徐 芳，劉麗君，李 鵬，姚彥林，孫萬(wàn)倉(cāng)，武軍艷*

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，蘭州 730070；2 干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070)

組蛋白去乙?；?HDACs)在基因表達(dá)調(diào)控方面扮演著重要角色，涉及染色質(zhì)蛋白與轉(zhuǎn)錄因子間的相互作用，并且這種調(diào)控是在不改變DNA序列的條件下影響基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)[1]。乙酰化是動(dòng)態(tài)的，可逆的過(guò)程，包括組蛋白乙酰化和去乙?；謩e由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)和組蛋白去乙?；?HDACs)催化[2]。組蛋白去乙?；?HDACs)廣泛存在于動(dòng)物、酵母和植物體內(nèi)。HDACs在植物當(dāng)中可以分為3類，分別是RPD3/HDA1、SIR2、HD2[3]。RPD3/HDA1中所有的成員都包含了一個(gè)典型的組蛋白脫乙酰酶域，其酶的活性的發(fā)揮需要Zn2+的存在[2]；HD2這類亞家族對(duì)植物來(lái)說(shuō)是一類特有的重要蛋白[4-5]；SIR2家族與RPD3/HDA1和HD2亞家族結(jié)構(gòu)不相似，只有在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的存在下，其酶活性才能被發(fā)揮[6]。隨著HDACs基因的研究增多，發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；瘏⑴c植物根[7]及花的發(fā)育[8]等，表明其對(duì)植物的發(fā)育有著重要的作用，此外，組蛋白去乙?；€在植物響應(yīng)鹽脅迫[9]和低溫脅迫[10]等逆境脅迫方面發(fā)揮重要作用。

先前，有關(guān)HDACs在植物中的研究主要集中在模式植物擬南芥中。最近幾年在水稻[11]、甜橙[12]和番茄[13]中也有相關(guān)研究的報(bào)道。擬南芥AtHDA19除與環(huán)境脅迫有關(guān)[14]外，還與生殖發(fā)育有關(guān)[15]。在玉米中，ZmHDA101調(diào)控玉米籽粒大小[16]。李濤等[17]研究辣椒發(fā)育過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)CaHDA1的表達(dá)水平在果皮和胎盤成熟過(guò)程中逐漸升高，這意味著該基因可能參與了辣椒果實(shí)后期的發(fā)育。在龍眼中，DlHDT1可能參與其體胚形態(tài)的建成和響應(yīng)干旱等逆境脅迫應(yīng)答[18]。在低溫脅迫下，抑制了毛白楊HDA901、HDA910和SRT901三個(gè)基因在莖或根中的表達(dá)[19]。林瑩等[20]發(fā)現(xiàn)森林草莓在低溫脅迫8 h后，F(xiàn)vHDA1表達(dá)水平顯著升高，而其他基因沒有發(fā)生顯著變化，表明FvHDA1在森林草莓低溫脅迫響應(yīng)過(guò)程中可能發(fā)揮了一定調(diào)控作用。

溫度和干旱等逆境脅迫會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成嚴(yán)重危害，導(dǎo)致其產(chǎn)量和質(zhì)量的下降，這使得人們對(duì)植物非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制有了更多的關(guān)注[21]。中國(guó)北方地區(qū)冬季寒冷且干燥，白菜型冬油菜是重要的油料作物之一，具有非常明顯的經(jīng)濟(jì)效益[22-23]，白菜型冬油菜不僅可以安全的越冬，而且還有很好的適應(yīng)性[24]。所以對(duì)白菜型冬油菜生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫的耐受性進(jìn)行研究對(duì)其發(fā)展具有重要意義。目前，植物HDACs逐漸受到重視，HDACs基因已從玉米、擬南芥、水稻等多種植物中得以鑒定和分析。但HDACs在白菜型冬油菜中還尚未見研究及報(bào)道，而HDACs抑制劑TSA可以被用來(lái)研究組蛋白去乙?；笇?duì)植物產(chǎn)生的影響[25]。因此，本研究通過(guò)分析TSA對(duì)白菜型冬油菜萌發(fā)特性和生理生化特性的影響，利用生物信息學(xué)方法對(duì)HDACs基因家族成員進(jìn)行了鑒定及表達(dá)模式分析，闡述了組蛋白去乙?；冈谥参锷L(zhǎng)發(fā)育和抗寒性方面發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步分析白菜型冬油菜HDACs基因家族成員功能提供一定參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的3個(gè)白菜型冬油菜強(qiáng)抗寒品種‘隴油7號(hào)’、耐寒品種‘天油4號(hào)’和弱抗寒品種Lenox。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)芽試驗(yàn)挑選顆粒飽滿一致的白菜型冬油菜種子，用75%的乙醇表面消毒30 s，1%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒5 min，經(jīng)蒸餾水清洗5次后，分別進(jìn)行5種處理[TSA用二甲基亞砜(DMSO)作為溶劑]：1/2MS培養(yǎng)基(CK)，1/2MS+1 μmol/L TSA(T1)，1/2MS+與T1等量的DMSO(CK1)，1/2MS+3 μmol/L TSA(T2)，1/2MS+與T2等量的DMSO(CK2)。每個(gè)品種3個(gè)重復(fù)，分別在4 ℃低溫培養(yǎng)箱和24 ℃人工氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行萌發(fā)。

