陳曉超，卜恒濤，梁 超，李 杰

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南京 210029

腎細(xì)胞癌是世界上第三常見的泌尿系惡性腫瘤，主要包括腎透明細(xì)胞癌、乳頭狀腎細(xì)胞癌、嫌色細(xì)胞癌、集合管癌和未分類腎細(xì)胞癌。其中腎透明細(xì)胞癌約占80%～90%［1］。盡管目前開發(fā)了許多靶向藥物和免疫抑制藥物，但腎根治性切除術(shù)仍然是金標(biāo)準(zhǔn)治療方法［2］。此外，腎透明細(xì)胞癌的特點(diǎn)是復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高［3］，這對患者的健康和生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。因此，尋找腎透明細(xì)胞癌中的相關(guān)基因以構(gòu)建預(yù)測模型至關(guān)重要，同時這些基因也可以作為未來分子靶向治療的潛在靶點(diǎn)。

最新研究表明，RNA修飾是一種新興的基因調(diào)控機(jī)制，其主要包括m6A、m5C 和m1A，m6A 和m5C修飾技術(shù)是160多種化學(xué)修飾中最主要和最具代表性的兩種RNA 轉(zhuǎn)錄后修飾類型［4-5］。其中，m5CRNA甲基化修飾主要依賴于甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基化酶和結(jié)合蛋白，m5C-RNA甲基化修飾發(fā)揮多種生物學(xué)功能。如調(diào)節(jié)mRNA 的轉(zhuǎn)運(yùn)，增加RNA 的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯，維持RNA 正常結(jié)構(gòu)等，近年來許多研究表明，m5C-RNA 甲基化修飾參與調(diào)節(jié)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。如在肺癌中，m5C 甲基化相關(guān)基因NSUN3、NSUN4 在腫瘤組織中的表達(dá)高于正常肺組織，且與臨床病理特征及生存率有關(guān)，此外，還與6 種主要免疫細(xì)胞的浸潤有關(guān)，從而調(diào)節(jié)肺癌的腫瘤免疫微環(huán)境［6］。在膀胱尿路上皮癌中，m5C 甲基化轉(zhuǎn)移酶NSUN2 表達(dá)較正常組織高，從而通過增強(qiáng)癌基因肝癌衍生生長因子（HDGF）mRNA 的穩(wěn)定性來促進(jìn)疾病的發(fā)生發(fā)展。而對頭頸鱗狀細(xì)胞癌的研究顯示，m5C RNA甲基化修飾不僅有助于促進(jìn)疾病的進(jìn)展，NSUN5、DNMT1和DNMT3A 的表達(dá)模式還有助于預(yù)測疾病的預(yù)后。因此，尋找m5C甲基化相關(guān)基因?qū)δ[瘤患者的早期診斷和預(yù)后評估具有重要意義

本研究基于腫瘤基因圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫下載的腎透明細(xì)胞癌患者的數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)和統(tǒng)計學(xué)分析，構(gòu)建了由m5C甲基化相關(guān)基因組成的生存預(yù)后模型，分析了與腎透明細(xì)胞癌生存有關(guān)的獨(dú)立預(yù)后影響因素，同時用此模型將腎透明細(xì)胞癌患者分為高低分險組，通過GO 和KEGG 分析對高低風(fēng)險組中的差異基因進(jìn)行了分析，進(jìn)一步揭示這些差異基因的生物學(xué)功能和潛在的信號通路。

1 資料和方法

1.1 資料

從TCGA 數(shù)據(jù)庫中下載了572 個腎透明細(xì)胞癌樣本和72 個正常樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)用于進(jìn)一步分析，臨床數(shù)據(jù)也從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載（https：//www.cbioportal.org/）［9］。在cBioportal 數(shù)據(jù)庫中研究了選定的4 種基因與拷貝數(shù)變異之間的關(guān)系（https：//www.cbioportal.org/）［10］。在GEPIA2 數(shù)據(jù)庫找到這4 種基因的不同器官表達(dá)特征［11］。腎透明細(xì)胞癌和癌旁正常組織樣本來自2008年4月—2019年4月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受根治性腎切除術(shù)的患者，本研究經(jīng)過了南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會授權(quán)（倫理批準(zhǔn)號：2021-SR-430）。所有患者都簽署了協(xié)議，允許他們的組織樣本和相應(yīng)臨床信息用于進(jìn)一步的研究。

