石路瑩 段靜雅 張繼花 李燦宇

【摘要】 目的：探究環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、分泌型卷曲相關(guān)蛋白4（secreted frizzled-related protein 4，SFRP4）和WW域結(jié)合蛋白2（WW-domain binding protein 2，WBP2）在子宮腺肌病中的表達(dá)及其與子宮腺肌病臨床特征的關(guān)系。方法：選取2019年1月-2020年6月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院確診子宮腺肌病并進(jìn)行手術(shù)切除子宮的患者40例，收集40例患者的異位內(nèi)膜標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)患者的痛經(jīng)、月經(jīng)量及子宮大小等臨床資料。采用免疫組化SP法分別檢測COX-2、SFRP4和WBP2在子宮腺肌病異位病灶中的表達(dá)，分析其相互關(guān)系及其與子宮腺肌病臨床特征的關(guān)系。結(jié)果：COX-2和SFRP4的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.533，P<0.01），COX-2和WBP2的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.544，P<0.01），WBP2和SFRP4的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.574，P<0.01）。無或輕度痛經(jīng)及中度痛經(jīng)組與重度痛經(jīng)組COX-2和SFRP4低表達(dá)與高表達(dá)分布情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而兩組WBP2低表達(dá)與高表達(dá)分布情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。子宮體積正常組與子宮體積增大組COX-2、SFRP4及WBP2低表達(dá)與高表達(dá)分布情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。月經(jīng)量正常組與月經(jīng)量增大組COX-2、SFRP4及WBP2低表達(dá)與高表達(dá)分布情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

結(jié)論：COX-2、SFRP4和WBP2可能參與了子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展，COX-2可作為治療子宮腺肌病潛在的分子靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 子宮腺肌病 COX-2 SFRP4 WBP2 免疫組化 痛經(jīng)

Expressions of COX-2， SFRP4 and WBP2 in Adenomyosis and Their Correlations with Clinical Features/SHI Luying， DUAN Jingya， ZHANG Jihua， LI Canyu. //Medical Innovation of China， 2022， 19（13）： 00-007

[Abstract] Objective： To explore the expressions of cyclooxygenase-2 （COX-2）， secreted frizzled-related protein 4 （SFRP4） and WW-domain binding protein 2 （WBP2） in adenomyosis and their correlations with the clinical features of adenomyosis. Method： A total of 40 patients who were diagnosed with adenomyosis by pathology and underwent hysterectomy in the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University from January 2019 to June 2020 were selected. The ectopic endometrium specimens of the 40 patients were collected， and the clinical data of dysmenorrhea， menstrual volume and uterine size were collected. The expressions of COX-2，

SFRP4 and WBP2 in ectopic lesions of adenomyosis were detected by immunohistochemical SP method. The relationships between COX-2， SFRP4 and WBP2 and their relationships with the clinical characteristics of adenomyosis were analyzed. Result： The expression of COX-2 and SFRP4 was positively correlated （rs=0.533， P&lt;0.01）， the expression of COX-2 and WBP2 was positively correlated （rs=0.544， P<0.01）， and the expression of WBP2 and SFRP4 was positively correlated （rs=0.574， P<0.01）. There were significant differences in the distributions of low expression and high expression of COX-2 and SFRP4 between no or mild dysmenorrhea and moderate dysmenorrhea group and severe dysmenorrhea group （P<0.05）， but there was no significant difference in the distribution of low expression and high expression of WBP2 between the two groups （P>0.05）. There were no significant differences in the distributions of low expression and high expression of COX-2， SFRP4 and WBP2 between normal uterine volume group and increased uterine volume group （P>0.05）. There were no significant differences in the distributions of low expression and high expression of COX-2， SFRP4 and WBP2 between normal menstrual volume group and increased menstrual volume group （P>0.05）. Conclusion： COX-2， SFRP4 and WBP2 may be involved in the occurrence and development of adenomyosis， COX-2 can be used as a potential target for the treatment of adenomyosis.

[Key words] Adenomyosis COX-2 SFRP4 WBP2 Immunohistochemistry Dysmenorrhea

First-author’s address： The Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.13.001