同樣挑選顆粒飽滿一致的白菜型冬油菜種子，置于培養(yǎng)皿中待露白后，移栽于花盆，幼苗長(zhǎng)至五葉期，進(jìn)行相應(yīng)處理。試驗(yàn)設(shè)置9個(gè)處理：4 ℃、0 ℃、-4 ℃、4 ℃+50 μmol/L TSA、4 ℃+100 μmol/L TSA、0 ℃+50 μmol/L TSA、0 ℃+100 μmol/L TSA、-4 ℃+50 μmol/L TSA和-4 ℃+100 μmol/L TSA，每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別處理12和24 h，采集油菜葉片，用于生理指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)與方法種子發(fā)芽期間，常溫處理第3天開始測(cè)定種子數(shù)，計(jì)算發(fā)芽勢(shì)(GE)；第7天開始測(cè)定種子發(fā)芽數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率(GP)，測(cè)定胚根長(zhǎng)和下胚軸。低溫處理置于4 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，種子發(fā)芽期間第8天測(cè)定發(fā)芽勢(shì)，第12天測(cè)定發(fā)芽率[26]。

發(fā)芽勢(shì)(GE)=初次計(jì)數(shù)發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽試驗(yàn)樣品粒數(shù)×100%

發(fā)芽率(GP)=末次計(jì)數(shù)發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽試驗(yàn)樣品粒數(shù)×100%

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白含量，用磺基水楊酸測(cè)定脯氨酸含量，用氮藍(lán)四唑法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性，愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性，用H2O2法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次[27]。

1.2.3 白菜型冬油菜HDACs基因家族生物信息學(xué)分析據(jù)李曉斐等[28]在龍眼HDAC家族成員全基因組鑒定及表達(dá)分析中的報(bào)道，利用已知Pfam號(hào)(RPD3/HDA1：PF00850、SIR2：PF02146)，在Pfam網(wǎng)站上下載其關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域序列。從油菜課題組測(cè)序的白菜型冬油菜‘隴油7號(hào)’全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選RPD3/HDA1、SIR2兩個(gè)亞家族基因成員，在TAIR網(wǎng)站上下載擬南芥HD2家族基因的蛋白質(zhì)序列作為對(duì)照，在白菜型油菜全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源比對(duì)，用BLAST比對(duì)檢索，進(jìn)一步篩選出白菜型冬油菜HD2亞家族成員。之后用在線軟件HMMER、SMART、CDD對(duì)所有候選基因序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域鑒定，最終篩選出具有完整保守結(jié)構(gòu)域的基因序列，作為HD2家族成員。

利用MEGA7.0軟件對(duì)白菜型冬油菜、擬南芥、大白菜3個(gè)物種采用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)，使用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，在線工具Evolview(https://evolgenius.info//evolview-v2/#login)進(jìn)行繪圖與美化。通過(guò)在線軟件MEME(http://meme-suite.org/)分析白菜型冬油菜的保守motif；利用gff文件在GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)上對(duì)白菜型冬油菜HDACs家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；用已經(jīng)獲得的motif、內(nèi)含子、外顯子文件在TBtools本地軟件上進(jìn)行繪圖。利用在線軟件PlantCARE分析HDACs家族成員的順式作用元件。根據(jù)白菜型油菜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)提取HDACs基因家族在染色體上的位置，用Mapchart軟件繪制染色體位置圖。

