王盼盼，于洪巍

（1 浙江新和成股份有限公司，浙江 紹興 312500； 2 浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院生物工程研究所，浙江 杭州 310027）

天然酶絕大部分是具有催化功能的蛋白質(zhì)，也有少部分是RNA，而生物工程領(lǐng)域研究的酶大多都是蛋白質(zhì)。自然界中存在功能繁多的酶，而且生命體中大部分反應(yīng)都是酶催化反應(yīng)。通常，酶對底物具有良好的專一性，催化反應(yīng)高效，具有空間選擇性。而在非天然環(huán)境下，酶往往具有多功能性，比如底物多樣性、催化反應(yīng)多樣性和催化環(huán)境多樣性，這為酶的應(yīng)用提供了更多的可能。酶催化是利用天然或人工改造的酶（或含酶細(xì)胞）催化目標(biāo)底物合成所需產(chǎn)品的技術(shù)。本文主要介紹酶的篩選及改造技術(shù)，并總結(jié)了維生素及其衍生物合成過程中酶催化技術(shù)的應(yīng)用情況。

1 酶的篩選和改造

1.1 天然酶的篩選

1.1.1 傳統(tǒng)篩選

天然存在的酶種類繁多，大多不被人們熟知。我們可以通過采集天然樣品，如土壤、海水等，通過直接培養(yǎng)或分子生物學(xué)手段獲得特定功能的酶（或菌種）。比如利用透明圈（淀粉或脫脂奶粉）法篩選高產(chǎn)淀粉酶或蛋白酶的微生物［1-2］；利用剛果紅染色法從富含纖維素的土壤中篩選可降解纖維素的微生物，得到高產(chǎn)纖維素酶的菌種［3-4］；或利用含銅富集培養(yǎng)基從土壤中篩選具有良好漆酶活性的芽孢桿菌應(yīng)用于染料廢水脫色［5-6］。此類傳統(tǒng)方法限制條件較少但篩選效率低，所獲得的酶催化效率大多無法達(dá)到工業(yè)生產(chǎn)要求。然而，傳統(tǒng)篩選仍然是現(xiàn)代生物工程不可或缺的技術(shù)手段，一是自然界中包含太多未知的微生物或酶，可能獲得稀有功能的酶，比如能降解有機(jī)磷農(nóng)藥的有機(jī)磷水解酶［7］，能催化碳?xì)滏I活化的過氧化酶［8］等。二是極端微生物的存在使得篩選出具有良好耐受能力的酶成為可能，比如耐熱、耐鹽或耐極端pH的酶等［9-10］。

隨著基因測序和合成技術(shù)日趨成熟，生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫所包含的基因和基因組數(shù)據(jù)已十分豐富，常用的數(shù)據(jù)庫包括NCBI、KEGG、PDB、UniProt等。通過基因序列比對及生物信息學(xué)挖掘，可直接從數(shù)據(jù)庫中分析得到相關(guān)功能的酶基因［11-12］。將這些基因?qū)胩囟ǖ乃拗鲗崿F(xiàn)酶蛋白表達(dá)，可獲得表達(dá)特定酶的菌株。從已有數(shù)據(jù)庫中直接篩選目標(biāo)酶的優(yōu)勢在于：利用數(shù)據(jù)庫資源和生物信息學(xué)工具可對目標(biāo)酶進(jìn)行預(yù)測和分析，減輕了傳統(tǒng)天然篩選的煩瑣工作；不用考慮微生物的可培養(yǎng)性問題，十分適用于不可培養(yǎng)微生物中酶基因的挖掘［13］。然而，相對于天然微生物資源，數(shù)據(jù)庫資源仍然有限，且大多數(shù)基因功能未知。因此，將傳統(tǒng)天然篩選及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析兩種方式結(jié)合才是酶篩選的最有效方式［14］。

1.1.2 高通量篩選

為了提高酶的篩選效率，可在酶活表征反應(yīng)的基礎(chǔ)上，建立以特征反應(yīng)為基礎(chǔ)的篩選方法。通過結(jié)合高通量篩選設(shè)備，如QPix菌落挑選設(shè)備，微流控設(shè)備［15］、流式細(xì)胞儀［16］、高通量搖床等，實現(xiàn)篩選過程的半自動化甚至自動化，建立起酶的高通量篩選方法。高通量篩選樣本可以由天然樣品中獲得，如土壤、海水等，也可以是通過誘變得到的突變體酶庫，或者是通過隨機(jī)突變或基因重排等分子生物學(xué)手段構(gòu)建的人工突變體庫。常見高通量篩選方法包括基于熒光或熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯色反應(yīng)，通過檢測熒光強(qiáng)度挑選出高活力的產(chǎn)酶菌株［17-18］，或是基于酸堿指示劑或其他化學(xué)顯色反應(yīng)，通過檢測顏色變化篩選高酶活菌株［19］。

1.2 酶的定向進(jìn)化

自然界中天然存在的酶在催化活性、穩(wěn)定性或其他反應(yīng)特性方面往往無法滿足工業(yè)化需求。為了優(yōu)化天然酶的催化特性，我們需要對酶本身進(jìn)行非理性改造或理性改造。定向進(jìn)化（the directed evolution）是非理性改造最常用的技術(shù)。定向進(jìn)化的概念和技術(shù)由France H.Arnold 教授于1993 年提出。定向進(jìn)化的本質(zhì)是模擬自然生物的突變和選擇，通過人為構(gòu)建酶基因突變庫，并建立有效的篩選方法，積累正向突變，得到目標(biāo)突變體酶［20］。France H.Arnold 教授等［21］通過連續(xù)反復(fù)地對枯草桿菌蛋白酶E（Subtilisin E）編碼基因進(jìn)行隨機(jī)突變，并經(jīng)逐步積累正向突變，最終獲得可在高濃度有機(jī)溶劑二甲基甲酰胺（DMF）中穩(wěn)定存在且表現(xiàn)出活性的突變體。隨著高通量篩選技術(shù)的發(fā)展，定向進(jìn)化可以和高通量篩選技術(shù)相結(jié)合，通過大規(guī)模建庫（酶的突變體庫），結(jié)合高通量篩選技術(shù)，可快速獲得正向突變株［22］。

