楊超凡，姜玉超，桑茉莉，李盛英，張偉

（山東大學(xué)微生物技術(shù)研究院，山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室，山東 青島 266237）

細(xì)胞色素P450 酶能夠催化包括“碳?xì)滏I選擇性氧化”在內(nèi)的20 余類、數(shù)以萬計的氧化還原反應(yīng)，其生物學(xué)功能廣泛涉及人類與脊椎動物異源物質(zhì)代謝與激素合成，植物與微生物天然產(chǎn)物生物合成以及微生物降解代謝等，其催化的反應(yīng)具有高度的位點和立體選擇性，是化學(xué)催化劑的重要瓶頸［1-3］。氧化還原伴侶蛋白（簡稱還原伴侶，redox partner）在絕大多數(shù)P450 酶催化反應(yīng)中不可或缺，負(fù)責(zé)將來自輔因子NAD（P）H 的2 個電子依次傳遞到亞鐵血紅素（heme）反應(yīng)中心以激活氧分子［4］。P450 酶和還原伴侶在長期進(jìn)化過程中，通過基因融合與分離的方式，演化出多種不同的催化系統(tǒng)。根據(jù)P450酶和還原伴侶構(gòu)成的電子傳遞鏈的不同，可分為3 種主要類型：第1 類為三組分系統(tǒng)，P450酶、鐵氧還蛋白（ferredoxin，F(xiàn)dx）和鐵氧還蛋白還原酶（ferredoxin reductase，F(xiàn)dR）均以獨立蛋白的形式存在，其電子傳遞鏈一般為NAD（P）H→FAD→FeS→heme，常見于細(xì)菌及線粒體P450催化系統(tǒng)，如銅綠惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）來源的PdR/Pdx［5］、牛（Bovine）來源的AdR/Adx［6］和菠菜（Spinach oleracea）來源的FdR/Fdx［7］等。第2類為雙組分系統(tǒng)，還原伴侶由FAD和FMN雙結(jié)構(gòu)域融合形成細(xì)胞色素P450 還原酶（cytochrome P450 reductase，CPR）［8］，常 見 于真核細(xì)胞，與P450 蛋白組成雙組分系統(tǒng)；另外，自然界也存在P450酶與鐵氧化蛋白FMN或者鐵硫簇FeS融合形式的雙組分系統(tǒng)，如來自Methylococcus capsulatus的CYP51FX（N-P450-Fe3S4-C）［9］和來自Rhodococcus rhodochrous11Y 的XplA（N-FMN-P450-C）［10］。第3 類則為單組分系統(tǒng)，其還原伴侶與P450 蛋白融合形成一個完整蛋白，能夠在只添加輔因子NAD（P）H的條件下實現(xiàn)P450催化功能，因此常被稱為“催化自主型”P450 酶（圖1）。目前發(fā)現(xiàn)的天然融合單組分系統(tǒng)，一般采用N 端P450 酶和C端還原伴侶融合的結(jié)構(gòu)組織形式，如在巨大芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中發(fā)現(xiàn)的P450 BM3，即N-BM3-CPR-C（CYP102A1）［11］和 來自 于 紅 球 菌（Rhodococcussp.NCIMB 9784）的P450 RhF，即N-P450-RhFRED-C（CYP116A1）［12-14］。

圖1 基于還原伴侶分類的P450催化系統(tǒng)Fig.1 Classification of P450 systems based on redox partners

單組分P450 催化系統(tǒng)因其催化自主特性在近年來受到廣泛關(guān)注［12］。例如，李盛英等［13］首創(chuàng)將委內(nèi)瑞拉鏈霉菌（Streptomyces venezuelae）來源的P450 酶PikC 與含有21 個氨基酸殘基天然連接肽（L21）的RhFRED 蛋白進(jìn)行融合表達(dá)獲得了“催化自主型”PikC-RhFRED，在只添加NADPH 的條件下，在體外（in vitro）成功實現(xiàn)了對底物12 元大環(huán)內(nèi)酯YC-17 及14 元大環(huán)內(nèi)酯narbomycin 的羥化反應(yīng)。Misawa等［14］利用“催化自主型”的快速構(gòu)建策略——“分子樂高”法（Molecular Lego），實現(xiàn)了將還原伴侶RhFRED 與不同P450 酶融合到一起形成“非天然”融合蛋白P450-RhFRED，通過異源宿主E.coli的體內(nèi)（in vivo）反應(yīng)成功重建了多種P450 酶的催化功能；并利用該系統(tǒng)首次成功鑒定了CYP153A 的催化功能，為多種細(xì)菌P450酶的功能鑒定提供了有效策略和開發(fā)系統(tǒng)。van den Berg 等［15］通過將來自Amycolatopsis orientalis的CYP105AS1 進(jìn)行密碼子優(yōu)化和定向進(jìn)化改造后，與RhFRED 融合獲得P450prava-RhFRED，以該酶為基礎(chǔ)構(gòu)建了藥物普伐他汀的一步發(fā)酵法生產(chǎn)途徑。

