潘璠，季悅，王沛青，徐何榮，王珊珊

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)和婦產(chǎn)醫(yī)學(xué)中心，南京 210008)

單胚胎移植(single embryo transfer，SET)在穩(wěn)定妊娠率的同時(shí)可以降低多胎率，是輔助生殖技術(shù)(ART)未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)[1]。SET的重點(diǎn)在于對(duì)移植胚胎的評(píng)估與選擇，胚胎的種植潛能與其發(fā)育速度及其他形態(tài)學(xué)特征密切相關(guān)[2]。然而在臨床診療過(guò)程中，可能出現(xiàn)部分患者Day 3胚胎質(zhì)量均為非優(yōu)質(zhì)、發(fā)育潛能欠佳的情況。如何有效利用這些非優(yōu)質(zhì)胚胎獲得較為理想的妊娠結(jié)局引起生殖科醫(yī)生的關(guān)注。

囊胚移植因其高種植率的優(yōu)勢(shì)已受到廣泛關(guān)注。文獻(xiàn)報(bào)道，囊胚培養(yǎng)作為優(yōu)選胚胎的方式之一，能在非優(yōu)質(zhì)胚胎中篩選出發(fā)育潛能稍好的胚胎，因此可以提高種植率[3-4]。而另有研究指出，囊胚培養(yǎng)并不能提高患者的累積臨床妊娠率和非優(yōu)質(zhì)胚胎的利用率，反而還可能降低卵子利用率[5-7]。因此結(jié)論不一致。

本研究旨在探討對(duì)于新鮮周期SET患者，當(dāng)Day 3全部為非優(yōu)質(zhì)胚胎時(shí)，如何選擇合適的移植時(shí)期以獲得更好的妊娠結(jié)局，為胚胎移植策略提供新思路。

資料與方法

一、研究對(duì)象及分組

選擇2015年1月至2020年12月在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科接受常規(guī)體外受精(IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)的不孕癥患者527 例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<40 歲；(2)周期數(shù)≤2個(gè)；(3)患者Day 3胚胎均為非優(yōu)質(zhì)胚胎；(4)患者為自愿進(jìn)行SET或身高<150 cm、體重<40 kg、有雙胎不良孕產(chǎn)史、疤痕子宮、宮頸機(jī)能不全等符合SET指征的人群；(5)移植前子宮內(nèi)膜厚度>8 mm。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)可能影響胚胎種植的因素，如子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤等；(2)胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)周期/供卵周期。

根據(jù)患者意愿選擇移植時(shí)期，139例患者選擇 Day 3單卵裂期胚胎移植(single cleavage transfer，SCT)，納入SCT組；388例患者選擇Day 5單囊胚移植(single blastocyst transfer，SBT)，其中83例養(yǎng)成并移植囊胚，納入SBT組，305 例未養(yǎng)成囊胚而放棄移植。再按年齡將SCT組和SBT組分別分為兩個(gè)亞組，≤35歲SCT組(n=124)和36～39 歲SCT組(n=15)；≤35歲SBT組(n=75)和36～39 歲SBT組(n=8)。治療前，患者均簽署知情同意書(shū)。

本研究經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意。

二、研究方法

1.控制性促排卵與取卵：促排卵過(guò)程按照本中心常規(guī)流程進(jìn)行，根據(jù)患者自身情況采用常規(guī)促排卵方案，包括長(zhǎng)方案、微刺激和拮抗劑方案、超長(zhǎng)方案。B超下監(jiān)測(cè)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育情況，待優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，注射HCG扳機(jī)，約36 h后經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下穿刺卵泡獲卵。將獲得的卵冠丘復(fù)合物(OCCC)經(jīng)Gamete液(Vitrolife，瑞典)洗滌后放置于過(guò)夜預(yù)溫平衡后的IVF序貫培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)培養(yǎng)皿中。

2.受精與胚胎培養(yǎng)：根據(jù)患者取卵當(dāng)日精子情況，選用常規(guī)IVF或ICSI受精。IVF方案中，取卵3 h后，加入精子懸液，按照精：卵100 000∶1的比例共孵育5 h，采用機(jī)械法剝離顆粒細(xì)胞，將受精卵轉(zhuǎn)入G1序貫培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中在37 ℃、6% CO2、5% O2培養(yǎng)環(huán)境下進(jìn)行胚胎體外培養(yǎng)。ICSI方案中，取卵3 h后，采用透明質(zhì)酸酶剝脫顆粒細(xì)胞，培養(yǎng)1 h后行卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射，洗滌后同樣轉(zhuǎn)入G1序貫培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)。培養(yǎng)至Day 3進(jìn)行卵裂胚評(píng)估，再將需繼續(xù)培養(yǎng)的胚胎轉(zhuǎn)移至G2序貫培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中，培養(yǎng)至Day 5進(jìn)行囊胚評(píng)估。