1.2.4 白菜型冬油菜HDACs基因家族表達(dá)分析對(duì)3個(gè)試驗(yàn)材料分別從莖、莖生葉、花、角果、新基葉、老基葉和生長(zhǎng)錐取材；將生長(zhǎng)至五葉期且生長(zhǎng)一致的幼苗在4 ℃、0 ℃和-4 ℃進(jìn)行低溫脅迫，分別處理0、1、4、6、12和24 h，將葉和根采樣后液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱待用。

用RNA Easy Fast Plant Tissue Kit RNA Easy Fast(TIANGEN)試劑盒提取白菜型冬油菜所有樣品的總RNA，PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA；將合成的cDNA稀釋10倍作為模板用于HDACs家族基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒為TIANGEN的SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)。設(shè)置PCR程序?yàn)椋?5 ℃ 15 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；以Actin作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt方法。試驗(yàn)中所用引物序列(表1)，每個(gè)樣品3次重復(fù)。利用白菜型冬油菜不同組織部位和低溫處理所得到的表達(dá)量，用Origin和TBtools繪制柱狀圖和熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度TSA對(duì)白菜型冬油菜種子萌發(fā)和生長(zhǎng)的影響

24 ℃下(表2)，與CK和CK1對(duì)比，T1處理后各品種的發(fā)芽勢(shì)略有降低，發(fā)芽率變化不同，其中‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’發(fā)芽率降低，Lenox沒有變化；T2處理與CK和CK2相比，發(fā)現(xiàn)3個(gè)品種的胚根長(zhǎng)都顯著減小(P≤0.05)。說(shuō)明TSA濃度為3 μmol/L時(shí)(即T2)，對(duì)3個(gè)品種胚根的生長(zhǎng)發(fā)育影響最大。

4 ℃下(表3)，在3個(gè)品種中，T1以CK1和T2以CK2為對(duì)照，T1和T2處理下發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率有所升高，表明TSA處理可能緩解了低溫對(duì)其種子萌發(fā)的影響。與CK和T1相比，T2處理下3個(gè)品種的胚根長(zhǎng)顯著減小(P≤0.05)。說(shuō)明TSA濃度為T2時(shí)，同樣對(duì)3個(gè)品種胚根的生長(zhǎng)影響最大。

由圖1和圖2可以看出，經(jīng)TSA處理后，24 ℃下的根長(zhǎng)較4 ℃下的根長(zhǎng)明顯變短，表明TSA可能在抑制根長(zhǎng)的過(guò)程中也緩解了低溫對(duì)其生長(zhǎng)的影響。

2.2 外源TSA對(duì)白菜型油菜抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

2.2.1 對(duì)抗氧化酶活性的影響由圖3可以看出，與CK相比，各品種內(nèi)SOD、POD和CAT活性均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在4 ℃下3個(gè)品種的POD活性變化趨勢(shì)相似，在外源噴施100 μmol/L TSA時(shí)顯著上升(P≤0.05)，且Lenox上升幅度較大；‘天油4號(hào)’中SOD和CAT活性相對(duì)高于‘隴油7號(hào)’和Lenox，而Lenox在外源噴施100 μmol/L TSA后SOD和CAT活性有所降低。

在0 ℃下，‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’在低溫處理下和外源噴施TSA后3種酶的活性變化不大，Lenox在外源噴施TSA后3種酶活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)?！]油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’SOD活性大于Lenox，而Lenox經(jīng)TSA處理后POD和CAT活性變化較大。

在-4 ℃下，‘天油4號(hào)’SOD活性顯著高于其他2個(gè)品種；‘隴油7號(hào)’在噴施100 μmol/L TSA處理24 h后，POD活性最大；而‘天油4號(hào)’和Lenox隨著外源噴施濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)POD活性先升高后降低。3個(gè)品種的CAT活性隨著噴施濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)有所下降，‘天油4號(hào)’和‘隴油7號(hào)’CAT活性高于Lenox。

表3 TSA處理對(duì)不同品種種子萌發(fā)特性的影響(4 ℃)