以來自于稀有放線菌淡灰紅小單孢菌（Micromonospora griseorubida）麥新米星（mycinamicin）生物合成途徑中的多功能P450 酶MycG 為研究對象，構(gòu)建了MycG-RhFRED單組分催化系統(tǒng)，在僅提供NADPH 的條件下實現(xiàn)了MycG 對底物mycinamicin Ⅳ（M-Ⅳ） 的 識 別 和 催 化， 產(chǎn) 生mycinamicinⅠ（M-Ⅰ）和mycinamicinⅤ（M-Ⅴ），后者能夠被MycG繼續(xù)環(huán)氧化得到終產(chǎn)物mycinamicinⅡ（M-Ⅱ），但M-Ⅰ則不能被MycG識別，是另一個終產(chǎn)物（圖2，i）［16］。當(dāng)MycG與還原伴侶RhFRED處于雙組分系統(tǒng)狀態(tài)時，同樣可以識別和催化底物M-Ⅳ產(chǎn)生3種氧化產(chǎn)物，但同時產(chǎn)生了“非天然”脫甲基產(chǎn)物dMe-M-Ⅳ（圖2，ii）［17］。該發(fā)現(xiàn)暗示還原伴侶在P450 酶催化過程中，不只是作為電子傳遞的載體，也能夠影響乃至塑造P450 酶的催化功能［17］。

圖2 多功能P450酶MycG催化的麥新米星Ⅳ的氧化和脫甲基反應(yīng)Fig.2 Oxidative and demethylative reactions of M-Ⅳcatalyzed by MycG

還原伴侶RhFRED 與P450酶在融合（單組分）和分離（雙組分）條件下均能夠?qū)崿F(xiàn)P450 酶的功能重建，暗示P450 酶與還原伴侶之間的適配具有一定的魯棒性，為進(jìn)一步探索和研究P450 酶與還原伴侶的蛋白組成形式（單組分對多組分）和在融合蛋白中的相對位置對P450 催化性質(zhì)的影響提供了良好的研究材料。RhFRED的分子內(nèi)電子傳遞系統(tǒng)是由FMN 和Fe2S2兩個結(jié)構(gòu)功能域組成的，兩者之間通過含有9個氨基酸殘基的連接肽（L9）融合形成N-FMN-Fe2S2-C［12］。本研究將FMN 和Fe2S2從L9 處拆分為兩個獨立蛋白，與MycG 進(jìn)行融合和分離，共獲得14 種組合方式。第一，兩個獨立表達(dá)的FMN 和Fe2S2蛋白，與MycG 組合形成三組分催化系統(tǒng)（圖3，A1）。第二，模擬單組分系統(tǒng)，利用天然連接肽（L21 或L9）將MycG、FMN 和Fe2S2三個蛋白的相對位置進(jìn)行搭配組合，重組“催化自主型”P450 系統(tǒng)的不同蛋白組織形式（圖3，B1～B6）；第三，模擬雙組分催化系統(tǒng)，將FMN 和Fe2S2融合位置互換產(chǎn)生N-Fe2S2-FMN-C（圖3，C1、C2）；另外，將兩個結(jié)構(gòu)域分別融合在MycG 的C 端或N 端，獲得N-MycG-FMN/Fe2S2-C 和N-FMN/Fe2S2-MycG-C（圖3，C3～C10）。通過MycG 對底物M-IV 的底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物分布分析，結(jié)合電子傳遞效率差異來研究不同組合的人工還原伴侶對MycG 催化系統(tǒng)功能和性質(zhì)的影響。