3.胚胎評(píng)估：本研究根據(jù)伊斯坦布爾共識(shí)[8]進(jìn)行胚胎評(píng)估，所有移植胚胎均為2PN來(lái)源。Day 3評(píng)估胚胎卵裂球數(shù)目、形態(tài)以及碎片比例，將其分為Ⅰ～Ⅳ級(jí)胚胎，其中7～12細(xì)胞的Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎，其余為形態(tài)學(xué)非優(yōu)質(zhì)胚胎。Day 3為2～3細(xì)胞及碎片≥50%的胚胎不在研究范圍內(nèi)。囊胚評(píng)估依據(jù)Gardner囊胚評(píng)分系統(tǒng)[9]，對(duì)囊胚腔擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)以及滋養(yǎng)細(xì)胞層的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分≥Ⅰ期視為可移植囊胚(不包含內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)細(xì)胞層評(píng)分均為C的囊胚)，評(píng)分≥3BB為優(yōu)質(zhì)囊胚。

4.移植與妊娠結(jié)局判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)患者意愿及身體情況，行Day 3 SCT或Day 5 SBT。移植后常規(guī)進(jìn)行黃體支持，14 d后檢測(cè)患者空腹外周血，血β-HCG>5 U/L為HCG陽(yáng)性；移植4～6 周后行陰道B超檢查，若見(jiàn)孕囊和胎心則為臨床妊娠。

定期對(duì)患者身體情況和妊娠結(jié)局進(jìn)行電話隨訪。記錄并計(jì)算臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、平均孕周、新生兒體重及出生缺陷發(fā)生率。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、患者基本資料比較

本研究共納入單胚胎移植222個(gè)周期。其中Day 3單卵裂期胚胎移植(SCT組)139周期，Day 5單囊胚移植(SBT組)83周期。兩組患者間年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)卵泡刺激素(bFSH)水平、促性腺激素(Gn)天數(shù)、Gn用量和移植前內(nèi)膜厚度比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。

二、患者臨床妊娠結(jié)局比較

SCT組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率與SBT組相比有增高的趨勢(shì)，流產(chǎn)率有降低的趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；兩組間平均孕周及新生兒出生體重均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；兩組均無(wú)新生兒出生缺陷(表2)。

在選擇SBT方案的388例患者中，養(yǎng)成囊胚83例，未養(yǎng)成囊胚而放棄移植305 例，周期取消率為78.61%(305/388)；共858枚胚胎培養(yǎng)囊胚，Day 5形成囊胚92枚，囊胚形成率10.72%(92/858)；Day 5形成優(yōu)質(zhì)囊胚7枚，優(yōu)質(zhì)囊胚形成率0.82%(7/858)。

三、不同年齡段患者妊娠結(jié)局比較

按年齡將SCT組和SBT組分別分為兩個(gè)亞組：≤35歲SCT組(n=124)和36～39歲SCT組(n=15)；≤35歲SBT組(n=75)和36～39 歲SBT組(n=8)。隨著年齡增加，SCT組與SBT組均呈現(xiàn)出臨床妊娠率及活產(chǎn)率降低、流產(chǎn)率增高的趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。同一年齡段中，SCT組與SBT組比較，臨床妊娠率及活產(chǎn)率有增高的趨勢(shì)、流產(chǎn)率有降低的趨勢(shì)，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

四、移植的囊胚質(zhì)量對(duì)妊娠結(jié)局的影響

隨著移植Day 5囊胚質(zhì)量的提高，患者臨床妊娠率和活產(chǎn)率隨之增高。相比于移植Ⅰ期囊胚，移植Ⅳ期囊胚患者的臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著提高(P<0.05)(表4)。

討 論

囊胚培養(yǎng)可篩選出種植潛能較高的胚胎，使胚胎和子宮內(nèi)膜的同步性更好[10]，所以近年來(lái)越來(lái)越多的生殖中心采取將Day 3胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至Day 5囊胚移植的策略。但是囊胚移植也有不可忽視的隱患，如周期取消率顯著增高、早產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)增加、單卵雙胎比例提高、性別比失衡等[11]。因此，對(duì)于單胚胎移植(SET)周期中Day 3胚胎均為非優(yōu)質(zhì)胚胎的患者，選擇合適的移植時(shí)期尤為關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，此類(lèi)患者新鮮周期單囊胚移植(SBT)的妊娠結(jié)局與單卵裂胚移植(SCT)相比沒(méi)有顯著差異，且囊胚培養(yǎng)導(dǎo)致周期取消率增加。因此，對(duì)于這類(lèi)患者較早移植可能是更為可靠的移植策略。

