陳曼，彭三鳳，林虹，李志凌

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，汕頭 515041)

隨著體外受精-胚胎移植(IVF-ET)及其衍生技術(shù)的快速發(fā)展，胚胎種植率及臨床妊娠率顯著提高的同時(shí)，多胎妊娠也相應(yīng)增多。由于移植多枚胚胎，IVF-ET妊娠的雙胎率遠(yuǎn)高于自然妊娠，并且剖宮產(chǎn)、低出生體重、早產(chǎn)、妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓疾病、子癇前期和子癇、難產(chǎn)和產(chǎn)后出血等產(chǎn)科并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)亦增加，且隨著孕婦年齡增大該增加趨勢(shì)越明顯[1]。IVF-ET治療的理想結(jié)局是獲得單胎、足月、健康的胎兒，盡量減少多胎妊娠風(fēng)險(xiǎn)及相關(guān)的產(chǎn)科并發(fā)癥，因此選擇性單胚胎移植(eSET)是實(shí)現(xiàn)此目標(biāo)的有效措施。有研究表明，與雙胚胎移植(DET)相比，eSET足月單胎活產(chǎn)率更高[2]，而來(lái)自DET分娩的單胎發(fā)生不良圍產(chǎn)結(jié)局的可能性亦增加[3]。為了降低ART的多胎率，更好地保障母嬰安全，《關(guān)于胚胎移植數(shù)目的中國(guó)專家共識(shí)》[4]提出了eSET策略，但是部分生殖中心的多胎率仍高達(dá)30%以上。eSET對(duì)臨床妊娠率的影響是阻礙其大范圍推廣的原因之一。如何進(jìn)一步細(xì)化eSET策略，在臨床妊娠率及多胎率之間維持平衡，是目前大多數(shù)生殖中心的重點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究回顧性分析了eSET在凍融胚胎移植(FET)中的應(yīng)用效果，以期為進(jìn)一步推廣、細(xì)化eSET的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象及分組

回顧性分析2020年1月至2021年12月在汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科行FET助孕治療的1 233個(gè)周期的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<40歲；(2)接受IVF或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕治療，有凍存胚胎且胚胎成功解凍復(fù)蘇的患者；(3)囊胚移植均為單囊胚移植(SBT)周期，囊胚級(jí)別3BB及以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥40歲；(2)移植胚胎數(shù)≥3枚；(3)序貫移植周期；(4)移植含多核、空泡、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(SER)胚胎(含SER胚胎指SER聚集的卵母細(xì)胞形成的胚胎)的周期。

將納入研究對(duì)象根據(jù)移植次數(shù)不同分組：第1次移植為1次組，第2次移植為2次組，≥3次移植為多次組；根據(jù)患者年齡不同分為<33歲組、≥33歲組。各組內(nèi)再根據(jù)移植胚胎類型、質(zhì)量及數(shù)量細(xì)分為下列亞組：D5單囊胚移植組(SBT-D5組)，D6單囊胚移植組(SBT-D6組)，移植1枚D3優(yōu)質(zhì)胚胎組(SET-D3優(yōu)組)，移植2枚D3優(yōu)質(zhì)胚胎組(DET-D3優(yōu)組)，移植1枚D3優(yōu)質(zhì)胚胎+1枚D3非優(yōu)質(zhì)胚胎組(DET-D3組)。

二、研究方法

1.控制性促排卵(COS)及胚胎處理：根據(jù)患者基本情況選擇不同的COS方案，包括短效長(zhǎng)方案、卵泡期長(zhǎng)方案、拮抗劑方案和黃體期促排卵方案。根據(jù)取卵日男方精液情況進(jìn)行常規(guī)IVF或ICSI，受精卵置于37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；取卵后第3天或第5天根據(jù)COS方案、卵巢過(guò)度刺激綜合征(OHSS)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、內(nèi)膜情況等行胚胎移植或全胚冷凍。常規(guī)冷凍2～4枚卵裂期胚胎，優(yōu)先冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎，其余胚胎行囊胚培養(yǎng)。所有胚胎均采用玻璃化冷凍法，試劑盒及冷凍載桿購(gòu)自日本加藤公司，具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。