1.2 方法

1.2.1 m5C-RNA甲基化相關(guān)基因分析

從已發(fā)表的文獻(xiàn)中找到13 個m5C 甲基化相關(guān)基因，其中包括11 個甲基轉(zhuǎn)移酶（NOP2、NSUN2、NSUN3、NSUN4、NSUN5、NSUN6、NSUN7、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、TRDMT1）、1 個去甲基化酶（TET2）和1 個結(jié)合蛋白（ALYREF）。然后系統(tǒng)地提取并分析了13 種調(diào)節(jié)基因的表達(dá)譜，以及臨床病理參數(shù)。

1.2.2 m5C甲基化相關(guān)基因差異表達(dá)的數(shù)據(jù)處理

提取572 例腫瘤組織和72 例正常腎組織中m5C 甲基化相關(guān)基因的表達(dá)矩陣和臨床資料。使用limma 軟件包的R 版本（4.1.0）確定腫瘤和對照組之間差異表達(dá)的m5C甲基化相關(guān)基因。以P＜0.05和|log2FC|＞1 作為所有檢驗的顯著性閾值。此外，用熱圖和小提琴圖展示腫瘤組和對照組表達(dá)的差異。

1.2.3 m5C甲基化相關(guān)基因的共識聚類分析

用R（4.1.0）的“ConsensusClusterPlus”軟件包對篩選出來的13 個m5C 甲基化相關(guān)基因進(jìn)行共識聚類分析。此外，還對不同的聚類進(jìn)行生存分析，以確定腎透明細(xì)胞癌樣本中的最佳聚類。然后進(jìn)行了Kaplan-Meier 生存分析，以揭示不同集群之間總體生存率的差異。比較臨床病理參數(shù)，包括性別、分級、年齡、TNM 分期和不同聚類之間的關(guān)系。

1.2.4 蛋白質(zhì)相互作用及功能分析

為了進(jìn)一步篩選出中心基因，使用STRING數(shù)據(jù)庫檢索相互作用基因以分析差異表達(dá)的m5C甲基化相關(guān)基因，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)（http：//stringdb.org/）［12］。

1.2.5 構(gòu)建預(yù)測模型

首先，計算危險比（hazard ratio，HR，危險組個體和非危險組個體的比值）和95%置信區(qū)間（confidence interval，CI），通過單變量Cox回歸分析識別適當(dāng)?shù)暮蜻x基因。其次，使用Lasso-Cox 回歸分析，挑選出合適的能夠預(yù)測腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后基因，風(fēng)險值計算公式為：風(fēng)險值其中，n代表mRNA 的數(shù)目，coef 是系數(shù)，xi是基因的表達(dá)量）。接下來，根據(jù)風(fēng)險值中位數(shù)，將TCGA 的腎透明細(xì)胞癌隊列分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，再用Kaplan-Meier生存分析/風(fēng)險預(yù)測模型估計候選風(fēng)險基因的預(yù)后價值。

1.2.6 GO和KEGG富集分析

使用R 軟件包“clusterProfiler”、“enrichplot”和“ggplot2”對這13個選定基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，以確定分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞成分（cellular components，CC）和生物過程（biological process，BP）并尋找潛在的信號通路。

1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)

腎癌細(xì)胞系（786-O、A498）和人腎小管上皮細(xì)胞系（HK-2）均購自中國科學(xué)院（上海）細(xì)胞庫。其中，786-O 和HK-2 細(xì)胞在RPMI 1640 中培養(yǎng)，A498細(xì)胞在DMEM/F12中培養(yǎng)。所有細(xì)胞系均在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.8 總RNA的提取和qRT-PCR

使用TRIzol 試劑（美國賽默飛公司）從培養(yǎng)的細(xì)胞和組織樣本中提取總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后使用StepOne Plus 實時PCR 系統(tǒng)和SYBR Premix Ex Taq 試劑進(jìn)行qRT-PCR 實驗，目的基因引物見表1。