囊胚培養(yǎng)的首要風(fēng)險(xiǎn)在于患者可能由于無(wú)囊胚形成而取消周期，對(duì)于Day 3均為非優(yōu)質(zhì)胚胎的患者而言更為顯著。有Meta分析指出，囊胚移植的周期取消率顯著高于卵裂裂胚移植，而累積活產(chǎn)率無(wú)顯著差異[12-13]。本研究結(jié)果顯示，SBT組的活產(chǎn)率與SCT組相比無(wú)顯著差異(26.51% vs. 30.22%)，但選擇SBT的患者周期取消率高達(dá)78.61%，與文獻(xiàn)相符。這有可能是因?yàn)楸狙芯恐械腄ay 3胚胎均為非優(yōu)質(zhì)胚胎，不利于囊胚形成。有研究發(fā)現(xiàn)，卵裂胚的質(zhì)量與囊胚形成率密切相關(guān)，當(dāng)卵裂胚<7細(xì)胞、碎片比例>10%時(shí)，囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚形成率顯著降低[14-15]。推測(cè)原因可能是細(xì)胞數(shù)少的胚胎發(fā)育潛能較低，而碎片使細(xì)胞體積減少，干擾了細(xì)胞間的連接與融合，抑制了囊胚腔的形成[16-18]。本研究中，選擇SBT的患者囊胚形成率僅為10.72%，說(shuō)明這部分患者極有可能面臨無(wú)囊胚可用而取消周期的風(fēng)險(xiǎn)。在這種情況下，選擇繼續(xù)囊胚培養(yǎng)可能會(huì)加重患者的心理壓力，因此移植時(shí)期的選擇應(yīng)更加慎重。

囊胚培養(yǎng)技術(shù)通過(guò)對(duì)胚胎發(fā)育潛能進(jìn)一步篩選，獲得優(yōu)質(zhì)胚胎移植以提高臨床妊娠率。有研究證實(shí)部分Day 3非優(yōu)質(zhì)胚胎仍具有一定發(fā)育潛能，可以形成優(yōu)質(zhì)囊胚并最終獲得活產(chǎn)[19]。本研究中移植Ⅳ期囊胚患者的活產(chǎn)率達(dá)54.55%，與文獻(xiàn)結(jié)果一致，說(shuō)明對(duì)于Day 3無(wú)優(yōu)質(zhì)胚胎的患者，進(jìn)行囊胚培養(yǎng)后若能形成高質(zhì)量囊胚，則可獲得較好的妊娠結(jié)局。但不可忽略的一點(diǎn)是非優(yōu)質(zhì)胚胎形成高質(zhì)量囊胚的概率較低，本研究中選擇SBT方案的患者優(yōu)質(zhì)囊胚形成率僅0.82%，大部分患者移植囊胚均為早期囊胚(Ⅰ～Ⅱ期)。而隨著Day 5移植囊胚質(zhì)量下降，患者臨床妊娠率和活產(chǎn)率也有下降趨勢(shì)，Ⅰ期囊胚移植組的臨床妊娠率(25.00% vs. 63.64%)和活產(chǎn)率(19.44% vs. 54.55%)顯著低于Ⅳ期囊胚移植組(P<0.05)，這與詹少泉等[20]的研究結(jié)果相符?？赡芤?yàn)棰衿谀遗甙l(fā)育速度較慢，導(dǎo)致胚胎與子宮內(nèi)膜不同步而種植失敗。

自然流產(chǎn)是臨床妊娠中主要的并發(fā)癥，ART中自然流產(chǎn)率約為10%～20%[21]。本研究結(jié)果表明，非優(yōu)質(zhì)胚胎患者SCT的流產(chǎn)率為17.65%，而SBT流產(chǎn)率為24.14%，略高于正常水平，這可能與移植囊胚的非整倍性有關(guān)[22]。Minasi等[23]研究發(fā)現(xiàn)，囊胚的整倍性與其擴(kuò)張程度相關(guān)，與Ⅴ～Ⅵ期囊胚相比，Ⅰ～Ⅱ期囊胚為非整倍體的概率顯著提高(P=0.026)?？紤]到本研究中大部分SBT周期移植的為Ⅰ～Ⅱ期囊胚，推測(cè)其中非整倍體囊胚比例較高，可能導(dǎo)致流產(chǎn)率增加。另外，延長(zhǎng)體外培養(yǎng)時(shí)間，也可能會(huì)導(dǎo)致囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)變化，增加基因表達(dá)錯(cuò)誤概率[24-25]。同時(shí)，年齡也是流產(chǎn)率升高的影響因素之一[26]。本研究中，隨著年齡增長(zhǎng)，患者的流產(chǎn)率有增高的趨勢(shì)。這可能是由于高齡患者子宮內(nèi)膜容受性降低，胚胎染色體異常率較高，導(dǎo)致流產(chǎn)率增加[27]。因此，在Day 3將非優(yōu)質(zhì)胚胎植入母體，縮短體外培養(yǎng)時(shí)間，可能更有利于胚胎發(fā)育與種植。

綜上所述，對(duì)于Day 3均為非優(yōu)質(zhì)胚胎的患者，新鮮周期行單胚胎移植時(shí)，單囊胚移植與單卵裂期胚胎移植相比妊娠結(jié)局無(wú)明顯差異，但周期取消率顯著增加。因此，建議此類(lèi)患者選擇Day 3單卵裂期胚胎移植，可能獲得更好的妊娠結(jié)局。本研究為單中心回顧性研究，樣本量較少，且不同中心對(duì)于非優(yōu)質(zhì)胚胎的定義不同，可能會(huì)影響結(jié)果，因此需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量開(kāi)展多中心隨機(jī)對(duì)照研究來(lái)進(jìn)一步研究論證。