2.2.2 對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響由圖4可以看出，與CK相比，各品種內(nèi)可溶性蛋白和脯氨酸含量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。在4 ℃處理下，‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’可溶性蛋白含量逐漸增大，在外源噴施50 μmol/L TSA后達(dá)到最大；而Lenox在未噴施TSA處理24 h后可溶性蛋白含量達(dá)到最大，之后隨TSA處理有所降低；‘隴油7號(hào)’和Lenox脯氨酸含量也是在外源噴施50 μmol/L TSA后達(dá)到最大，而‘天油4號(hào)’在4 ℃處理12 h達(dá)到最大。

0 ℃處理下，‘隴油7號(hào)’和‘天油4號(hào)’可溶性蛋白和脯氨酸含量在100 μmol/L TSA處理后達(dá)到最大，Lenox在50 μmol/L TSA處理后達(dá)到最大，在100 μmol/L TSA處理后有所下降。

在-4 ℃處理下，‘隴油7號(hào)’和Lenox可溶性蛋白含量隨著外源噴施濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先增加然后減小的趨勢(shì)，而‘天油4號(hào)’則是逐漸增大。3個(gè)品種的脯氨酸含量都是隨著外源噴施濃度的增大和處理時(shí)間的延長(zhǎng)之間增大的，Lenox中脯氨酸含量上升得更明顯。

2.3 白菜型冬油菜BrapaHDACs家族鑒定

通過(guò)在‘隴油7號(hào)’的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)，共篩選出了21個(gè)具有完整保守結(jié)構(gòu)域的HDACs家族成員。與擬南芥AtHDAC的家族成員進(jìn)行同源比對(duì)，根據(jù)其對(duì)比后的同源基因名稱來(lái)命名，并用在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)其理化性質(zhì)。

HDACs各亞家族成員序列長(zhǎng)度差異較大(表4)，氨基酸數(shù)在210～1 141 aa，分子量為23.32～129.15 kD。其中RPD3/HDA1亞家族的15個(gè)成員，蛋白等電點(diǎn)在4.50～6.28，均呈酸性，10個(gè)屬于穩(wěn)定親水性蛋白，5個(gè)屬于不穩(wěn)定親水性蛋白；HD2亞家族的4個(gè)成員，等電點(diǎn)均在4.6左右，呈酸性；SIR2亞家族成員的理化性質(zhì)略有不同，等電點(diǎn)分別為6.66、8.93，一個(gè)偏中性，一個(gè)是堿性蛋白質(zhì)，HD2、SIR2成員均屬于不穩(wěn)定親水性蛋白。亞細(xì)胞定位后，大部分基因定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，少數(shù)基因成員定位在葉綠體、線粒體、過(guò)氧化物酶體和質(zhì)膜。

2.4 BrapaHDACs家族進(jìn)化樹的構(gòu)建及分析

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)可將HDACs家族分為3個(gè)亞家族，即RPD3/HDA1、HD2和SIR2亞家族，RPD3/HDA1亞家族有15個(gè)成員：BrapaH-DA2/5-1/5-2/5-3/6-1/6-2/7-1/7-2/8/9/14/15/15-1/15-2/19；SIR2亞家族有2個(gè)成員：BrapaSRT1/2；HD2亞家族有4個(gè)成員：BrapaHDT1/2-1/2-2/3。且發(fā)現(xiàn)白菜型冬油菜HDACs家族與大白菜、擬南芥家族聚類情況相同，表明HDACs家族成員和這些物種的同源性很高，可能具有相似的生物學(xué)功能。

表4 白菜型冬油菜BrapaHDACs基因家族基本理化性質(zhì)

2.5 BrapaHDACs基因家族motif、基因結(jié)構(gòu)及啟動(dòng)子順式作用元件分析

對(duì)白菜型冬油菜HDACs基因家族的motif和基因結(jié)構(gòu)分析(圖6)，在RPD3/HDA1亞家族成員中，除了BrapaHDA6-1/2這2個(gè)基因外，其余基因均含有motif6，其次除BrapaHDA15-2/14基因外，其余基因均含有motif7，BrapaHDA15-2/6-1/2的motif數(shù)最少；SIR2亞家族成員只有2個(gè)motif，且有其他基因均沒有的motif18和motif19，HD2亞家族的4個(gè)基因，均含有其他基因所沒有的motif11和motif13。