表1 實時定量PCR的引物序列Table 1 The sequences of primers for RT-qPCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析使用R 軟件（4.1.0）進(jìn)行。此外，Perl編程語言（版本5.30.2）用于數(shù)據(jù)處理。Kaplan-Meier生存曲線分析用于分析總體生存率（overall survival，OS）。單變量和多變量Cox 回歸分析用于評估預(yù)后意義。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 m5C 甲基化相關(guān)基因在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況

為了明確腎透明細(xì)胞癌中m5C 甲基化相關(guān)基因的基本生物學(xué)功能的表達(dá)，首先從TCGA 數(shù)據(jù)庫中下載并提取了有效的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，如熱圖所示（圖1A）。在572例腫瘤患者中，13個m5C甲基化相關(guān)基因中有12 個在腫瘤和正常組織中有差異性表達(dá)（P＜0.05）。其中包括NOP2、NSUN2、NSUN3、NSUN4、NSUN5、NSUN6、NSUN7、DNMT1、DNMT3A、TET2、DNMT3B 以及ALYREF。然而，與正常組織相比，腎透明細(xì)胞癌組織中TRDMT1 的表達(dá)沒有明顯差異（圖1B）。在這12 個基因中，除了NSUN4 和NSUN7外，其余基因在腫瘤組織中表達(dá)較正常組織明顯上調(diào)（P＜0.05）。說明m5C 甲基化相關(guān)基因在腎透明細(xì)胞癌組織和相應(yīng)的正常組織中的表達(dá)有明顯差異。

2.2 腎透明細(xì)胞癌中m5C 甲基化相關(guān)基因之間的相互作用

為了研究主要m5C 甲基化相關(guān)基因之間的關(guān)聯(lián)，我們構(gòu)建了PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1C），以顯示13個m5C甲基化相關(guān)基因之間的相互作用。TRDMT1似乎是相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心基因，與其余大多數(shù)m5C甲基化相關(guān)基因相關(guān)。由于PPI網(wǎng)絡(luò)沒有提供相關(guān)性的詳細(xì)信息，對腎透明細(xì)胞癌進(jìn)行了進(jìn)一步的相關(guān)性分析（圖1D）。TET2 和NSUN3 之間存在密切的相關(guān)性。除NSUN4外，NOP2與其他11個m5C甲基化相關(guān)基因相關(guān)。除NSUN7、NSUN4、NSUN3 外，NUSN2 與其他m5C 甲基化相關(guān)基因呈正相關(guān)。DNMT3A、DNMT3B、NSUN4、NSUN6亦如此。最后，TRDMT1和TET2與NSUN5負(fù)相關(guān)性最高，分別為-0.33和-0.31。

圖1 m5C甲基化相關(guān)基因在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)和相互作用Figure 1 Expression and interaction of m5C methylation-related genes in renal clear cell carcinoma

2.3 鑒定具有不同臨床結(jié)果和特征的兩組腎透明細(xì)胞癌樣本

使用TCGA 數(shù)據(jù)庫中572 份腎透明細(xì)胞癌樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行共識聚類分析。從上述差異表達(dá)的m5C 甲基化相關(guān)基因中，使用13 個基因（NOP2、NSUN2、NSUN3、NSUN4、NSUN5、NSUN6、NSUN7、TRDMT1、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、TET2 和ALYREF）進(jìn)行進(jìn)一步研究?；?3個基因表達(dá)的相似性分析，結(jié)合共識聚類累積分布函數(shù)（CDF）和CDF曲線下區(qū)域的相對變化（圖2A、B），當(dāng)聚類穩(wěn)定性數(shù)據(jù)集中k在2～10之間變化時，k=2被認(rèn)為是合適的聚類數(shù)（圖2C）。然后，根據(jù)生存參數(shù)將腎透明細(xì)胞癌樣本分為兩個亞群，可見亞群1中腎透明細(xì)胞癌患者的總生存期（overall survival，OS）較亞群2 縮短（P＜0.001，圖2D）。此外，為了更好地預(yù)測這兩個亞群腎透明細(xì)胞癌的臨床病理特征，應(yīng)用熱圖來顯示分期的顯著差異（P＜0.05）。而其他特征，如TNM分類、性別、年齡和臨床分級等無顯著差異（圖2E）。從而，我們可以得出結(jié)論，13個m5C甲基化相關(guān)基因的表達(dá)特征與腎透明細(xì)胞癌患者的分期有關(guān)。