1.3 酶的理性改造

酶的理性改造主要是以酶分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過分析酶功能單元和酶催化機(jī)制，采取定點突變或飽和突變的方式改造酶，獲得催化性能優(yōu)良的酶突變體。只有對酶的結(jié)構(gòu)和功能有較為深入的理解才能設(shè)計出性能更加優(yōu)良的新酶［23］。隨著對自然界天然酶的結(jié)構(gòu)研究工作的不斷開展，酶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫越來越豐富，但還有大部分酶的晶體結(jié)構(gòu)沒有被解析，難以滿足理性改造的需要。另一方面，生物信息學(xué)和計算機(jī)輔助設(shè)計也不斷發(fā)展，人們可以通過序列比對、同源建模及分子動力學(xué)模擬等，分析酶的保守區(qū)和活性中心，也可以進(jìn)行分子對接分析酶和底物的可能的結(jié)合方式和狀態(tài)，通過這些信息對酶進(jìn)行重新設(shè)計改造，大大加速了酶理性改造進(jìn)程［24-25］。

2 酶催化合成維生素或其中間體

目前，除維生素B2和維生素B12采用發(fā)酵法合成，其他維生素都是采用化學(xué)法或者化學(xué)法耦合酶法合成。其中，維生素B3化學(xué)合成路線的最后一步是采用腈水合酶催化煙腈生成煙酰胺，這是工業(yè)上腈水合酶的主要應(yīng)用之一。維生素B5化學(xué)合成過程中涉及D/L-泛解酸內(nèi)酯的光學(xué)拆分步驟，工業(yè)上一般是通過篩選酯水解酶（或者可產(chǎn)酯水解酶的菌株）進(jìn)行手性選擇性催化從而實現(xiàn)拆分。另外，近幾年，維生素B5的另一個重要前體β-丙氨酸也成功實現(xiàn)了酶催化工業(yè)化生產(chǎn)，與化學(xué)法相比具有明顯的成本優(yōu)勢。維生素C兩步發(fā)酵法已工業(yè)化近50 年，隨著對生物合成相關(guān)酶的研究愈發(fā)深入，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵機(jī)制與酶催化十分接近，這些發(fā)現(xiàn)將推動維生素C 發(fā)酵法的二次革新。維生素D3一般采用化學(xué)法合成，然而活性維生素D3（羥基化維生素D3）的化學(xué)合成非常復(fù)雜，大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化困難。采用羥基化酶進(jìn)行維生素D3羥基化合成已展示出潛力，有望在較短的時間實現(xiàn)工業(yè)化并替代化學(xué)法。與化學(xué)法相比，酶法一般具有反應(yīng)條件溫和、步驟簡便、選擇性高等特點，有時甚至能夠催化化學(xué)法難以進(jìn)行的反應(yīng)。目前酶法的工業(yè)應(yīng)用包括氧化還原、水解、酯化等反應(yīng)，酶的應(yīng)用形式也多種多樣，如固定化或游離酶、固定化或游離細(xì)胞等，且應(yīng)用范圍正不斷擴(kuò)展［26-27］。下面將介紹酶催化技術(shù)在上述幾種維生素合成過程中的應(yīng)用情況。

2.1 維生素B3

維生素B3又稱為煙酸，煙酸在體內(nèi)將會代謝生成煙酰胺，即尼克酰胺。目前市場上產(chǎn)品以煙酰胺為主。煙酰胺全球產(chǎn)能超過10 萬噸/年，主要生產(chǎn)企業(yè)為瑞士龍沙、美國凡特魯斯、印度吉友聯(lián)等。由于3-甲基吡啶或3-氰基吡啶原料制約，國內(nèi)企業(yè)長期未實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)煙酰胺。煙酰胺在蛋白質(zhì)和糖的新陳代謝中起重要作用，被廣泛應(yīng)用于飼料（67%）、醫(yī)藥化妝品（20%）和食品（13%）領(lǐng)域。煙酰胺通常以3-甲基吡啶為原料通過氨氧化法合成，但該化學(xué)法收率低且有副產(chǎn)物煙酸。目前工業(yè)上采用化學(xué)法耦合酶催化法的方式合成煙酰胺，具體是以3-甲基吡啶為原料，通過化學(xué)催化合成3-氰基吡啶，3-氰基吡啶再經(jīng)過腈水合酶催化生成煙酰胺（圖1）。

圖1 煙酰胺的合成步驟Fig.1 Process for nicotinamide synthesis

1980 年，日本京都大學(xué)Asano 等［28］發(fā)現(xiàn)微生物Rhodococcus rhodochrousJ1 可催化腈類化合物水合生成酰胺，并將起作用的酶命名為腈水合酶。不久之后，腈水合酶即應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)丙烯酰胺［29］。腈水合酶來源主要為細(xì)菌，如紅球菌屬、諾卡氏菌屬、假單胞菌屬、節(jié)桿菌屬、擬無枝酸菌屬等。腈水合酶根據(jù)金屬離子依賴性不同，可分為三類，一是非血紅素鐵離子依賴型，如Rhodococcus erythropolisA4［30］、Pseudomonas chlororaphisB23［31］來源的腈水合酶；二是非類咕啉鈷離子依賴型，如Rhodococcus.rhodochrousJ1［32］來源的腈水合酶；三是其他金屬離子依賴型的腈水合酶，這類腈水合酶目前發(fā)現(xiàn)較少，如鋅離子或銅離子依賴型［33］。除了丙烯酰胺以外，腈水合酶工業(yè)化應(yīng)用最廣的是煙酰胺的生產(chǎn)，早在1988年，日本研究者利用Rhodococcus.rhodochrousJ1 全細(xì)胞作為催化劑，實現(xiàn)催化3-氰基吡啶生產(chǎn)煙酰胺，催化收率達(dá)100%，沒有煙酸或其他副產(chǎn)物生成［34］。