該家族成員所含外顯子和內(nèi)含子差異較大，BrapaHDA8外顯子和內(nèi)含子數(shù)最少，BrapaHDT1/3/2-1這3個(gè)基因內(nèi)含子和外顯子數(shù)目均在6、7左右，BrapaHDT2-2基因外顯子和內(nèi)含子數(shù)目為18、17個(gè)，與其他3個(gè)基因相差較大。這表明該家族基因在進(jìn)化的過(guò)程中可能產(chǎn)生了一定的分化。

對(duì)HDACs家族成員啟動(dòng)子的順式作用元件區(qū)域進(jìn)行分析(圖7)，該家族包含了MYB結(jié)合位點(diǎn)參與干旱誘導(dǎo)元件MBS、參與低溫反應(yīng)的順式作用元件LTR、參與光反應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件G-Box、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域中常見的順式作用元件CAAT-box、赤霉素反應(yīng)元件GARE-motif、轉(zhuǎn)錄-30左右的核心啟動(dòng)子元素TATA-box、水楊酸反應(yīng)元件TCA-element和生長(zhǎng)素反應(yīng)元件TGA-element等相關(guān)啟動(dòng)子順式作用元件。推測(cè)該基因家族可能參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫。

2.6 BrapaHDACs基因家族的染色體定位

染色體定位后，發(fā)現(xiàn)21個(gè)HDACs基因不均等分布在白菜型冬油菜8條染色體上(圖8)，其中RPD3/HDA1亞家族的15個(gè)成員分布在1、2、3、5、6和9號(hào)染色體上，SIR2亞家族的2個(gè)成員分布在2和3號(hào)染色體上，HD2的4個(gè)成員分布在2、4和10號(hào)染色體上。染色體6上含有的HDACs基因最多，為5個(gè)；其次是染色體1、2、3和9，均含有3個(gè)基因，染色體10含有2個(gè)，染色體4、5分別含有1個(gè)，染色體7和8不含有HDACs基因。結(jié)果表明可能HDACs基因成員在染色體上位置的不同，也使得發(fā)揮的功能不同。

2.7 白菜型冬油菜BrapaHDACs家族基因不同組織部位表達(dá)分析

qRT-PCR結(jié)果表明(圖9)，這8個(gè)基因在3個(gè)品種的不同組織中均有表達(dá)，其中BrapaHDA5-3、BrapaHDA6-1、BrapaHDA7-2、BrapaHDA8、BrapaHDA15-2和BrapaHDA19在各品種內(nèi)生長(zhǎng)錐中表達(dá)量最高。不同品種間基因表達(dá)也有明顯差異，BrapaHDA5-1在‘隴油7號(hào)’的角果中表達(dá)量高，BrapaHDA19在其花中表達(dá)較高；BrapaHDA6-1和BrapaHDA8在‘天油4號(hào)’花中表達(dá)量較高；BrapaHDA7-2和BrapaHDA5-1在Lenox花中高表達(dá)；BrapaHDA5-2基因在‘天油4號(hào)’的各個(gè)組織中表達(dá)量都較高，在Lenox的角果中也出現(xiàn)高表達(dá)。也表明這些基因在不同品種的組織部位的生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮著一定功能。

2.8 不同溫度脅迫下白菜型冬油菜BrapaHDACs家族基因的表達(dá)分析

2.8.1 4 ℃低溫脅迫下BrapaHDACs家族基因的表達(dá)分析在4 ℃冷脅迫不同時(shí)間后(圖10)，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)抗寒材料‘隴油7號(hào)’中BrapaHDT1基因在處理12 h的葉中表達(dá)量較高，BrapaHDA5-1/5-2/5-3和BrapaHDT2-1/2-2基因在處理12 h的根中表達(dá)量較高；耐寒性材料‘天油4號(hào)’葉中，在處理1 h后，BrapaHDA5-1/8/15-2和SRT2基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，6 h后BrapaHDA7-1/7-2/8以及24 h后BrapaHDA6-1/9和SRT1基因表達(dá)量較高，在根中，處理1 h后大部分基因都有上調(diào)表達(dá)，12 h后HDT3和24 h后BrapaHDA8/9基因出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)；在弱抗寒材料Lenox中除BrapaHDT1外，HD2亞家族其他3個(gè)基因在處理1 h的葉中表達(dá)量較高，24 h后RPD3/HDA1亞家族大部分基因有較高表達(dá)，在根中，RPD3/HDA1亞家族的個(gè)別基因在每個(gè)時(shí)間段都出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。表明這些基因可能在白菜型冬油菜響應(yīng)低溫脅迫方面起到一定作用。