2.胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：(1)D3優(yōu)胚標(biāo)準(zhǔn)：D1原核為2PN，D2細(xì)胞數(shù)為3～5細(xì)胞，D3細(xì)胞數(shù)為7～9細(xì)胞，D2發(fā)育至D3的細(xì)胞增速為3～5個(gè)細(xì)胞，D3胚胎評(píng)級(jí)為I級(jí)或Ⅱ級(jí)。(2)囊胚評(píng)級(jí)：按照Gardner提出的“囊胚擴(kuò)張程度-內(nèi)細(xì)胞團(tuán)-滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞”的評(píng)定模式[5]，進(jìn)行囊胚期胚胎評(píng)分。

3.FET策略：根據(jù)患者情況采用自然周期、促排卵周期、激素替代周期或降調(diào)后激素替代周期進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備，冷凍胚胎復(fù)蘇后培養(yǎng)2 h行FET，并行常規(guī)黃體支持。(1)囊胚移植：所有囊胚移植均為單胚胎移植，移植的囊胚級(jí)別均為3BB及以上，優(yōu)先選擇D5囊胚，其次為D6囊胚；在囊胚形成時(shí)間及級(jí)別相同的情況下，優(yōu)先選擇D3為優(yōu)胚的囊胚進(jìn)行移植；(2)卵裂期胚胎移植：對(duì)沒有3BB及以上級(jí)別囊胚凍存的患者，選擇卵裂期胚胎復(fù)蘇移植。如年齡<33歲，首次移植優(yōu)先選擇單優(yōu)胚移植；如首次SET未孕，再次移植酌情予DET；如年齡≥33歲，首次移植予DET。對(duì)于子宮因素不宜雙胎妊娠者，如疤痕子宮、子宮畸形或矯形手術(shù)后、子宮頸機(jī)能不全或既往有雙胎妊娠及流產(chǎn)、早產(chǎn)等不良孕產(chǎn)史者；存在某些全身狀況不適宜雙胎妊娠者，例如：存在其他合并癥，身高<150 cm，體重<40 kg等；上述情況患者，如存在反復(fù)著床失敗、高齡、胚胎質(zhì)量差等明顯影響成功率的因素，則在充分知情告知后謹(jǐn)慎進(jìn)行DET，如雙胎妊娠建議減胎。

卵裂期胚胎移植后14 d(囊胚移植后12 d)測(cè)定血β-HCG，如β-HCG<50 U/L，停黃體支持藥物，監(jiān)測(cè)β-HCG至陰性；如β-HCG≥50 U/L，確定為HCG陽(yáng)性，繼續(xù)給予黃體支持；胚胎移植后4～5周行第1次B超檢查，記錄孕囊數(shù)、胎心搏動(dòng)情況及胚胎著床部位。

4.主要觀察指標(biāo)及判斷標(biāo)準(zhǔn)：比較各亞組間患者的平均年齡、不孕年限、轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度、臨床妊娠率、胚胎種植率、多胎率及早期流產(chǎn)率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；胚胎種植率=孕囊數(shù)/總移植胚胎數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=孕12周內(nèi)自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；多胎率=多胎周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

超聲檢查可見孕囊或病理學(xué)檢查可見絨毛者為臨床妊娠；宮腔內(nèi)同時(shí)有兩個(gè)或兩個(gè)以上胎兒為多胎妊娠；發(fā)生在妊娠12周以前的流產(chǎn)為早期流產(chǎn)；受精卵在子宮腔以外著床為異位妊娠。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

本研究共納入1 233個(gè)FET周期，患者平均年齡為(31.16±3.77)歲(21～39歲)，平均不孕年限(3.92±2.48)年(1～14年)，平均移植次數(shù)(1.65±1.01)次，轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度為(10.17±2.09)mm，移植胚胎數(shù)(1.22±0.42)枚，整體臨床妊娠率為60.02%，胚胎著床率為53.45%，多胎率9.59%，流產(chǎn)率11.89%，異位妊娠率1.89%。

二、不同移植次數(shù)各組中不同移植方案亞組的一般資料及妊娠結(jié)局比較

1.各組患者一般資料比較：1次組中SBT-D5組、SBT-D6組和SET-D3優(yōu)組的平均年齡顯著低于DET-D3優(yōu)組和DET-D3組(P<0.05)；各亞組間平均不孕年限及轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度無(wú)顯著性差異(P>0.05)。2次組和多次組中各亞組間平均年齡、不孕年限及轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