子宮腺肌?。╝denomyosis，AM）是指子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)侵入子宮肌層，異位子宮內(nèi)膜組織引起周圍肌纖維增生及肥大[1]，引起彌漫性或局限性病變的疾病。絕大多數(shù)患者會出現(xiàn)繼發(fā)性痛經(jīng)、慢性盆腔痛、月經(jīng)量過大及繼發(fā)性不孕等癥狀[2]，嚴(yán)重影響患者的身心健康。子宮腺肌病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，組織損傷及子宮內(nèi)膜內(nèi)陷及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能是子宮腺肌病的重要發(fā)病機(jī)制[3]。文獻(xiàn)[4]表明，與無子宮腺肌病的正常子宮內(nèi)膜相比，子宮腺肌病在位和異位內(nèi)膜細(xì)胞中β-catenin的蛋白水平更高，Wnt/β-catenin通路參與了子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展過程[5-6]，而Wnt/β-catenin信號通路的失調(diào)對促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生發(fā)揮重要作用[7-8]。在癌癥組織中，抑制環(huán)氧化酶-2（COX-2）的表達(dá)后Wnt/β-catenin信號通路的激活受到抑制，抑制COX-2后癌癥細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移也可受到顯著抑制[9]。COX-2在子宮腺肌病異位內(nèi)膜中呈高表達(dá)[10]，COX-2的表達(dá)可顯著影響子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展及痛經(jīng)的發(fā)生[11-12]，但COX-2參與子宮腺肌病發(fā)展的具體機(jī)制尚不清楚。WW域結(jié)合蛋白2（WBP2）是一種新興的腫瘤相關(guān)因子，在癌癥組織中，WBP2的高表達(dá)被證實(shí)是激活Wnt/β-catenin通路的潛在因子[13-14]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白4（SFRP4）是Wnt/β-catenin經(jīng)典信號通路的抑制劑[15]，SFRP4的高表達(dá)可明顯抑制Wnt/β-catenin通路的激活。SFRP4與WBP2在子宮腺肌病組織中的表達(dá)尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究檢測了COX-2、SFRP4與WBP2在子宮腺肌病異位病灶中的表達(dá)及其相關(guān)性，進(jìn)而探究各因子參與子宮腺肌病發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制，為子宮腺肌病的診斷及早期預(yù)測尋找分子靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月-2020年6月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院經(jīng)病理證實(shí)為子宮腺肌病且行手術(shù)治療的患者40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：絕經(jīng)前女性;所有病例均經(jīng)病理診斷為子宮腺肌病;所有患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前3個月使用激素類藥物;合并內(nèi)分泌疾病、惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病等;合并卵巢囊腫、子宮內(nèi)膜異位癥等雌激素依賴性子宮內(nèi)膜相關(guān)性疾病。40例患者年齡39～55歲，平均（47.15±4.19）歲。將40例子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織分為增生期25例，分泌期15例;無或輕度痛經(jīng)及中度痛經(jīng)31例，重度痛經(jīng)9例;月經(jīng)量正常12例，月經(jīng)量增大28例;子宮體積正常27例，子宮體積增大13例。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本 術(shù)中取AM 患者異位內(nèi)膜組織立即放入10%的福爾馬林中固定，脫水、石蠟包埋，蠟塊常溫保存。蠟塊切片待測，切片厚度4 mm。

1.2.2 免疫組化檢測 采用免疫組織化學(xué)SP法測定AM異位內(nèi)膜組織中COX-2、SFRP4和WBP2的 表 達(dá) 情 況。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒中提供的說明書進(jìn)行，使用0.01 mmol/L的枸櫞酸鈉（pH=6.0）緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，使用一抗稀釋液將一抗進(jìn)行稀釋，COX-2、SFRP4和WBP2稀釋濃度分別為1︰50、1︰400和1︰100。PBS代替一抗孵育作為陰性對照，陽性對照由武漢三鷹抗體公司提供。COX-2、SFRP4和WBP2一抗均來自武漢三鷹公司。

1.2.3 免疫組化結(jié)果判定 用低倍和高倍鏡觀察切片，結(jié)果均由兩位高年資病理醫(yī)師在雙盲條件下獨(dú)立判定。隨機(jī)選取10個 高倍視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比：<1%計(jì)為0分;1%～25%計(jì)為1分;26%～50%計(jì)為2分;51%～75%計(jì)為3分;>75%計(jì)為4分。染色強(qiáng)度判斷：0分為無著色，1分為淺棕黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。將陽性細(xì)胞百分比評分與染色強(qiáng)度評分相乘即為免疫組化最終評分。最終根據(jù)兩者的乘積將染色情況分為4級，0分為陰性（-）;1～4分為弱陽性（+）;5～8分為陽性（++）;9～12分為強(qiáng)陽性（+++），陰性及弱陽性為低表達(dá)，陽性及強(qiáng)陽性為高表達(dá)。