2.2 維生素B5

維生素B5，又稱D-泛酸或遍多酸，商品形式主要為D-泛酸鈣。維生素B5在生物體內(nèi)廣泛存在，主要用于合成輔酶A，并參與糖類、脂肪及蛋白質(zhì)代謝。全球維生素B5產(chǎn)能約2.8 萬噸，國內(nèi)產(chǎn)能占全球約80%份額，主要生產(chǎn)企業(yè)包括億帆醫(yī)藥、新發(fā)藥業(yè)、兄弟科技等。維生素B5是人和動物生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)元素，主要應(yīng)用于動物飼料、食品添加劑及醫(yī)藥原料藥，其中動物飼料應(yīng)用占比達(dá)75%。

維生素B5主要采用化學(xué)法合成，合成過程涉及DL-泛內(nèi)酯的手性拆分。通過化學(xué)法手性拆分DL-泛內(nèi)酯需采用手性拆分劑，如手性氨、喹啉化合物或二甲馬錢子堿等，這些拆分劑價格昂貴、有毒且分離困難［35］。19 世紀(jì)70 年代，生物科學(xué)家發(fā)明了多種類型的酶催化拆分DL-泛內(nèi)酯或DL-泛解酸的方法。主要包括：①選擇性水解L-泛解酸內(nèi)酯，回收未被水解的D-泛解酸內(nèi)酯用于下游維生素B5的合成。水解產(chǎn)物L(fēng)-泛解酸也可以回收，通過消旋及內(nèi)酯化反應(yīng)重新用于水解拆分。②選擇性水解D-泛解酸內(nèi)酯，回收生成的D-泛解酸，重新酯化得到高純D-泛解酸內(nèi)酯。第1 種方法L-泛解酸內(nèi)酯水解酶活性不高，水解不完全將導(dǎo)致回收的D-泛解酸內(nèi)酯不純，而第2種方法不要求水解徹底，回收的D-泛解酸內(nèi)酯純度高，目前工業(yè)上廣泛應(yīng)用第2 種方法實現(xiàn)DL-泛解酸內(nèi)酯拆分［36］。

D-泛解酸內(nèi)酯水解酶在絲狀真菌中存在較為廣泛，如鐮刀菌屬（Fusariumsp.）、赤霉菌屬（Gibberellasp.）、黏帚霉菌屬（Gliocladiumsp.）、黑曲霉屬（Aspergillussp.）、青霉屬（Penicilliumsp.）、根霉菌屬（Rhizopussp.）、短梗霉屬（Aureobasidiumsp.）等［37］。傳統(tǒng)篩選利用溴百里酚藍(lán)等酸堿指示劑，可從土壤中篩選出具有D-泛解酸內(nèi)酯水解酶活性的菌株。再通過化學(xué)試劑、紫外或常壓室溫等離子體（atmospheric room temperature plasma，ARTP）誘變，可篩選得到高D-泛解酸內(nèi)酯水解酶活性的菌株。1998 年，日本第一制藥首次將酶催化拆分DL-泛解酸內(nèi)酯應(yīng)用于工業(yè)化［38］。2001 年，江南大學(xué)孫志浩團(tuán)隊［39］也成功篩選出具有高效水解D-泛解酸內(nèi)酯活性的串珠鐮孢霉菌，并在浙江鑫富藥業(yè)股份有限公司得到工業(yè)化應(yīng)用。

維生素B5合成反應(yīng)的最后一步是通過D-泛解酸內(nèi)酯和β-丙氨酸（鈣）進(jìn)行縮合反應(yīng)生成D-泛酸（鈣）。β-丙氨酸是維生素B5的直接前體，是目前已知唯一天然存在的β-氨基酸。β-丙氨酸雖然不參與蛋白質(zhì)合成，但在生物體內(nèi)是肌肽、鵝肌肽等肌源活性肽，以及輔酶A 合成的重要前體。β-丙氨酸作為增強(qiáng)肌肉耐力的運(yùn)動營養(yǎng)補(bǔ)充劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床營養(yǎng)領(lǐng)域。另外，β-丙氨酸可提高動物生產(chǎn)性能，調(diào)控肌肉生長和肌源活性肽含量，改善肉品質(zhì)量，被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑領(lǐng)域。

β-丙氨酸合成路線可分為3 種方式，共包括6 種合成路線，分別是2 種化學(xué)合成法、3 種酶催化法和1種發(fā)酵法路線。目前化學(xué)合成法和酶催化法均在工業(yè)化生產(chǎn)上得到廣泛應(yīng)用。丙烯腈化學(xué)合成路線工藝最成熟，但缺點明顯，比如有廢鹽產(chǎn)生，酸堿用量大等［40］。丙烯酸化學(xué)合成路線工藝相對丙烯腈路線更簡潔，無廢鹽產(chǎn)生，相對更優(yōu)［41］。發(fā)酵法主要是通過改造大腸桿菌合成β-丙氨酸，由于成本問題目前還沒有實現(xiàn)工業(yè)化［42-43］。

酶催化合成β-丙氨酸現(xiàn)有路線包括3 條，分別以富馬酸、天冬氨酸和丙烯酸為底物，通過酶催化合成β-丙氨酸。在生物體內(nèi)，β-丙氨酸合成途徑的最后兩步即是由天冬氨酸酶催化富馬酸合成天冬氨酸，再由天冬氨酸-α-脫羧酶催化天冬氨酸合成β-丙氨酸。因此，以酶催化生產(chǎn)β-丙氨酸最直接的方式就是利用富馬酸或者天冬氨酸為底物合成β-丙氨酸［44］。比較兩種酶法，富馬酸路線的問題是需要兩種酶催化，催化收率難以保證，而天冬氨酸路線原料成本高。另外，兩種酶催化路線有天然缺陷需要克服：①都需要天冬氨酸-α-脫羧酶，該酶活性水平低，需要進(jìn)行改造；②天冬氨酸-α-脫羧酶催化脫羧反應(yīng)，整個過程將損失1 分子CO2，原子經(jīng)濟(jì)性差；③和丙烯酸相比，富馬酸和天冬氨酸原料成本相對較高。