2.各組患者妊娠結(jié)局比較：1次組中SBT-D5組的臨床妊娠率顯著高于SBT-D6、SET-D3優(yōu)、DET-D3優(yōu)組(P<0.05)，SBT-D5、SBT-D6組的胚胎種植率顯著高于SET-D3優(yōu)、DET-D3優(yōu)、DET-D3組(P<0.05)，SBT-D6組的早期流產(chǎn)率顯著高于SBT-D5和DET-D3優(yōu)組(P<0.05)，單卵裂胚/囊胚移植組的多胎率顯著低于DET-D3優(yōu)、DET-D3組(P<0.05)；2次組中SET-D3優(yōu)組的臨床妊娠率顯著低于SBT-D5、SBT-D6及DET-D3優(yōu)組(P<0.05)，SBT-D5、SBT-D6組的胚胎種植率顯著高于其他3組(P<0.05)，SBT-D6組的早期流產(chǎn)率顯著高于SBT-D5組(P<0.05)，單卵裂胚/囊胚移植組的多胎率顯著低于DET-D3優(yōu)、DET-D3組(P<0.05)；多次組中SET-D3優(yōu)、DET-D3組的臨床妊娠率顯著低于DET-D3優(yōu)組(P<0.05)，DET-D3組的胚胎種植率顯著低于其他各組(P<0.05)，SBT-D6組的早期流產(chǎn)率顯著高于DET-D3優(yōu)組(P<0.05)，單卵裂胚/囊胚移植組的多胎率顯著低于DET-D3優(yōu)、DET-D3組(P<0.05)(表2)。

表2 不同移植次數(shù)各組中不同移植方案亞組的妊娠結(jié)局比較(%)

三、不同年齡兩組中不同移植方案亞組的一般資料及妊娠結(jié)局比較

1.各組間一般資料比較：<33歲組中各亞組間平均年齡、不孕年限及轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度均無(wú)顯著性差異(P>0.05)?！?3歲組中SET-D3優(yōu)組的平均年齡顯著高于SBT-D5和SBT-D6組(P<0.05)，其余各亞組間不孕年限及轉(zhuǎn)化日內(nèi)膜厚度均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表3)。

2.各組間妊娠結(jié)局比較：<33歲組中，SBT-D5組的臨床妊娠率顯著高于SBT-D6和SET-D3優(yōu)組(P<0.05)，SBT-D5組的胚胎種植率顯著高于其余各組(P<0.05)，SBT-D6組的早期流產(chǎn)率顯著高于SBT-D5、DET-D3優(yōu)、DET-D3組(P<0.05)，單卵裂胚/囊胚移植組的多胎率顯著低于DET-D3優(yōu)、DET-D3組(P<0.05)；≥33歲組中，SET-D3優(yōu)組的臨床妊娠率顯著低于SBT-D5、SBT-D6、DET-D3優(yōu)組(P<0.05)，SBT-D5、SBT-D6組的胚胎種植率顯著高于其余3組(P<0.05)，單卵裂胚/囊胚移植組的多胎率顯著低于DET-D3優(yōu)、DET-D3組(P<0.05)(表4)。

表4 不同年齡兩組中不同移植方案亞組的妊娠結(jié)局比較(%)

討 論

本研究結(jié)果顯示，1次組中單胚胎移植組患者的平均年齡均顯著低于DET患者(P<0.05)，這與我院對(duì)年齡<33歲、首次移植患者優(yōu)先實(shí)行eSET策略有關(guān)。另外，本研究≥33歲組中SET-D3優(yōu)組的平均年齡顯著高于SBT-D5和SBT-D6組，這是由于隨著患者年齡增加、卵巢儲(chǔ)備功能下降，獲卵數(shù)和胚胎數(shù)都相應(yīng)減少，為了減少囊胚培養(yǎng)失敗導(dǎo)致的無(wú)胚胎移植風(fēng)險(xiǎn)，我院常規(guī)冷凍2～4枚卵裂期胚胎，優(yōu)先冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎，剩余胚胎再行囊胚培養(yǎng)；而這可能導(dǎo)致部分高齡患者僅有凍存卵裂期胚胎，因此在進(jìn)行FET時(shí)只能移植卵裂期胚胎。