2.8.2 0 ℃低溫脅迫下BrapaHDACs家族基因的表達(dá)分析在0 ℃冷脅迫不同時(shí)間后(圖11)，發(fā)現(xiàn)在強(qiáng)抗寒材料‘隴油7號(hào)’中RPD3/HDA1、SIR2和HD2三個(gè)亞家族的部分家族成員在處理24 h后的葉中出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，在根中幾乎每個(gè)時(shí)間段都有不同基因上調(diào)表達(dá)；在耐寒性材料‘天油4號(hào)’葉中，處理1 h后BrapaSRT2和BrapaHDT1基因表達(dá)較高，處理24 h后大部分基因有較高表達(dá)量，在根中，處理4、6和24 h后有個(gè)別基因表達(dá)較高；弱抗寒材料Lenox的葉在處理1 h后，表達(dá)量較高的基因主要為RPD3/HDA1亞家族成員，HDACs家族成員在其他時(shí)間段表達(dá)量變化不明顯。

2.8.3 -4 ℃低溫脅迫下BrapaHDACs家族基因的表達(dá)分析在-4 ℃冷脅迫不同時(shí)間后(圖12)，發(fā)現(xiàn)在強(qiáng)抗寒材料‘隴油7號(hào)’中BrapaHDA7-2基因在處理4 h后和BrapaHDA15-1在處理6 h的葉中表達(dá)量上調(diào)，BrapaHDA7-2、BrapaHDA5-1、SRT1和BrapaHDT2-2基因在處理24 h后的根中表達(dá)量較高；在耐寒性材料‘天油4號(hào)’中BrapaSRT2

基因在處理1 h后的葉中表達(dá)量較高，在處理12和24 h后HDACs絕大部分基因上調(diào)表達(dá)，處理12 h后大部分基因在根中的表達(dá)量較高，處理24 h后BrapaHDA2基因出現(xiàn)高表達(dá)；在弱抗寒材料Lenox中BrapaHDA2、BrapaHDA9和BrapaHDA19基因在處理4 h的葉中上調(diào)表達(dá)，BrapaHDA6-1在處理1 h和BrapaHDA6-2、SRT2處理4 h后的根中表達(dá)量較高。

3 討 論

3.1 TSA對(duì)白菜型冬油菜生長(zhǎng)發(fā)育特性和抗寒性指標(biāo)的影響

有研究表明在TSA處理下，組蛋白H3和H4乙?；綍?huì)被顯著提高[29]，本研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)品種經(jīng)TSA處理后，其根長(zhǎng)均受到抑制，這與胡歡等[30]TSA處理對(duì)擬南芥主根的生長(zhǎng)有抑制作用相一致。擬南芥種子被TSA處理后發(fā)現(xiàn)，加快了種子的萌發(fā)[31]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在低溫下經(jīng)TSA處理的種子萌發(fā)率有所升高，常溫下對(duì)根的抑制作用要強(qiáng)于低溫處理下的，表明TSA可能促進(jìn)了組蛋白乙?；δ艿陌l(fā)揮，在一定程度上緩解了低溫對(duì)種子萌發(fā)及生長(zhǎng)的影響。植物在感受低溫和其他脅迫后在體內(nèi)合成大量的保護(hù)性物質(zhì)，來(lái)調(diào)節(jié)生理生化變化使細(xì)胞滲透勢(shì)保持平衡來(lái)維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[32-33]。研究表明SOD、POD、CAT活性的升高和可溶性蛋白、游離脯氨酸的含量的積累與抗寒性呈顯著的正相關(guān)的關(guān)系[34]。本研究結(jié)果顯示，抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量在3種不同抗寒性油菜中出現(xiàn)不同程度的上升，TSA處理后有不同程度的升高和下降，Lenox中比較明顯，這可能與其材料的抗寒性有關(guān)，也表明TSA可能會(huì)激發(fā)抗寒基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)抵御抗寒能力，維持正常的生長(zhǎng)發(fā)育。