圖3 P450酶MycG與還原伴侶組成的不同催化系統(tǒng)（0978和1499分別代表來自細(xì)長聚球藻Synechococcus elongates PCC 7942的鐵氧還蛋白還原酶SelFdR0978和鐵氧還蛋白SelFdx1499；黑色linker：L21，HQVAMLRDGDSFGGG PRHGAG；灰色linker：L9，GERREIRVD）Fig.3 Constructed P450 systems based on the recombination and reorganization of MycG and different redox partners(0978 and 1499 represent the ferredoxin reductase SelFdR0978 and ferredoxin SelFdx1499 from Synechococcus elongates PCC 7942,respectively;Black linker:L21,HQVAMLRDGDSFGGGPRHGAG;Gray linker:L9,GERREIRVD)

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用于分子克隆的宿主菌E.coliDH5α菌株、用于蛋白表達(dá)的宿主菌E.coliBL21（DE3）菌株均購自擎科生物技術(shù)（青島）股份有限公司，寡核苷酸引物也由該公司合成。本研究所用的菌株和質(zhì)粒見表1，本研究所用的寡核苷酸序列見表2。

表1 本研究使用的菌株和質(zhì)粒Tab.1 Strains and plasmids used in this study

表2 本研究所用的引物名稱與核苷酸序列Tab.2 Oligos used in this study

續(xù)表

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑

本研究所用的LB 瓊脂和LB 肉湯培養(yǎng)基采購于青島海博生物技術(shù)有限公司；TB 肉湯培養(yǎng)基采購于生工生物科技有限公司；DNA 聚合酶PrimerSTAR Max DNA Polymerase PrimerSTAR Max DNA Polymerase 和DNA Marker 購 自 寶 日 醫(yī)生物技術(shù)有限公司（Takara 日本）；2×TsingKe Master Mix 購自擎科生物技術(shù)有限公司；DNA 純化試劑盒（Gel Extraction Kit D2500）購自O(shè)mega（美國）；用于同源重組的Exnase Ⅱ連接酶購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；鎳柱瓊脂糖樹脂Ni-NTA Sefinose Resin（G915DA0001）采購于上海生工生物工程有限公司；4S Red Plus 核酸染色劑采購于BBI 生物科技有限公司；超濾管（50/30/10 kDa）購自美國Millipore 公司；50×TAE 與10×TBE 電泳緩沖液購自北京索萊寶科技公司；所有無機(jī)鹽采購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和索萊寶有限公司。

1.2 基因克隆和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

本研究中對每個基因獨立片段采用兩步擴(kuò)增法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增：首先以含有目的基因DNA 的MycG-RhFRED 質(zhì)粒作為模板，用相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增得到目的編碼基因，將該DNA 片段用Omega Bio-tek DNA 純化試劑盒進(jìn)行純化后作為PCR 模板，并用帶有同源臂的引物再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將用于同源重組連接的同源臂片段加到基因的兩端并進(jìn)行膠回收純化。利用PCR獲得含有同源臂的質(zhì)粒線性片段，將兩個DNA 片段用諾唯贊的Exnase Ⅱ酶進(jìn)行同源重組連接后，利用化學(xué)法轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)并涂布到含有50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃靜置培養(yǎng)過夜。挑取平板生長的單克隆并以T7-P/T 為引物進(jìn)行菌落PCR 驗證，獲得正確片段的質(zhì)粒由擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗證。

1.3 重組蛋白的表達(dá)和純化

1.3.1 重組蛋白的表達(dá)

將測序驗證正確質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21（DE3）進(jìn)行松弛培養(yǎng)后，離心取上清并涂布到含有50 mg/L 卡那霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)16～18 h。挑取單克隆于50 mL含50 mg/L 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min 搖床培養(yǎng)過夜。按1%接種量接種至含500 mL TB（含50 mg/L 卡那霉素）培養(yǎng)基的2 L 三角瓶中，37 ℃、160 r/min 培養(yǎng)至A600=0.6～1。如果重組蛋白為P450 酶，需在培養(yǎng)基中加入500μmol/L 5-氨基乙酰丙酸鹽酸鹽（5-aminolevulinic acid，5-ALA）和1 mmol/L VB1，隨后加入終濃度為100μmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）。培養(yǎng)液于16 ℃、100 r/min培養(yǎng)20～24 h誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。發(fā)酵液于4 ℃、6000 r/min離心10 min，將菌體收集后置于?80 ℃冰箱保藏備用。