1.2.4 痛經(jīng)、月經(jīng)量及子宮大小評估 使用視覺模擬評分（VAS）評估患者痛經(jīng)程度，VAS評分分為四個級別：無痛經(jīng)（0分）、輕度痛經(jīng)（1～3分）、中度痛經(jīng)（4～6分）和重度痛經(jīng)（7～10分）。月經(jīng)量使用月經(jīng)失血圖（PBAC）進(jìn)行評估，收集患者使用后的衛(wèi)生巾，根據(jù)每張衛(wèi)生巾的血染程度進(jìn)行評分：輕度，血染面積占衛(wèi)生巾的1/3以下，計(jì)1分;中度，血染面積占衛(wèi)生巾的1/3～3/5，計(jì)5分;重度，血染面積基本為整個衛(wèi)生巾，計(jì)20分。遺失血塊<1元硬幣，計(jì)1分;≥1元硬幣，計(jì)5分。評估整個經(jīng)期的月經(jīng)量，評分>100分為月經(jīng)量≥80 mL，可診斷為月經(jīng)失血量增大[16]。由本院高年資超聲科醫(yī)生使用經(jīng)陰道三維超聲進(jìn)行子宮體積的測量，測出子宮長、寬和高。子宮體積=長度（cm）×寬度（cm）×高度（cm）×0.523，大于350 cm3為子宮增大[17]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù) 據(jù)，計(jì)量資料采用M（P25，P75）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，采用Man-Whitney秩和檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)分析COX-2、SFRP4和WBP2表達(dá)的相關(guān)性。采用字2檢驗(yàn)分別分析COX-2、SFRP4、WBP2表達(dá)與患者的臨床資料的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測COX-2、WBP2和SFRP4蛋白的表達(dá) COX-2、SFRP4和WBP2在增生期、分泌期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。COX-2、WBP2和SFRP4均在子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中的腺體細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)中特異性表達(dá)，子宮肌層無明顯表達(dá)，見圖1。在子宮腺肌病異位內(nèi)膜病灶中，COX-2和SFRP4的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.533，P<0.01），COX-2和WBP2的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.544，P<0.01），WBP2和SFRP4的表達(dá)呈正相關(guān)（rs=0.574，P<0.01），見圖2。

2.2 COX-2、SFRP4和WBP2在異位內(nèi)膜中的表達(dá)與痛經(jīng)程度、月經(jīng)量和子宮體積的關(guān)系 無或輕度痛經(jīng)及中度痛經(jīng)組與重度痛經(jīng)組COX-2和SFRP4低表達(dá)與高表達(dá)分布情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而兩組WBP2低表達(dá)與高表達(dá)分布情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。子宮體積正常組與子宮體積增大組COX-2、SFRP4及WBP2低表達(dá)與高表達(dá)分布情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。月經(jīng)量正常組與月經(jīng)量增大組COX-2、SFRP4及WBP2低表達(dá)與高表達(dá)分布情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

子宮腺肌病的發(fā)病機(jī)制尚不明確，組織損傷和子宮內(nèi)膜內(nèi)陷及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化為兩種重要的發(fā)病機(jī)制假說。類固醇激素表達(dá)異常、慢性炎癥、神經(jīng)血管生成、細(xì)胞異常增殖等也參與了子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展[18]。COX-2在正常組織中表達(dá)極少，但當(dāng)組織受到損傷或炎癥刺激時，COX-2在組織中的表達(dá)可明顯升高。COX-2在癌癥組織中參與了慢性炎癥的發(fā)生及細(xì)胞的侵襲[19-20]，且與癌癥的預(yù)后顯著相關(guān)。COX-2在子宮腺肌病異位子宮內(nèi)膜中的表達(dá)較正常子宮內(nèi)膜明顯升高[21]，且COX-2在子宮腺肌病中的過度表達(dá)影響了血管的生成、炎癥的浸潤及神經(jīng)元的分布[22-23]，本課題組前期研究表明，抑制COX-2的表達(dá)可明顯減少子宮腺肌病異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的侵襲和浸潤[24]，表明COX-2可能參與了子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展。本研究表明，在子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中，COX-2和WBP2的表達(dá)呈正相關(guān)。WBP2為激活Wnt/β-catenin信號通路的潛在因子[13-14]，而Wnt/β-catenin信號通路是促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的重要通路[7-8]，且COX-2的表達(dá)也可影響Wnt/β-catenin信號通路的表達(dá)[9]。因此，在子宮腺肌病異位內(nèi)膜中，COX-2可能與WBP2相互作用進(jìn)而參與子宮腺肌病的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。COX-2為花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素的限速酶，前列腺素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）是重要的致痛因子，前列腺素的過度表達(dá)可促進(jìn)痛經(jīng)癥狀的發(fā)生，有研究表明，COX-2在子宮腺肌病異位內(nèi)膜的腺體細(xì)胞中顯著高表達(dá)，且COX-2的過度表達(dá)與子宮腺肌病繼發(fā)性痛經(jīng)癥狀有顯著相關(guān)性[25]。本研究也顯示，COX-2在異位內(nèi)膜中的表達(dá)與痛經(jīng)的嚴(yán)重程度之間存在明顯相關(guān)性。COX-2可能通過產(chǎn)生前列腺素進(jìn)而影響子宮腺肌病痛經(jīng)癥狀的發(fā)生，并通過影響Wnt/β-catenin信號通路的激活參與子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展。