2017 年中科院吳邊團(tuán)隊通過計算機(jī)分子模擬，發(fā)現(xiàn)了能夠高效催化丙烯酸合成β-丙氨酸的天冬氨酸酶突變體［45］；因此發(fā)明了以丙烯酸為底物的酶催化法生產(chǎn)β-丙氨酸，并實現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用（圖2）［46-47］。與富馬酸或天冬氨酸為底物的酶法相比，丙烯酸酶催化法的優(yōu)勢明顯，比如原料便宜，一步酶催化理論收率高。該方法通過對天冬氨酸酶改造，成功拓寬了酶本身底物譜，使突變體酶催化本身完全不能催化的新底物，縮短了天然酶促反應(yīng)合成步驟，成功代替了化學(xué)法。

圖2 酶催化合成β-丙氨酸Fig.2 Synthesis of β-alanine through the enzymatic catalysis

2.3 維生素C

維生素C，即L-抗壞血酸，是人必需的維生素。維生素C具有很強(qiáng)的抗氧化能力，因其可治療壞血病而廣為人知。維生素C被廣泛應(yīng)用于食品添加劑、動物飼料和醫(yī)藥化妝品領(lǐng)域，其中食品添加劑應(yīng)用占比達(dá)70%。20 世紀(jì)70 年代以前，維生素C的合成一直采用羅氏化學(xué)法，合成路線復(fù)雜且收率低。1973 年，中科院聯(lián)合沈陽藥科大學(xué)通過傳統(tǒng)篩選的方法發(fā)現(xiàn)能將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸（2-keto-L-gulonic acid，2-KLG）的微生物［48］。此后，中國科學(xué)家通過誘變等手段不斷優(yōu)化菌株，最終開創(chuàng)了兩步發(fā)酵法產(chǎn)維生素C。目前，我國維生素C 產(chǎn)能已達(dá)20 萬噸/年，占全球90%以上，主要生產(chǎn)企業(yè)包括石藥集團(tuán)、魯維制藥、帝斯曼江山、東北制藥等。

兩步發(fā)酵法第1步是利用氧化葡萄糖酸桿菌將D-山梨醇催化生成L-山梨糖，具體起催化作用的是D- 山梨醇脫氫酶， 輔酶為吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）；第2步是利用普通生酮基古龍酸菌和巨大芽孢桿菌（或其他芽孢桿菌）混菌發(fā)酵L-山梨糖生成2-KLG，具體起催化作用的是普通生酮基古龍酸菌中的L-山梨糖/山梨酮脫氫酶，輔酶也是PQQ［49］。最終，發(fā)酵得到的2-KLG可通過酯化及內(nèi)酯化反應(yīng)合成維生素C。

2-KLG 的發(fā)酵法實際上僅有2 種（或3 種）酶促反應(yīng)［50］。但工業(yè)上一直采用兩步發(fā)酵而不是催化反應(yīng)合成維生素C，原因總結(jié)如下：①該兩步發(fā)酵所涉及的酶都是PQQ 依賴的脫氫酶，PQQ 是除黃素類和腺苷類輔酶以外的第3 類輔酶，能合成PQQ 的微生物相對較少，導(dǎo)致外源活性表達(dá)2-KLG 合成相關(guān)脫氫酶較困難［51-52］；②PQQ 的合成（氧化還原循環(huán)）和細(xì)胞呼吸鏈耦合，采用酶催化（或全細(xì)胞催化）可能導(dǎo)致輔酶供給不足，降低催化效率［53-54］；③D-山梨醇或L-山梨糖轉(zhuǎn)化的同時提供細(xì)胞生長所需能量，D-山梨醇或L-山梨糖既作催化底物也作為發(fā)酵碳源，采用發(fā)酵法對原料利用更有效率，因而比酶催化更有優(yōu)勢。2-KLG的發(fā)酵法生產(chǎn)要想進(jìn)一步革新，最有潛力的研究方向是將2-KLG 的兩步發(fā)酵合為一步［55］。這需要深入理解上述酶催化反應(yīng)機(jī)制，將酶促反應(yīng)通過基因工程手段整合到單個菌株中，或者通過混菌發(fā)酵山梨醇生產(chǎn)2-KLG。目前，江南大學(xué)周景文團(tuán)隊［56］已實現(xiàn)一步發(fā)酵合成2-KLG，產(chǎn)量達(dá)72.4 g/L。

2.4 維生素D3

維生素D3，即膽鈣化醇，是維生素D 的一種，可由7-脫氫膽固醇經(jīng)紫外線照射生成。維生素D3可治療甲狀腺機(jī)能衰退、骨質(zhì)疏松癥和慢性腎衰竭等疾病。全球維生素D3產(chǎn)能約1 萬噸/年，我國產(chǎn)能約占全球產(chǎn)能75%。維生素D3生產(chǎn)企業(yè)包括浙江花園生物、荷蘭帝斯曼、浙江新和成等。

維生素D3本身沒有生物活性，而是在體內(nèi)（主要是肝臟和腎臟）經(jīng)羥化反應(yīng)生成活性維生素D3并發(fā)揮其生理作用?；钚跃S生素D3包括3 種類似物，1α（OH）VD3、25（OH）VD3和1α，25（OH）VD3［57］。活性維生素D3可通過化學(xué)合成法和酶催化法合成?；瘜W(xué)法合成途徑復(fù)雜，需要多步的基團(tuán)保護(hù)和脫保護(hù)，涉及光照、開環(huán)和異構(gòu)化反應(yīng)等合成步驟，污染嚴(yán)重，大規(guī)模生產(chǎn)十分困難。而酶法具有催化位點特異性，P450 羥化酶能特異性催化維生素D3相應(yīng)位點羥基化。因此，挖掘并改造P450 羥化酶實現(xiàn)維生素D3高效羥基化反應(yīng)是實現(xiàn)活性維生素D3大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵。