1.3.2 重組蛋白的純化

將含有重組蛋白的菌體從?80 ℃冰箱取出，置于冰上融化。加入30～40 mL Lysis buffer（50 mmol/L磷酸二氫鈉，300 mmol/L氯化鈉，10%甘油10 mmol/L咪唑，pH 8.0），渦旋振蕩重懸菌體，倒入置于冰水混合液的燒杯中，利用JY92-IIDN 超聲破碎儀（寧波新芝生物科技公司），破碎裂解細(xì)胞至菌液為清澈狀態(tài)（工作5 s，停頓5 s，功率25%，工作時間30 min）。裂解后的懸液10 000 r/min、4 ℃離心60 min，將上清轉(zhuǎn)至離心管中，加入1～2 mL Ni-NTA 樹脂于4 ℃孵育60 min。轉(zhuǎn)入Ni-NTA 重力柱，用Wash buffer（50 mmol/L 磷酸二氫鈉，300 mmol/L氯化鈉，10%甘油，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0）清洗250 mL。用4 mL Elution buffer（50 mmol/L 磷酸二氫鈉，300 mmol/L 氯化鈉，10% 甘油，250 mmol/L咪唑，pH 8.0）對目的蛋白進(jìn)行洗脫收集；收集液用合適的Millipore 超濾離心管濃縮至約1 mL；用PD-10 脫鹽柱（GE Healthcare）脫鹽收集目標(biāo)蛋白，混勻后分裝，經(jīng)液氮速凍后置于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蛋白濃度的測定

1.4.1 P450蛋白活性濃度測定

P450 蛋白濃度測定采用CO 差光譜進(jìn)行測定［18］：取100 μL 純化P450 蛋 白 轉(zhuǎn)至1.5 mL 離心管，加入900 μL Desalting buffer；向蛋白樣品中通入CO 氣體約1 min，迅速轉(zhuǎn)入比色皿中，利用酶標(biāo)儀采集350～500 nm 吸光譜（A1）；加入適量保險粉（Na2S2O4）后輕輕混勻，用酶標(biāo)儀再次采集350～500 nm 吸光譜（A2）。計算不同吸光度下差值，以吸光度為橫坐標(biāo)、差值為縱坐標(biāo)。在450 nm處有吸收峰的P450 蛋白，可以認(rèn)定為活性P450酶。蛋白濃度的計算公式為：

1.4.2SelFdR0978濃度測定

將SelFdR0978 從?80 ℃冰箱取出，置于冰上融化；以Desalting buffer 做空白對照，將蛋白用Desalting buffer稀釋20倍后，用酶標(biāo)儀測量456 nm處吸光度。蛋白濃度計算公式為［19］：

1.4.3 含有Fe2S2結(jié)構(gòu)域的還原伴侶蛋白濃度測定

將含有Fe2S2結(jié)構(gòu)域的還原伴侶蛋白從?80 ℃冰箱取出，置于冰上融化；以Desalting buffer作空白對照，將蛋白用Desalting buffer 稀釋20 倍后，用酶標(biāo)儀測量420 nm 處吸光度。蛋白濃度計算公式為［19］：

1.4.4 含有FMN結(jié)構(gòu)域的還原伴侶蛋白濃度測定

將含有FMN結(jié)構(gòu)域的還原伴侶蛋白從?80 ℃冰箱取出，置于冰上融化；以Desalting buffer作空白對照，將蛋白用Desalting buffer稀釋20倍后，用酶標(biāo)儀測量445 nm 處吸光度。蛋白濃度計算公式為［20-21］：

1.5 重組蛋白體外反應(yīng)

1.5.1 體外反應(yīng)體系和條件

反應(yīng)體系中包含3 μmol/L MycG，10 μmol/L Fdx （Fe2S2），5 μmol/L FdR （FMN），0.1 mmol/L底物M-IV，2.5 mmol/L NADPH，反應(yīng)緩沖液（50 mmol/L 磷酸二氫鈉，10%甘油，pH 7.4）補充至100 μL；反應(yīng)條件為28 ℃，水浴2 h。加等體積甲醇渦旋振蕩以終止反應(yīng)。