eSET作為避免多胎妊娠的良好策略，面臨最大的問(wèn)題是臨床妊娠率降低，如能進(jìn)一步優(yōu)化eSET策略，在臨床妊娠率及多胎率之間維持平衡，將有利于eSET的普及推廣。本研究納入的研究對(duì)象中，大部分采用單卵裂胚/囊胚移植，整體臨床妊娠率為60.02%，且多胎率低于10%。eSET的關(guān)鍵因素在于胚胎質(zhì)量，選擇種植潛力好的胚胎可以縮短達(dá)到妊娠時(shí)間。目前，囊胚培養(yǎng)、時(shí)差監(jiān)測(cè)培養(yǎng)系統(tǒng)(TLM)、胚胎植入前遺傳學(xué)篩查(PGS)和代謝組學(xué)等多種胚胎優(yōu)選的方法已逐漸應(yīng)用于臨床[6]。但TLM系統(tǒng)價(jià)格昂貴，尚無(wú)法作為常規(guī)技術(shù)大規(guī)模使用；PGS因進(jìn)行遺傳分析增加了時(shí)間及經(jīng)濟(jì)成本，且部分胚胎無(wú)法培養(yǎng)至囊胚期進(jìn)行活檢、活檢可能導(dǎo)致胚胎損害、醫(yī)源性非整倍體以及結(jié)果不準(zhǔn)確等可能導(dǎo)致健康胚胎浪費(fèi)等，影響了其作為常規(guī)篩查手段的應(yīng)用[7]；代謝組學(xué)作為一個(gè)新興領(lǐng)域，其應(yīng)用價(jià)值尚需進(jìn)一步研究探索；只有囊胚培養(yǎng)僅僅通過(guò)延長(zhǎng)胚胎培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步優(yōu)選胚胎，因經(jīng)濟(jì)成本低、實(shí)用性強(qiáng)而廣泛應(yīng)用。但是，關(guān)于卵裂期胚胎或囊胚移植的利弊仍有爭(zhēng)議，一項(xiàng)Meta分析顯示囊胚較卵裂期胚胎在活產(chǎn)率、繼續(xù)妊娠率、臨床妊娠率、累積妊娠率和流產(chǎn)率等方面并沒有明顯優(yōu)勢(shì)(低質(zhì)量證據(jù))[8]。與上述研究結(jié)果不同，本研究中不同移植次數(shù)組和不同年齡組囊胚移植的胚胎種植率顯著高于卵裂期胚胎或有增高的趨勢(shì)。郭曉曉等[9]的研究結(jié)果認(rèn)為囊胚移植的臨床妊娠率顯著高于卵裂期胚胎移植；Zhu等[10]的研究亦發(fā)現(xiàn)單囊胚移植的活產(chǎn)率有高于單卵裂期胚胎移植的趨勢(shì)。但囊胚移植存在因延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間導(dǎo)致周期取消率升高[11]、增加子代男女性別比[11-12]、增加早產(chǎn)及先天畸形的風(fēng)險(xiǎn)[13]，在臨床應(yīng)用中也需引起重視。

在移植囊胚數(shù)目上，本研究中所有囊胚移植均為單囊胚移植。Freeman等[14]認(rèn)為38歲以下人群采用單囊胚移植可在維持出生率的同時(shí)有效降低多胎率，這也為本研究中所有囊胚移植均實(shí)行單囊胚移植策略的可行性及有效性提供了佐證。囊胚根據(jù)形成時(shí)間不同分為D5和D6囊胚，不同發(fā)育天數(shù)的囊胚對(duì)臨床結(jié)局是否具有不良影響，目前尚無(wú)統(tǒng)一觀點(diǎn)。Ferreux等[15]發(fā)現(xiàn)移植D5囊胚的臨床妊娠率及活產(chǎn)率均顯著高于移植D6囊胚(P<0.05)。一項(xiàng)Meta分析結(jié)果也顯示，無(wú)論鮮胚或凍胚移植，D5囊胚較D6囊胚移植具有較高的臨床妊娠率和活產(chǎn)率[16]。漆倩榮等[17]則認(rèn)為凍融周期胚胎的發(fā)育天數(shù)對(duì)妊娠結(jié)局無(wú)顯著影響。本研究結(jié)果顯示，首次移植和年齡在33歲以下的患者移植D5囊胚的臨床妊娠率及胚胎種植率均顯著高于移植D6囊胚及雙優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎(P<0.05)，但隨著移植次數(shù)的增多及年齡的增加，這種優(yōu)勢(shì)逐漸減少。分析這可能與年輕患者、首次移植的D5囊胚多為剩余凍存胚胎的最優(yōu)胚胎，胚胎整倍體率高有關(guān)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，在移植次數(shù)≤2次及年齡<33歲的患者中，D6囊胚移植的早期流產(chǎn)率均顯著高于D5囊胚(P<0.05)。該結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道類似，Xu等[18]發(fā)現(xiàn)移植D6囊胚的早期流產(chǎn)率顯著高于D5囊胚(P<0.05)；還有研究顯示D6囊胚的整倍體率顯著低于D5囊胚(P<0.05)，推測(cè)與流產(chǎn)率升高有關(guān)，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[19]。盡管本研究中移植次數(shù)≥3次及年齡≥33歲的患者中D5與D6囊胚移植的早期流產(chǎn)率差異無(wú)顯著性差異(P>0.05)，但D6囊胚的早期流產(chǎn)率仍有高于D5囊胚的趨勢(shì)，不排除與該亞組樣本量少有關(guān)，后續(xù)需要進(jìn)一步開展大樣本的前瞻性研究加以驗(yàn)證。