酶催化法通常采用哺乳動物或微生物來源的P450 羥化酶催化維生素D3羥基化合成活性維生素D3（圖3）。自Horsting 和Deluca［58］于1969 年發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟勻漿可催化維生素D3的C-25 位羥基化后，越來越多的羥化酶被發(fā)現(xiàn)。1991 年，Sasaki等［59-60］先后從鏈霉菌屬和無枝酸菌屬中篩到多株可轉(zhuǎn)化維D3合成25（OH）VD3或1α，25（OH）VD3的菌株。其中，自養(yǎng)無枝酸菌FEM BP-1573 具有最高的活性。在200 L 發(fā)酵罐中，自養(yǎng)無枝酸菌FEM BP-1573 能夠催化合成25（OH）VD3和1α，25（OH）VD3，產(chǎn)量分別達(dá)到8.3 mg/L 和0.17 mg/L。2009 年，F(xiàn)ujii 等［61］也是從一株自養(yǎng)無枝酸菌［又名自養(yǎng)假諾卡氏菌（Pseudonocardia autotrophicaNBRC 12743）］分離出P450 單加氧酶CYP107（Vdh），發(fā)現(xiàn)該酶能夠?qū)SD3進(jìn)行1位與25位羥化。其團(tuán)隊對該酶進(jìn)行了異源表達(dá)與定向進(jìn)化，得到了比野生酶活性高約20 倍的突變體酶Vdh-K1，該突變體酶具有一定的工業(yè)化潛力。

圖3 P450羥化酶催化維生素D3合成25-羥基維生素D3Fig.3 Synthesis of 25(OH)VD3 from vitamin D3 under the catalysis of P450 hydroxylase

3 酶催化合成維生素衍生物

大多數(shù)維生素都是天然的抗氧化劑，易被氧化，存儲困難且不利于后續(xù)加工。另外，維生素因為溶解特性不同，工業(yè)應(yīng)用范圍受限。為此，工業(yè)上常常將維生素制備成各種衍生物，在保留維生素本身生物活性的同時，提高其穩(wěn)定性、溶解性或其他特性。維生素衍生物中，最常見的是酯類衍生物和糖苷類衍生物。在早期研究中，上述衍生物幾乎都是化學(xué)合成。隨著酶工程研究進(jìn)展，采用酶催化法合成維生素衍生物的實例越來越多，也有不少工業(yè)化案例，如維生素A棕櫚酸酯、維生素C棕櫚酸酯、維生素C葡萄糖苷等。以下將對酶催化法合成維生素衍生物的相關(guān)研究作總結(jié)，以期推動酶催化法在維生素衍生物合成中的研究及工業(yè)化應(yīng)用。

3.1 維生素A衍生物

維生素A（vitamin A）主要包括維生素A1和維生素A2兩種。維生素A1，即視黃醇（或抗干眼病因子），是一個具有脂環(huán)的不飽和一元醇，主要來源于哺乳動物及咸水魚的肝臟中。維生素A2，即3-脫氫視黃醇，主要來源于淡水魚的肝臟中。由于維生素A2的活性比較低，所以通常所說的維生素A 是指維生素A1。植物一般不能合成維生素A，但植物來源的β-胡蘿卜素及其他胡蘿卜素可在人體內(nèi)合成維生素A1［62］。維生 素A 及 其 衍生 物（如視黃醛或視黃酸等）可促進(jìn)免疫球蛋白的合成，具有維持正常視覺功能，維持骨骼正常生長發(fā)育，促進(jìn)細(xì)胞生長與生殖和抑制腫瘤生長等功能［63］。

維生素A 是脂溶性維生素，在空氣中極不穩(wěn)定，紫外照射下易失活，且對皮膚有刺激性，這些特征限制了維生素A 在醫(yī)藥及化妝品行業(yè)的應(yīng)用。因此，工業(yè)上通常將其制成維生素A 衍生物以克服上述缺點［64］。維生素A 的商品形式通常是維生素A的酯類衍生物。最常見的維生素A酯類衍生物是維生素A醋酸酯，而維生素A醋酸酯結(jié)構(gòu)仍然不穩(wěn)定，一般工業(yè)上會進(jìn)一步將維生素A 醋酸酯制備成維生素A丙酸酯、維生素A棕櫚酸酯、維生素A 亞油酸酯、維生素A 乳酸酯等。除維生素A棕櫚酸酯和維生素A乳酸酯外，上述維生素A衍生物通常采用化學(xué)法合成［65］。傳統(tǒng)化學(xué)法合成維生素A 棕櫚酸酯需要先合成棕櫚酰氯，而棕櫚酰氯的合成需要使用有毒試劑，如二氯亞砜、光氣或三光氣，最終由棕櫚酰氯與維生素A 反應(yīng)生成維生素A棕櫚酸酯。

隨著酶催化法研究的日益深入，利用脂肪酶催化合成維生素A 棕櫚酸酯的應(yīng)用已較為成熟。劉園等［66］通過對諾維信固定化脂肪酶（Novozym 435）催化維生素A 棕櫚酸酯合成的反應(yīng)條件進(jìn)行了較為詳細(xì)的考察，在以維生素A 醋酸酯及棕櫚酸為底物的條件下，實現(xiàn)催化轉(zhuǎn)化率91%。北京化工大學(xué)譚天偉團(tuán)隊［67］在脂肪酶的開發(fā)和應(yīng)用方面做了系統(tǒng)研究，開發(fā)了來源于Candidasp.99-125的新型脂肪酶，并采用固定化方式合成維生素A棕櫚酸酯，可實現(xiàn)轉(zhuǎn)化率達(dá)83%，且連續(xù)使用5 次以上。浙江大學(xué)于洪巍團(tuán)隊［68-69］通過篩選得到酯酶E.coliBioH，利用該酯酶先催化維生素A 醋酸酯和低級醇生成維生素A醇，再催化維生素A醇與棕櫚酸酯反應(yīng)合成維生素A 棕櫚酸酯，反應(yīng)總收率可達(dá)95%。并且，通過固定化酯酶實現(xiàn)酶的反復(fù)套用，大大降低了維生素A 棕櫚酸酯的生產(chǎn)成本，成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