1.5.2 HPLC檢測條件

反應(yīng)體系經(jīng)甲醇終止反應(yīng)后，14 000 r/min 離心10 min 后取上清，利用HPLC 對樣品進(jìn)行分析。色譜柱：YMC-Triart C18，4.6 mm×250 mm，5 μm。流動相：A 相，水+0.1 %三氟乙酸；B 相，乙腈+0.1%三氟乙酸。HPLC 洗脫方法：0～12 min，40% B；12～13 min，40%～100% B；13～16 min，100% B；16～17 min，100～40 % B；17～20 min，40%B；流速1 mL/min。

1.6 測定電子傳遞效率

1.6.1 測定鐵氰化鉀的還原速率

反應(yīng)體系中含有0.7 mmol/L鐵氰化鉀、500 μmol/L NADPH、0.01 μmol/L FdR/FMN/融合蛋白，加入反應(yīng)緩沖液補充至1 mL；酶標(biāo)儀記錄樣品在420 nm處吸光度的變化，計算鐵氰化鉀的還原速率［ε420=1000 L（/mol·cm）］［22-23］。

1.6.2 測定細(xì)胞色素C的還原速率

反應(yīng)體系中含有50 μmol/L 細(xì)胞色素C，500 μmol/L NADPH，0.1 μmol/L FdR（FMN）/Fdx（Fe2S2）/融合蛋白，加入反應(yīng)緩沖液補充至1 mL；利用酶標(biāo)儀記錄樣品在550 nm處吸光度的變化，計算細(xì)胞色素C的氧化速率［ε550=19 100 L（/mol·cm）］［18，22-23］。

2 結(jié)果與分析

2.1 MycG 與還原伴侶不同組合對M-Ⅳ體外反應(yīng)的影響

2.1.1 MycG、FMN和Fe2S2組成的三組分系統(tǒng)

在細(xì)菌Ⅰ型P450 系統(tǒng)中，P450 酶、FdR 和Fdx 均以獨立蛋白的形式存在。為了模擬自然界中存在的三組分催化系統(tǒng)，將RhFRED 的兩個結(jié)構(gòu)域（FMN和Fe2S2）在L9處進(jìn)行拆解后，構(gòu)建為兩個獨立的蛋白表達(dá)質(zhì)粒。在FMN、Fe2S2與MycG組成三組分系統(tǒng)中（圖3，A1），以M-Ⅳ為底物進(jìn)行體外反應(yīng)2 h 后，HPLC 和LC-MS 檢測分析發(fā)現(xiàn)該反應(yīng)未產(chǎn)生任何氧化或脫甲基產(chǎn)物，底物M-Ⅳ未見明顯消耗［圖4（a）v/vi；圖5，A1］。

為了證實拆解之后獨立表達(dá)獲得的FMN 和Fe2S2蛋白是否具有支持MycG催化功能的能力，分別選擇細(xì)長聚球藻S.elongatesPCC 7942 的鐵氧還蛋白還原酶SelFdR0978 和鐵氧還蛋白SelFdx1499分別替代FMN 和Fe2S2［19］，獲得MycG+FMN+1499（圖3，A2）和MycG+0978+Fe2S2（圖3，A3）組合，并以MycG+0978+1499（圖3，A4）組合作為陽性對照。

經(jīng)HPLC 檢測，MycG+0978+1499 陽性對照組合將M-Ⅳ（最大吸收波長280 nm）徹底轉(zhuǎn)化為M-Ⅴ（280 nm）、M-Ⅱ（240 nm）和M-Ⅰ（240 nm）［圖4（a）vii/viii］，3 種產(chǎn)物的比例為M-Ⅰ∶M-Ⅱ∶M-Ⅴ=1.0∶1.2∶0.2（圖5，A2）。這一結(jié)果說明當(dāng)SelFdR0978 和SelFdx1499 存在時，MycG 傾向于催化C-14 位的羥基化反應(yīng)，并以M-Ⅱ為主要產(chǎn)物形式。