圖2 共識聚類分析顯示腎透明細(xì)胞癌兩個亞群的預(yù)后差異Figure 2 Consensus clustering analysis revealed prognostic differences between two subgroups of clear cell renal cell carcinoma

2.4 生存預(yù)后模型的構(gòu)建

為了研究m5C 甲基化相關(guān)基因在腎透明細(xì)胞癌預(yù)后中的作用，對13 個m5C 甲基化相關(guān)基因表達(dá)譜進(jìn)行了單變量Cox 回歸分析。結(jié)果顯示，有4個基因（NSUN5、NSUN6、DNMT3B、TET2）可以用來預(yù)測腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后（圖3A）。在這4 個基因中，TET2 是HR ＜1 的保護(hù)基因，而NSUN5、NSUN6、DNMT3B 是HR ＞1 的風(fēng)險基因。然后將篩選出的基因應(yīng)用Lasso-Cox 回歸建立生存預(yù)后模型，根據(jù)最低標(biāo)準(zhǔn)生成了單個候選基因的系數(shù)（圖3B）。隨后，TCGA 數(shù)據(jù)庫中每個腎透明細(xì)胞癌患者的風(fēng)險值計算：0.258 493×NSUN6 表達(dá)量+0.058 203×NSUN5 表達(dá)量+（-0.502 707）×TET2 表達(dá)量+0.070 293×DNMT3B表達(dá)量（圖3C）。之后，根據(jù)風(fēng)險值中位數(shù)界限，腎透明細(xì)胞癌患者被分成高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，高風(fēng)險組患者生存率顯著低于低風(fēng)險組（圖3D）。這些結(jié)果表明，這4個m5C甲基化相關(guān)基因可以作為腎透明細(xì)胞癌的預(yù)測基因。

2.5 生存預(yù)后模型與腎透明細(xì)胞癌臨床特征的相關(guān)性

熱圖顯示，TET2 在低風(fēng)險組中高表達(dá)，而NSUN5、NSUN6 和DNMT3B 在高風(fēng)險組中高表達(dá)。此外，T、M 分期和分級存在顯著差異（圖3E，P＜0.05）。進(jìn)一步運(yùn)用單變量Cox 回歸分析確定預(yù)后因素。結(jié)果顯示：年齡（P＜0.001，HR=1.03，95%CI：1.017～1.044），分級（P＜0.001，HR=2.302，95%CI：1.858～2.851），分期（P＜0.001，HR=1.926，95%CI：1.678～2.209），T（P＜0.001，HR=1.987，95% CI：1.674～2.357），N（P＜0.001，HR=1.856，95%CI：1.528～2.255），M（P＜0.001，HR=4.388，95%CI：3.178～6.06）為單變量分析的獨(dú)立預(yù)后因素（圖3F）。再對這些參數(shù)進(jìn)行多變量Cox回歸分析，有價值的因素包括年齡（P＜0.01，HR=1.034，95%CI：1.018～1.049），分級（P＜0.001，HR=1.549，95%CI：1.218～1.968），分 期（P=0.027，HR=1.689，95%CI：1.062～2.689，圖3G）。

圖3 4種m5C甲基化相關(guān)基因所構(gòu)建的生存預(yù)后模型Figure 3 A survival prognostic model constructed by four m5C methylation-related genes

2.6 4個模型基因在泛癌中的表達(dá)及其在腎透明細(xì)胞癌中的遺傳變異

為了明確上述4個基因在人類相應(yīng)腫瘤中的表達(dá)差異，在泛癌樣本中對這4 個基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較，結(jié)果表明，TET2、NSUN5、NSUN6、DNMT3B在人類腫瘤中幾乎均是過表達(dá)（圖4A～D）。此外，在cBioportal 數(shù)據(jù)庫中研究了這4 種基因與拷貝數(shù)變異之間的關(guān)系，結(jié)果顯示：NSUN5、NSUN6、TET2、DNMT3B 的表達(dá)量和拷貝數(shù)變異之間的Pearson 系數(shù)分別為0.36、0.13、0.30、0.34（圖5），我們認(rèn)為TET2、NSUN5、DNMT3B 可能是由于其拷貝數(shù)的變異而對腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生和進(jìn)展產(chǎn)生影響。

