲醇）進行樣品提取[18]，比較兩者的提取效率。實驗重復3 次。采用SPSS 18.0 軟件中t 檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以x±s 表示，檢驗水準α=0.05。結果顯示，NADES-11 對松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取效率均顯著高于50%甲醇（P<0.05）。結果見圖5。

2.5.2 抗氧化活性的比較按“2.5.1”項下方法制備2 種樣品提取液，精密量取2 種樣品提取液0、25、50、100、150、200、500、1 000 μL，分別置于10 mL量瓶中，用水稀釋得質量濃度為0、0.08、0.17、0.33、0.50、0.67、1.67、3.34mg/mL 的供試品溶液。并制備相同質量濃度的VC 溶液，作為陽性對照檢測液。

（1）DPPH 自由基清除實驗。參考文獻報道的方法[19]，吸取100 μL NADES-11 提取物、50%甲醇提取物、VC溶液于96 孔板中，加入0.38 mmol/L DPPH 溶液100μL，混勻，室溫避光孵育30 min，然后采用酶標儀在517nm波長處檢測各溶液的吸光度（A）。同時，將供試品溶液+DPPH溶劑（無水乙醇）的檢測結果記為A0，樣品溶劑（水）+DPPH 溶液的檢測結果記為A1。計算各樣品對DPPH自由基的清除率：DPPH自由基清除率（%）=[1-（A-A0）/A1]×100%。每個質量濃度設置3 個復孔。采用SPSS 18.0 軟件計算各樣品對DPPH 自由基的半數(shù)清除濃度（IC50）及抗壞血酸當量（ascorbic acid equivalent antioxidantcapacity，AEAC）。結果顯示，在研究質量濃度范圍內，各樣品對DPPH自由基均有一定的清除活性，其強弱順序依次為VC>NADES-11 提取物>50%甲醇提取物。結果見表5。

（2）羥基自由基清除實驗。參考文獻報道的方法[20]，取7.5 mmol/L的鄰二氮菲20 μL、0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖液40 μL和樣品溶液30 μL于96 孔板中，混勻，再加入7.5 mmol/L 的FeSO4 溶液20 μL 和0.1%H2O2 溶液20 μL，在37 ℃下恒溫反應60 min，采用酶標儀在536nm波長處檢測A。同時，將樣品溶劑（水）代替樣品同法操作后所得結果記為A0;將樣品溶劑（水）代替樣品，同時以水代替0.1%H2O2同法操作后所得結果記為A1。計算各樣品對羥基自由基的清除率：羥基自由基清除率（%）=（A-A0）/（A1-A0）×100%。每個質量濃度設置3個復孔。按照“2.5.2（1）”項下方法計算各樣品對羥基自由基的IC50和AEAC。結果顯示，在研究質量濃度范圍內，各樣品對羥基自由基均有一定的清除活性，其強弱順序依次為VC>NADES-11 提取物>50%甲醇提取物。結果見表5。

3 討論

NADESs作為一種新型的綠色可調節(jié)溶劑，與傳統(tǒng)溶劑相比，具有較高的提取效率及良好的生物降解性、生物相容性、穩(wěn)定性和可回收性等優(yōu)點[21]。Dai 等[22]研究表明，與水和40%乙醇相比，NADESs 提高了紅花中酚類物質在高溫、光照和長期放置等條件下的穩(wěn)定性。熊蘇慧等[23]對以NADESs為溶劑得到的玉竹總黃酮提取液進行純化回收，發(fā)現(xiàn)NADESs 可被回收再次利用，且回收后的NADESs 再次用于提取時也取得了較好的提取效率（回收利用率為94.56%）。并且，NADESs的組成成分在自然界中大量存在，具有成本低和生物可再生的特性。此外，NADESs 由天然的初級代謝物組成，被認為是低毒或無毒的環(huán)境友好型提取溶劑，可以直接納入藥物、食品等配方中，不需額外進行純化[24-25]。故本研究使用NADESs 代替有機溶劑用于肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分的提取，具有科學性和可行性。

本研究結果顯示，不同組成的NADESs 對松果菊苷、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的提取效率不同，筆者認為主要是黏度不同導致的——黏度較低的NADESs有利于目標成分的擴散。因此，在NADES-11 含水量的考察中，隨著其含水量的增加，黏度降低，目標成分提取效率也隨之升高;然而當含水量大于20%時，目標成分提取效率呈降低趨勢，這可能是由于過多的水會破壞NADES-11 的氫鍵網(wǎng)絡并改變其極性。隨著液料比的增加及提取時間的延長，目標成分的總提取效率均呈先升高后降低的趨勢。合適的液料比有助于溶質中目標成分向溶劑擴散。過短的提取時間不足以破碎藥物細胞壁，過長的提取時間則會使目標化合物發(fā)生降解。在單因素實驗基礎上，經(jīng)BBD實驗聯(lián)合GA優(yōu)化并進行修正后得NADES-11 的最佳工藝條件為：NADES-11 中1，4-丁二醇和丙二酸的摩爾比1 ∶ 2.5、NADES-11 含水量18% 、液料比30 mL/g、提取時間30 min、提取溫度30 ℃。經(jīng)驗證，目標成分總提取效率的實測值（1.82%）與預測值（1.83%）接近，表明模型優(yōu)化工藝條件準確、可行。

綜上所述，本研究以優(yōu)化的NADESs 為提取溶劑，提取肉蓯蓉中苯乙醇苷類成分的工藝穩(wěn)定、可行，符合天然產(chǎn)物綠色提取的理念。但是，由于藥物處理量的大小懸殊，實驗室和工業(yè)生產(chǎn)之間的差別較大，而本實驗樣品量較小，很難對NADESs工業(yè)提取中的許多因素進行充分考察。因此，本提取工藝若要應用于工業(yè)大生產(chǎn)，還應該經(jīng)過實驗室放大、中試和工業(yè)放大的數(shù)據(jù)驗證。