相對而言，酶法合成維生素A 乳酸酯的研究較少，阮暉等［70］通過利用酵母展示脂肪酶成功催化合成維生素A 乳酸酯。高靜等［71］采用脂肪酶Novozym 435，在混合溶劑叔丁醇/正己烷=3∶2（體積比）條件下催化合成維生素A 乳酸酯，收率達(dá)52.19%。可以發(fā)現(xiàn)，諾維信公司［72］開發(fā)的來源于南極假絲酵母（Candida antarcticaB） 的Novozym 435，是研究中最常用的脂肪酶之一。Novozym 435是商品化固定化酶，穩(wěn)定性好，但對于不同的底物催化活性不一定高。自然界中脂肪酶存在廣泛，為得到高活性且具有工業(yè)化價值的脂肪酶，需針對不同底物的酯化反應(yīng)對脂肪酶進(jìn)行篩選或改造。

3.2 維生素C衍生物

維生素C在空氣中容易被氧化，限制了維生素C的工業(yè)化應(yīng)用。工業(yè)上常將維生素C制備成維生素C衍生物，在保留維生素C抗氧化活性的同時拓展其應(yīng)用范圍。常見維生素C衍生物包括維生素C鹽類（比如維生素C 鈉和維生素C 鈣），維生素C 糖苷類（比如維生素C葡萄糖苷）和維生素C酯類［比如維生素C磷酸酯（鎂）、維生素C棕櫚酸酯、維生素C硬脂酸酯等］［73-74］。維生素C鹽類一般以化學(xué)法直接合成，而維生素C葡萄糖苷一般以酶法合成。因脂肪酶的廣泛存在，應(yīng)用越發(fā)成熟，維生素C酯類也越來越多采用酶法合成。不同種類的維生素C衍生物抗氧化作用有差別，應(yīng)用范圍也有所不同［75］。

3.2.1 維生素C糖苷類

維生素C 葡萄糖苷有多種同分異構(gòu)體，包括L-抗壞血酸-2-α-葡萄糖苷（AA-2αG）、L-抗壞血酸-2-β-葡萄糖苷（AA-2βG）、L-抗壞血酸-5-葡萄糖苷（AA-5G）和L-抗壞血酸-6-葡萄糖苷（AA-6G）。其中，AA-2αG 因具有良好的熱穩(wěn)定性和生物活性受到廣泛關(guān)注，且已實現(xiàn)酶法工業(yè)生產(chǎn)。AA-2αG 進(jìn)入細(xì)胞后，可在α-葡萄糖苷酶的作用下被水解成維生素C并發(fā)揮生理活性［76］。另外，AA-2αG 還具有抗紫外線、抑制黑色素生成等美白功效，主要應(yīng)用于化妝品行業(yè)［77］。

1990年，日本林原生物化學(xué)研究所與岡山大學(xué)藥學(xué)系首次發(fā)現(xiàn)了AA-2αG，并利用生物方法大量合成了該維生素C衍生物［78-79］。迄今為止，AA-2αG主要采用酶法將葡萄糖基轉(zhuǎn)移到維生素C形成糖苷鍵合成。葡萄糖苷鍵來源（糖基供體）包括環(huán)糊精和蔗糖等?？纱呋铣葾A-2αG的酶包括環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶（cyclomaltodextrin glucanotransferase，CGtase，EC 2.4.1.19）、蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase，EC 2.4.1.7）、α-葡萄糖苷 酶（α-glucosidase，EC 3.2.1.20）、α-淀粉酶（α-amylase，EC 3.2.1.1）、葡聚糖蔗糖酶（dextransucrase，EC 2.4.1.5）、β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC 3.2.1.21）等。

CGtase 本身可以催化淀粉水解成環(huán)糊精，同時也是AA-2αG 工業(yè)化生產(chǎn)用酶，可以利用α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精或淀粉作為糖基供體合成AA-2αG。由于原料價格及催化效率的原因，β-環(huán)糊精在AA-2αG 工業(yè)生產(chǎn)中最常用。然而β-環(huán)糊精水溶性較差，限制了CGTase 酶促反應(yīng)。CGtase 可分為嗜常溫（mesophilic）和嗜熱（thermophilic）兩大類，常見來源有芽孢桿菌（Bacillus）、類芽孢桿菌（Paenibacillus）、梭菌（Clostridium）、克雷伯氏菌（Klebsiella）、微球菌（Micrococcus）、嗜熱 厭 氧 桿 菌（Thermoanaerobacter）、 熱 球 菌（Thermococcus）等。其中，來源于脂肪嗜熱芽孢桿菌（Bacillus stearothermphilus）［80］，環(huán)狀芽孢桿菌（Bacillus circulansstrain 251）［81-82］和浸麻類芽孢桿菌（Paenibacillus macerans）［83］的CGtase 研究較多，且已解析出晶體結(jié)構(gòu)。