圖4 4個模型基因在泛癌中的表達(dá)及其在腎透明細(xì)胞癌中的遺傳變異Figure 4 Pan-cancer expression of four model genes and their genetic variation in renal clear cell carcinom

圖5 NSUN5（A）、NSUN6（B）、TET2（C）和DNMT3B（D）與拷貝數(shù)變異之間的關(guān)系Figure 5 Association between NSUN5（A），NSUN6（B），TET2（C）and DNMT3B（D）and copy number variation

2.7 4個模型基因?qū)δI透明細(xì)胞癌預(yù)后產(chǎn)生影響的可能途徑

通過limma軟件包篩選出336個差異表達(dá)基因，其中281 個上調(diào)（P＜0.05，log2FC ＞1），55 個下調(diào)（P＜0.05，log2FC ＜-1），使用GOplot 和ggplot2 軟件包進(jìn)行了GO和KEGG富集分析，以說明差異表達(dá)基因的功能。KEGG分析結(jié)果顯示：在高風(fēng)險組中，這些差異表達(dá)基因的功能主要與補(bǔ)體和凝血級聯(lián)相關(guān)（P＜0.05），而在低風(fēng)險組中，則主要與癌癥中的蛋白聚糖相關(guān)（P＜0.05，圖6A、B）。GO分析結(jié)果顯示：在高風(fēng)險組中，這些差異表達(dá)基因在生物過程方面主要與體液免疫反應(yīng)和水解酶活性的負(fù)調(diào)控相關(guān)（P＜0.05），在細(xì)胞成分方面主要與血液微粒相關(guān)（P＜0.05），在分子功能方面主要與酶抑制劑活性相關(guān)（P＜0.05）；而在低風(fēng)險組中，這些差異表達(dá)基因在生物過程、細(xì)胞成分和分子功能方面分別與對類固醇激素的反應(yīng)、含膠原蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)和碳水化合物的結(jié)合相關(guān)（P＜0.05，圖6C、D）。這些結(jié)果為我們尋找m5C 甲基化相關(guān)基因在腎透明細(xì)胞癌中的潛在功能提供了新的途徑。

圖6 GO和KEGG富集分析結(jié)果Figure 6 GO and KEGG enrichment analysis results

2.8 4種m5C甲基化相關(guān)基因在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系及組織樣本中的表達(dá)

為了進(jìn)一步驗證4個選定的模型基因在腎透明細(xì)胞癌和組織樣本中的mRNA 表達(dá)情況，本研究在腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞系和組織樣本中進(jìn)行了qRTPCR實驗。結(jié)果顯示：與人腎小管上皮細(xì)胞系（HK-2）和癌旁正常組織相比，腎癌細(xì)胞系（786-O、A498）和腎透明細(xì)胞癌組織樣本中的NSUN5、NSUN6、TET2、DNMT3B表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖7）。

圖7 腎癌細(xì)胞系及組織樣本中4個m5C甲基化相關(guān)基因的驗證Figure 7 Validation of four m5C methylation-related genes in renal cancer cell lines and tissue samples