SFRP4為Wnt信號通路的拮抗劑[26-27]，SFRP4的表達(dá)可抑制Wnt/β-catenin信號通路的異常激活。Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與子宮腺肌病的發(fā)生密切相關(guān)[4，28]。SFRP4因子的高表達(dá)在多種癌癥組織中被驗(yàn)證，在肝癌細(xì)胞中，SFRP4的表達(dá)可明顯抑制癌癥細(xì)胞的Wnt/β-catenin信號通路的激活，且SFRP4的甲基化可使SFRP4失去原有功能[29]。在結(jié)直腸癌組織和食管癌組織中，SFPR4的甲基化明顯增高[30-31]，SFRP4的甲基化減少了對Wnt/β-catenin信號通路的抑制，進(jìn)而促進(jìn)了癌癥的發(fā)生。但文獻(xiàn)[32]認(rèn)為，在癌癥組織中SFRP4可能沒有參與抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，而是由癌癥間質(zhì)細(xì)胞生成并參與了癌癥細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。因而SFRP4在癌癥組織中的表達(dá)不止通過調(diào)節(jié)Wnt信號通路，還可能參與其他機(jī)制調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，SFRP4在子宮腺肌病異位內(nèi)膜腺體的胞質(zhì)與胞膜中特異性高表達(dá)，且SFRP4的表達(dá)與COX-2和痛經(jīng)均有顯著相關(guān)性。COX-2的表達(dá)與子宮腺肌病痛經(jīng)具有明顯相關(guān)，且COX-2與異位內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[24]，在子宮腺肌病異位內(nèi)膜中，SFRP4可能不是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的表達(dá)參與子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展，而是通過其他機(jī)制與COX-2相互作用進(jìn)而促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而參與子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展，SFRP4在異位內(nèi)膜中也可能受到甲基化的調(diào)節(jié)進(jìn)而失活，因而減少了對Wnt/β-catenin信號通路的抑制，從而促進(jìn)了子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展，其具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

子宮腺肌病雖是良性病變，但存在一些惡性腫瘤的特點(diǎn)，如血管生成、間質(zhì)浸潤等。WBP2是一種新興的腫瘤相關(guān)蛋白，其在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，是乳腺癌中的雌激素受體（estrogen receptor，ER）和Wnt/β-catenin信號通路的潛在激活因子[33-34]，且與乳腺癌的預(yù)后顯著相關(guān)。WBP2可能是通過調(diào)節(jié)β-catenin的表達(dá)進(jìn)而參與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路[35]。而WBP2在乳腺癌中以雌激素依賴性方式調(diào)節(jié)ER的表達(dá)[36]。ER的高表達(dá)和Wnt信號通路的異常激活是子宮腺肌病發(fā)病的重要影響因素[6]。COX-2的表達(dá)也可促進(jìn)子宮腺肌病中雌激素的上調(diào)[37]，且大量雌激素可促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）的發(fā)生[38]。本研究表明，WBP2在子宮腺肌病異位內(nèi)膜組織中的表達(dá)與COX-2呈正相關(guān)，因而本研究推測，在子宮腺肌病組織中，WBP2與COX-2可能相互作用并參與Wnt/β-catenin信號通路的表達(dá)進(jìn)而參與子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展，其具體機(jī)制需進(jìn)一步探究。

本研究也表明，COX-2、SFRP4和WBP2的表達(dá)與子宮腺肌病的月經(jīng)量和子宮大小均無顯著相關(guān)性。子宮腺肌病的發(fā)生為一個復(fù)雜的過程，其中涉及了神經(jīng)和血管的生成、慢性炎癥的存在和細(xì)胞異常增殖凋亡等過程[18]。COX-2、SFRP4和WBP2的表達(dá)可能促進(jìn)子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展，但COX-2、SFRP4和WBP2可能在疾病的早期參與子宮腺肌病的發(fā)生，而子宮腺肌病患者的月經(jīng)量增多及子宮體積的增大則為子宮腺肌病發(fā)展到一定程度后發(fā)生的后期事件，因而COX-2、SFRP4和WBP2的表達(dá)與子宮腺肌病的月經(jīng)量及體積無明顯相關(guān)性。

綜上所述，COX-2、SFRP4和WBP2可能參與了子宮腺肌病的發(fā)生，而COX-2和SFRP4的表達(dá)與子宮腺肌病的痛經(jīng)癥狀顯著相關(guān)，COX-2可能是治療子宮腺肌病的一個潛在的分子靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2022-01-24） （本文編輯：占匯娟）