CGtase 不僅可以催化糖基轉(zhuǎn)移合成AA-2G，也可以合成熊果苷、甜菊糖苷或橙皮苷等。大多數(shù)天然的CGtase 酶催化活性并不高，且有副產(chǎn)物AA-5G 或AA-6G 生成。另外，CGtase 的催化產(chǎn)物可能包括多個葡萄糖基（AA-2αGn），需要用糖化酶等進(jìn)一步水解成AA-2αG［84］。李江華等［85］通過響應(yīng)面優(yōu)化環(huán)麥芽糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶催化合成AA-2αG，在36.5 ℃，pH5.4 條件下實現(xiàn)AA-2αG 的產(chǎn)量為9.76 g/L，接近預(yù)測理論產(chǎn)量。事實證明，僅依靠自然篩選很難得到高活性且高特異性的CGtase。要想提高CGtase 的催化活性和產(chǎn)物特異性，需要對酶進(jìn)行改造。根據(jù)現(xiàn)有報道，對CGtase的改造方式一般有3種，定點突變、末端修飾和融合表達(dá)。江南大學(xué)劉龍團(tuán)隊對此有較豐富的研究，他們通過對來源于浸麻類芽孢桿菌的CGTase 進(jìn)行多位點組合突變獲得高活性突變體（K47L/Y89F/N94P/D196Y）使AA-2αG產(chǎn)物濃度達(dá)2.23 g/L，與野生酶相比提高85.8%［86］；在CGTase蛋白N 端融合雙親短肽SAP6，以淀粉作為糖基供體條件下，酶的活性較原始酶提高236%［87］；另外通過融合糖基結(jié)合結(jié)構(gòu)域與CGTase 蛋白，以淀粉作為糖基供體條件下，可使催化活性提高4 倍［88］。根據(jù)陶秀梅等［89］綜述，目前最有潛力的CGTase來源菌株是B.stearothermphilus，而α-環(huán)糊精是相對最合適的糖基供體?？紤]到成本和活性，目前工業(yè)上主要以β-環(huán)糊精作為糖基供體

蔗糖磷酸化酶主要來源于長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）［90-91］、腸 膜 明 串 珠 菌（Leuconostoc mesenteroides）、 嗜 糖 假 單 胞 菌（Pseudomonas saccharophila）等。與CGTase 酶相比，蔗糖磷酸化酶的催化合成AA-2αG 的活性較低，但蔗糖磷酸化酶利用廉價蔗糖作為糖基供體，同樣具有研究價值和工業(yè)化潛力。

AA-2βG是日本學(xué)者Toyodaono等從中國的寧夏枸杞（Lycium barbarumL.）和北方枸杞（Lycium chineseM.）干果中分離純化得到一種新型、穩(wěn)定、純天然的AA-2αG同分異構(gòu)體。研究發(fā)現(xiàn)，AA-2βG具有和維生素C 類似的生理功能。AA-2βG 的合成研究較少，2009 年，謝若男［92］從產(chǎn)纖維素酶菌種中篩選到產(chǎn)糖苷轉(zhuǎn)移酶的菌種，證實其具有催化合成AA-2βG 的能力，但產(chǎn)量不高，還有待進(jìn)一步研究。

3.2.2 維生素C酯類

維生素C的酯類衍生物也有采用酶法合成的研究，最常見的是采用脂肪酶（或產(chǎn)脂肪酶的微生物）合成維生素C 磷酸酯或維生素C 棕櫚酸酯。1996年，F(xiàn)ujio等［93］發(fā)現(xiàn)維生素C 與含焦磷酸鹽的水溶液在微生物產(chǎn)生的酶催化作用下可發(fā)生酯化反應(yīng)生成維生素C磷酸酯，其中，利用產(chǎn)黃纖維單胞菌（Cellulomonas flavigena）做催化反應(yīng)，維生素C磷酸酯終濃度可達(dá)8.8 g/L，具有一定工業(yè)應(yīng)用潛力。據(jù)2001 年相關(guān)報道，日本Kyowa Hakko Kogyo公司開發(fā)了一條酶法合成維生素C 磷酸酯的路線，該酶催化法是以維生素C和磷酸為原料，利用銅綠假單胞菌作全細(xì)胞催化，再經(jīng)氫氧化鈉中和得到維生素C磷酸酯鈉鹽［94］。

維生素C棕櫚酸酯的酶法合成對反應(yīng)條件（特別是溶劑）有很高的要求。由于維生素C易溶于水而棕櫚酸（酯）不溶于水，因此反應(yīng)溶劑需要對維生素C和棕櫚酸（酯）都有一定的溶解性，目前常用的溶劑是叔戊醇、叔丁醇、正己烷、丙酮等。不同的溶劑反應(yīng)轉(zhuǎn)化率不同，根據(jù)大量文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)在使用相同的脂肪酶作催化劑時，叔戊醇中的轉(zhuǎn)化率相對較高［95］。另外，雖然脂肪酶可以在非水相體系中催化酯類的合成，但仍需要少量的水以維持酶本身的活性構(gòu)象［96］。同時，利用脂肪酶催化維生素C棕櫚酸酯合成過程中會產(chǎn)生水，產(chǎn)生的水會影響脂肪酶催化酯合成反應(yīng)速率［97］。結(jié)合底物溶解性的因素，維生素C 棕櫚酸酯的酶促合成過程中，溶劑的種類和比例尤為關(guān)鍵。

酶法合成維生素C棕櫚酸酯常用的脂肪酶仍然是Novozym 435，Lerin 等［98］采用Novozym 435 通過優(yōu)化反應(yīng)條件，在酶用量5%條件下，可實現(xiàn)維生素C 轉(zhuǎn)化率67%。Karmee 等［99］先用化學(xué)法合成棕櫚酸乙烯酯作為底物，以Novozym 435脂肪酶催化劑，在微波輻射下，實現(xiàn)維生素C 棕櫚酸酯合成，催化轉(zhuǎn)化率達(dá)80%?？傮w來講，與其他脂肪酶相比，Novozym 435 脂肪酶在維生素C 棕櫚酸酯的合成方面具有一定優(yōu)勢。然而Novozym 435脂肪酶價格較高，催化效率與化學(xué)法相比并無明顯優(yōu)勢。酶法合成維生素C棕櫚酸酯的大規(guī)模工業(yè)化還需要降低酶的使用成本，提高酶促反應(yīng)效率，這有賴于更高性能酶的挖掘和工業(yè)開發(fā)。