MycG+FMN+1499 組合催化的反應(yīng)在280 nm檢測條件下，能夠觀察到M-Ⅱ的產(chǎn)生（4.95 min）［圖4（a）ix］。由于M-Ⅴ和M-Ⅱ的保留時間非常相近，經(jīng)LC-HRMS（ESI+）分析發(fā)現(xiàn)該產(chǎn)物峰包含了兩個分子離子峰，分別為728.4225和712.4270，與M-Ⅱ（cald.728.4221）和M-V（cald.712.4272）分子離子峰吻合［圖4（b）］。該反應(yīng)產(chǎn)物在240 nm下能夠觀測到保留時間為7.97 min的產(chǎn)物峰［圖4（a）x］，LC-HRMS 分析證實該峰分子離子峰為712.4277，與M-Ⅰ（cald.712.4272）一致［圖4（b）］。以上結(jié)果表明MycG+FMN+1499 組合能夠催化M-Ⅳ的氧化反應(yīng)，產(chǎn)生3個氧化產(chǎn)物M-Ⅰ、M-Ⅱ與M-Ⅴ，但產(chǎn)物生成率僅為MycG+0978+1499 組合的約50%，產(chǎn)物分布也產(chǎn)生了變化（M-Ⅰ∶M-Ⅱ∶M-Ⅴ=1.0∶0.9∶2.1）（圖5，A3），雖然同樣傾向于在C-14 位進(jìn)行羥基化，但以中間產(chǎn)物M-Ⅴ為主要產(chǎn)物形式。

對于MycG+0978+Fe2S2組合，除了3 種氧化產(chǎn)物M-Ⅰ、M-Ⅱ和M-Ⅴ，同時在280 nm 檢測波長下觀測到保留時間為7.22 min 的產(chǎn)物峰，經(jīng)LCHRMS分析發(fā)現(xiàn)該峰的分子量為682.4168，與dMe-M-Ⅳ（cald.682.4160）一致［圖4（a）ix、（b）］。4種產(chǎn)物比例為M-Ⅰ∶M-Ⅱ∶M-Ⅴ∶dMe-M-Ⅳ=1.0∶3.6∶6.2∶0.3（圖5，A4），以中間產(chǎn)物M-Ⅴ為主要存在形式。該結(jié)果說明Fe2S2存在時，可能通過蛋白-蛋白相互作用影響MycG 的催化構(gòu)象，產(chǎn)生非天然的脫甲基產(chǎn)物，與之前的結(jié)果相符［17］。

圖4 MycG催化麥新米星M-Ⅳ產(chǎn)生氧化和脫甲基產(chǎn)物高壓液相色譜和高分辨率質(zhì)譜分析Fig.4 HPLC and LC-HRMS analysis of the oxidative and demethylative products produced from M-Ⅳunder the catalysis of P450 MycG

圖5 不同還原伴侶系統(tǒng)中MycG催化M-Ⅳ反應(yīng)的產(chǎn)物分布及催化效率Fig.5 Product distribution and catalytic efficiencies of MycG toward M-Ⅳwith different redox partner systems

FMN 和Fe2S2以獨立蛋白形式分別與SelFdx1499 和SelFdR0978 組合時，MycG 能夠?qū)崿F(xiàn)對底物M-Ⅳ的轉(zhuǎn)化，說明FMN 和Fe2S2均為活性蛋白，而催化效率的差異可能是由于SelFdR0978與FMN 的電子傳遞效率造成的。另外，F(xiàn)e2S2的存在可能造成MycG 催化構(gòu)象的改變，從而產(chǎn)生了脫甲基產(chǎn)物dMe-M-Ⅳ。但是，MycG+FMN+Fe2S2組合中未能檢測到任何產(chǎn)物，暗示兩個結(jié)構(gòu)域由融合蛋白變?yōu)楠毩⒌鞍字螅鞍椎臉?gòu)象可能均發(fā)生了改變，組合后兩者之間無法產(chǎn)生有效識別和分子間的電子傳遞，因而無法支持MycG 的催化功能。這些結(jié)果表明FMN 和Fe2S2的融合狀態(tài)對于維持RhFRED蛋白的活性與反應(yīng)構(gòu)象具有重要作用。

2.1.2 MycG、FMN和Fe2S2組成的單組分系統(tǒng)

一些P450 酶和還原伴侶在進(jìn)化過程中，融合形成一個單組分、“催化自主型”的P450酶，能夠在只提供NAD（P）H 的條件下實施催化功能，可能代表了進(jìn)化上的一種優(yōu)勢組合。“催化自主型”P450 酶的典型代表有P450 BM3（CYP102A1）［11］和P450-RhFRED（CYP116A1）［24］。在這兩種蛋白中，P450 和雙結(jié)構(gòu)域的還原伴侶蛋白在結(jié)構(gòu)組織方式均為N-P450-CPR/RhFRED-C，迄今為止自然界中尚未發(fā)現(xiàn)位于P450 酶N 端的雙結(jié)構(gòu)域還原伴侶蛋白［12］。