雖然雙卵裂期胚胎移植可達(dá)到類似單囊胚移植的活產(chǎn)率，但多活胎分娩率也隨之升高。臨床上有時(shí)期望通過(guò)移植1枚優(yōu)胚+1枚非優(yōu)胚的策略來(lái)實(shí)現(xiàn)維持臨床妊娠率、降低多胎率的目的，在本研究中，移植次數(shù)≤2次組及不同年齡分組中，DET-D3組的臨床妊娠率及多胎率均顯著高于SET-D3優(yōu)組；在多次組中，DET-D3組的臨床妊娠率略低于SET-D3優(yōu)組，多胎率顯著高于SET-D3優(yōu)組。Zhu等[10]的研究亦認(rèn)為，盡管單優(yōu)胚移植的活產(chǎn)率顯著低于優(yōu)+非優(yōu)的雙胚胎移植，但后者的多活胎分娩率顯著增高，提示優(yōu)+非優(yōu)組合的雙胚胎移植并不能有效降低多胎風(fēng)險(xiǎn)。因單胚胎移植組剖宮產(chǎn)率、產(chǎn)前出血、早產(chǎn)、低出生體重、1分鐘Apgar評(píng)分<7分及新生兒住院率均低于雙胚胎移植組，因此Ma等[20]建議40歲以下患者，在有優(yōu)質(zhì)胚胎的情況下仍優(yōu)先選擇單胚胎移植。如eSET失敗，再次eSET的臨床妊娠率、流產(chǎn)率及累積活產(chǎn)率與單周期DET后的臨床結(jié)局持平，同時(shí)有效降低了多胎妊娠率[21]。但是，在推行eSET的過(guò)程中，由于部分患者對(duì)雙胎的偏好甚至超過(guò)安全妊娠[22]，這部分患者會(huì)認(rèn)為eSET是一次不必要且成本昂貴的嘗試，并且可能延遲其成功妊娠[23]，以及兩次eSET的成本并不低于DET[24]，這些因素都可能進(jìn)一步阻礙eSET的推行。我院在eSET策略的探索中，經(jīng)過(guò)2年的實(shí)踐證明，eSET可在維持臨床妊娠率的同時(shí)，明顯降低多胎率，因此認(rèn)為eSET是切實(shí)可行的，值得進(jìn)一步推廣應(yīng)用。但本研究仍存在一定的局限性，首先，由于2021年大部分患者仍未分娩，活產(chǎn)率數(shù)據(jù)不全，故本研究未對(duì)活產(chǎn)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；其次，部分移植方案亞組間的年齡存在顯著性差異，可能會(huì)對(duì)妊娠結(jié)局的統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生一定影響。后續(xù)需進(jìn)一步完善研究設(shè)計(jì)加以探討。

綜上所述，對(duì)于40歲以內(nèi)、首次行FET的患者，優(yōu)先考慮移植1枚D5囊胚，其次為1枚D6囊胚；對(duì)于多次移植失敗的患者，可選擇雙優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎移植，但需警惕多胎的發(fā)生。