3.3 維生素E衍生物

維生素E是一種脂溶性的維生素，天然維生素E 是由生育酚和生育三烯酚及兩者的異構(gòu)體組成的混合物。目前發(fā)現(xiàn)了8 種異構(gòu)體，包括α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚和α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚［100］。其中，α-生育酚含量最豐富且活性最高，通常所說維生素E 就是指α-生育酚。維生素E（α-生育酚）具有極強(qiáng)的抗氧化性，因此也極易被氧化，十分不利于貯藏和運(yùn)輸。工業(yè)上，通常將維生素E轉(zhuǎn)化成維生素E 衍生物，在保留維生素E 生物活性的同時增強(qiáng)其穩(wěn)定性，拓寬其應(yīng)用范圍。最常見的維生素E 衍生物是維生素E 酯類，比如維生素E 醋酸酯、維生素E 琥珀酸酯、維生素E 阿魏酸酯、維生素E棕櫚酸酯等。

維生素E酯類衍生物一般用化學(xué)法合成，但也有不少酶促合成的研究。南京大學(xué)黃和團(tuán)隊［101］對比了市場上多種脂肪酶對維生素E 酯化的催化活性，發(fā)現(xiàn)來源于皺褶假絲酵母（Candida rugose）的脂肪酶CRL 的活性較好，維生素E 棕櫚酸酯的催化收率達(dá)到28.37%，是Novozym 435 的一倍。尹春華等［102］利用琥珀酸酐修飾諾維信Novozym 435 脂肪酶，發(fā)現(xiàn)修飾后的酶相比原始酶可更好地催化維生素E 合成維生素E 琥珀酸酯，催化收率達(dá)94.4%。這些研究為酶法合成維E 棕櫚酸酯作了鋪墊，已展示出良好的工業(yè)應(yīng)用潛力。

4 總結(jié)與展望

酶作為天然的催化劑，通過對其挖掘及改造可以實現(xiàn)高效催化反應(yīng)。酶及酶催化技術(shù)已經(jīng)在生物、化工、醫(yī)藥等各個領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本文對酶工程中常用的篩選及改造方法進(jìn)行了歸納總結(jié)，對目前常見維生素及其衍生物的合成中涉及的酶催化過程作了介紹。目前，工業(yè)上部分維生素的合成已采用酶催化和化學(xué)合成結(jié)合的方式生產(chǎn)，充分發(fā)揮生物和化學(xué)各自優(yōu)勢，典型案例如維生素B3和維生素B5。而維生素衍生物中，維生素C葡萄糖苷均采用酶催化合成，其他衍生物既有酶法合成也有化學(xué)法合成。維生素的酯類衍生物種類較多且普遍采用化學(xué)合成法，但酶催化法已逐漸顯示出綠色環(huán)保和成本優(yōu)勢，不少已經(jīng)可以替代化學(xué)法，如維生素A 棕櫚酸酯、維生素C棕櫚酸酯等。本文對上述各類維生素及其衍生物的酶法合成情況作了總結(jié)（表1）。

表1 各類維生素及其衍生物的酶法合成情況Tab.1 Enzymatic synthesis of various vitamins and their derivatives

目前工業(yè)上應(yīng)用的生物合成技術(shù)可分為生物發(fā)酵和生物催化。生物發(fā)酵的目標(biāo)是利用天然可再生資源，在培養(yǎng)微生物過程中合成各類化學(xué)品。而生物催化是利用酶（包括固定化酶和固定化細(xì)胞）作為催化劑合成化學(xué)品。對于某些天然產(chǎn)物，比如維生素B5、維生素D3，其天然合成過程往往很復(fù)雜，要想利用生物發(fā)酵直接生產(chǎn)，首先要獲得高效合成能力的菌株。這就需要對微生物進(jìn)行大規(guī)模篩選或復(fù)雜的分子生物學(xué)改造。而另一些合成路線簡單的產(chǎn)品，比如維生素B1，化學(xué)合成法通常較為成熟，要想以生物發(fā)酵方式替代化學(xué)法往往缺乏成本競爭力。生物催化的目標(biāo)是為了針對性地替代化學(xué)合成反應(yīng)或者路線。與化學(xué)法相比，酶催化具有生物合成技術(shù)常見優(yōu)勢，比如反應(yīng)條件溫和、安全性高、具有化學(xué)和光學(xué)選擇性、雜質(zhì)生成少等。與生物發(fā)酵相比，酶催化也有其獨特優(yōu)勢：①不依賴活細(xì)胞，生物安全性更高；②不用考慮細(xì)胞本身耐受性和生長條件，對底物和催化體系耐受范圍更廣，如水相、有機(jī)相和離子液體等；③酶的應(yīng)用形式更多，比如酶和全細(xì)胞及其固定化形式，應(yīng)用范圍更加廣泛［103］。酶催化也有諸多不足之處：酶的種類繁多，但天然的酶活性往往無法滿足工業(yè)化需求；有的酶催化依賴特定輔因子，增加了應(yīng)用難度；要在現(xiàn)有產(chǎn)品的化學(xué)合成路線中應(yīng)用酶催化工藝，往往需要重新設(shè)計合成路線。然而，酶作為一種綠色催化劑，其應(yīng)用不斷拓展，酶催化作為綠色合成工藝已被大眾認(rèn)可［104］。

酶本質(zhì)上是一種生物大分子，對酶的理解和應(yīng)用需要生物、化學(xué)和計算機(jī)等多學(xué)科共同推動。化學(xué)化工和酶工程結(jié)合可深入理解酶催化反應(yīng)機(jī)制、拓展酶應(yīng)用方式；合成生物學(xué)的發(fā)展可為酶的表達(dá)設(shè)計提供豐富的分子生物學(xué)原件和策略；計算機(jī)科學(xué)等技術(shù)的發(fā)展是酶結(jié)構(gòu)預(yù)測及動力學(xué)模擬的基礎(chǔ)，將為酶的改造提供結(jié)構(gòu)依據(jù)。酶學(xué)及酶工程與各學(xué)科交叉融合，將不斷推動酶的研究和酶催化工藝的開發(fā)和應(yīng)用。