3.2 白菜型冬油菜HDACs基因家族特征分析

在番茄[35]、葡萄[36]和荔枝[37]等多種植物中，已經(jīng)對(duì)HDACs進(jìn)行了全基因組鑒定。本研究在白菜型冬油菜中共鑒定出21個(gè)HDACs基因，通過(guò)進(jìn)化樹構(gòu)建發(fā)現(xiàn)白菜型冬油菜HDACs基因家族歸類情況與龍眼[28]和毛果楊[38]中一致，分為3個(gè)亞家族。保守結(jié)構(gòu)顯示RPD3/HDA1亞家族內(nèi)motif數(shù)差異較大，表明該亞家族可能在進(jìn)化過(guò)程中產(chǎn)生了一定分化，而SIR2和HD2亞家族內(nèi)motif數(shù)是一致的，表明其亞家族成員更加保守且穩(wěn)定。亞細(xì)胞定位表明，HDACs家族成員主要分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，HD2亞家族4個(gè)成員中有2個(gè)基因分別位于葉綠體和過(guò)氧化物酶體，這與擬南芥和玉米中的HD2全部定位于細(xì)胞核有所不同[2]，可能這2個(gè)基因在白菜型冬油菜中發(fā)揮著區(qū)別于其他物種的功能，但還有待研究。

3.3 白菜型冬油菜HDACs基因家族成員在生長(zhǎng)發(fā)育和低溫脅迫方面的響應(yīng)

HDACs在植物生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮著重要作用，已有研究表明，擬南芥中AtHDA6在植物葉片發(fā)育和開花等方面發(fā)揮著重要作用[39]，香蕉中MaHDA6[40]參與其果實(shí)發(fā)育及成熟相關(guān)過(guò)程，HDA19[41]也參與調(diào)控開花，而本實(shí)驗(yàn)中BrapaHDA6-1和BrapaHDA19與其同源基因HDA6和HDA19有所不同，除參與不同白菜型冬油菜開花還參與生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)發(fā)育。其次BrapaHDA5-1、BrapaHDA7-2和BrapaHDA8在不同品種的不同部位有差異表達(dá)，表明不同基因在不同的抗寒性材料的生長(zhǎng)發(fā)育方面發(fā)揮著不同作用。

在逆境脅迫下，植物體內(nèi)響應(yīng)逆境脅迫的相關(guān)蛋白被激活，抗逆功能基因表達(dá)，因而提高植物的抗逆性[42]。先前研究顯示，HDA6在低溫脅迫中有所響應(yīng)[6]，本研究中BrapaHDA6-1和BrapaHDA6-2基因在3個(gè)品種中都有出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，表明該基因可能是參與其響應(yīng)低溫的關(guān)鍵基因。玉米R(shí)PD3/HDA1家族成員，在受到低溫脅迫時(shí)，表達(dá)量會(huì)上升[43]，而本實(shí)驗(yàn)中RPD3/HDA1家族部分成員在受到低溫脅迫時(shí)，在不同品種中也出現(xiàn)了差異表達(dá)，但有所不同的是HD2亞家族成員在受到低溫脅迫時(shí)，也表現(xiàn)出了不同程度的響應(yīng)。這些結(jié)果表明HDACs在白菜型冬油菜響應(yīng)低溫脅迫方面起到一定作用。但這些基因具體是如何調(diào)控冬油菜生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)低溫的，還需要后續(xù)進(jìn)行其功能的驗(yàn)證和調(diào)控機(jī)制的挖掘。

本研究利用TSA處理不同抗寒性白菜型冬油菜，發(fā)現(xiàn)其根長(zhǎng)受到抑制；低溫下噴施不同濃度TSA發(fā)現(xiàn)抗氧化酶的活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量都有所升高，在白菜型冬油菜基因組中初步鑒定出21個(gè)HDACs基因，不同組織部位和低溫脅迫表達(dá)情況結(jié)果表明，HDACs的3個(gè)亞家族部分成員在強(qiáng)抗寒材料‘隴油7號(hào)’、耐寒性材料‘天油4號(hào)’和弱抗寒材料Lenox的生長(zhǎng)發(fā)育及抗寒性方面起著關(guān)鍵作用。也為后續(xù)冬油菜HDACs基因家族功能驗(yàn)證及挖掘抗寒性關(guān)鍵基因的研究奠定一定基礎(chǔ)。