3 討論

本研究首先分析了這13 個m5C 甲基化相關(guān)基因在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，NOP2、NSUN2、NSUN3、NSUN4、NSUN5、NSUN6、NSUN7、DNMT3A、DNMT3B、TET2和ALYREF在腎透明細(xì)胞癌組及正常組中差異表達(dá)。其中，除了NSUN4 和NSUN7 外，其余基因在腫瘤組中均高表達(dá)。接下來，根據(jù)m5C甲基化相關(guān)基因?qū)⒛I透明細(xì)胞癌患者樣本分為兩個亞群，分析顯示，亞群1中腎透明細(xì)胞癌患者總體生存率較亞群2 低，這預(yù)示著m5C 甲基化相關(guān)基因可能與腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后相關(guān)。通過Lasso-Cox 回歸分析建立了由NSUN5、NSUN6、DNMT3B和TET2 4個基因組成的生存預(yù)后模型，根據(jù)每個腎透明細(xì)胞癌患者風(fēng)險值將樣本分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組，觀察發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險組患者生存率顯著低于低風(fēng)險組。這一結(jié)果提示，這4 個基因可以作為腎透明細(xì)胞癌的預(yù)測因子。接著先制作熱圖評估了4個m5C甲基化相關(guān)基因的臨床參數(shù)，然后通過單變量和多變量Cox 回歸分析確立了分級和分期是腎透明細(xì)胞癌的獨(dú)立預(yù)后因素。此外，GEPIA2 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)這4 種基因在腫瘤組中的表達(dá)均上調(diào)，而在cBioportal 數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)這4種基因的表達(dá)量與拷貝數(shù)變異之間有關(guān)，這一結(jié)果顯示，TET2、NSUN5、DNMT3B可能是由于其拷貝數(shù)的變異而對腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生和進(jìn)展產(chǎn)生影響。最后，GO和KEGG富集分析驗證這些m5c甲基化相關(guān)基因的主要生物學(xué)功能?？傮w而言，本研究結(jié)果表明m5C 甲基化相關(guān)基因?qū)δI透明細(xì)胞癌具有相對穩(wěn)定的預(yù)測能力。

目前，NSUN5、NSUN6、DNMT3B和TET2在腫瘤中的作用已被廣泛研究。根據(jù)報道，NSUN5可以通過修飾真核rRNA來維持小鼠的蛋白質(zhì)合成和正常的生長［13］。此外，NSUN5在結(jié)直腸癌腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，并通過促進(jìn)細(xì)胞增殖，在體外觸發(fā)細(xì)胞周期停滯進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長［14］；NSUN6可以通過調(diào)節(jié)CDK10 參與有絲分裂紡錘體的組裝進(jìn)而影響胰腺癌細(xì)胞的增殖［15］，此外，NSUN6 可以通過NELFB 和RPS6KB2 相互作用來介導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤對替莫唑胺的反應(yīng)［16］；另外有研究顯示，DNMT3B能夠與前列腺癌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄抑制因子結(jié)合控制RAD9 的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞的進(jìn)展［17］，DNMT3B還可以通過表觀遺傳學(xué)抑制miR-34a促進(jìn)膀胱癌的遷移和侵襲［18］。TET2 對調(diào)節(jié)正常造血至關(guān)重要，并且可以作為腫瘤抑制因子以維持造血細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，TET2的缺失可能會導(dǎo)致骨髓惡性腫瘤的發(fā)生［19］，此外，有研究表明，TET2可以抑制細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡［20］。

總而言之，本研究構(gòu)建了一個新的m5C相關(guān)基因的風(fēng)險預(yù)后模型用于預(yù)測腎透明細(xì)胞癌患者風(fēng)險程度和生存預(yù)后；根據(jù)該模型的風(fēng)險值中位值對患者進(jìn)行分組，生存分析結(jié)果顯示：高風(fēng)險組患者的分級和分期更高，這證明了所構(gòu)建模型的可靠性。通過生物信息學(xué)技術(shù)對大規(guī)模的腎透明細(xì)胞癌患者數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，并在細(xì)胞系和組織中進(jìn)行驗證，相較于以往的研究適用更廣泛、可靠性更高，本研究結(jié)果對腎透明細(xì)胞癌患者的風(fēng)險程度以及預(yù)后的預(yù)測具有一定意義，同時，本研究構(gòu)建的模型基因可以作為腎透明細(xì)胞癌個體化治療的治療靶點(diǎn)。但是，本研究仍然存在著一些局限性，本研究數(shù)據(jù)主要來自TCGA 公共數(shù)據(jù)庫，缺乏其他的數(shù)據(jù)庫來源的數(shù)據(jù)，并且在使用模型之前需要進(jìn)一步的多中心前瞻性臨床研究進(jìn)行驗證。