在本研究中，以MycG 與RhFRED 雙結(jié)構(gòu)域FMN 和Fe2S2為研究對象，通過不同的組織方式設(shè)計了6 種人工“單組分”融合蛋白（圖3，B1～B6）。N-MycG-FMN-Fe2S2-C（即MycG-RhFRED）（圖3，B1）、N-MycG-Fe2S2-FMN-C（圖3，B2）和N-FMN-Fe2S2-MycG-C（圖3，B3）能夠在僅添加NADPH 的條件下，催化M-Ⅳ反應(yīng)產(chǎn)生氧化產(chǎn)物M-Ⅰ、M-Ⅱ、M-Ⅴ和脫甲基產(chǎn)物dMe-M-Ⅳ共計4種產(chǎn)物，但催化效率差異顯著［圖4（c）i/ii，iii/iv，v/vi；圖5，B1～B3］。例如：當(dāng)還原伴侶位于MycG 的C 端時，催化效率顯著降低，且產(chǎn)物分布發(fā)生了明顯變化，以脫甲基產(chǎn)物dMe-M-Ⅳ為主（圖5，B3）。以上結(jié)果說明，在催化自主型P450系統(tǒng)中，P450 酶和還原伴侶相對位置的改變，能夠?qū)450酶的催化效率和產(chǎn)物分布造成顯著影響。

Fe2S2-FMN-MycG、FMN-MycG-Fe2S2和Fe2S2-MycG-FMN 3 種融合蛋白在以M-IV 為底物的體外反應(yīng)測試中，未能檢測到相應(yīng)的產(chǎn)物峰［圖4（c）vii/viii，ix/x 和xi/xii；圖5，B4～B6］。CO 差光譜測定發(fā)現(xiàn)，該3種“單組分”融合蛋白未能檢測到P450 典型吸收峰。該結(jié)果暗示FMN、Fe2S2和MycG 相對位置的改變可能造成了人工蛋白的異常折疊，使得MycG喪失了P450酶催化功能。

2.1.3 MycG、FMN和Fe2S2組成的雙組分系統(tǒng)

自然界中存在的P450 雙組分催化系統(tǒng)中，P450 酶與還原伴侶蛋白常以獨立組分的形式存在，如真核生物中常見的P450 酶與CPR 組合［12］。P450酶僅與Fdx或FdR 發(fā)生融合的情況較為罕見，目前僅有兩例P450 酶與Fdx 形成融合蛋白的報道，分別是來自于M.capsulatus的CYP51FX（N-P450-Fe3S4-C）［9］和 來 自 于R.rhodochrous11Y 的XplA（N-FMN-P450-C）［10］，這種融合方式可能代表了一種由雙組分融合蛋白向單組分融合蛋白進(jìn)化的中間狀態(tài)。值得指出的是，CYP51FX 和XplA 均需要在同時提供FdR 和NADPH 的條件下才能實現(xiàn)其催化功能［9-10］。將RhFRED 蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域FMN和Fe2S2分別融合到MycG的N端或C端，構(gòu)建獲得N-Fe2S2/FMN-MycG-C 或N-MycG-Fe2S2/FMN-C 4 種融合形式并成功表達(dá)純化獲得目的蛋白，CO 差光譜分析證實純化獲得的融合蛋白均具有P450 典型吸收峰。在以M-Ⅳ為底物的體外反應(yīng)中添加還原伴侶蛋白的相應(yīng)缺失組分（FMN 或Fe2S2）后，HPLC 分析發(fā)現(xiàn)4 種組合均可以不同程度重建MycG的活性，催化產(chǎn)生3種氧化產(chǎn)物和1種脫甲基產(chǎn)物［圖4（d）i/ii，iii/iv，v/vi和vii/viii］，但產(chǎn)物分布差別較大：N-FMN-MycG-C、N-Fe2S2-MycG-C、N-MycG-FMN-C 和N-MycG-Fe2S2-C 的 產(chǎn) 物 比 例（M-Ⅰ∶M-Ⅱ∶M-Ⅴ∶dMe-M-Ⅳ）分別為1.0∶3.7∶6.4∶0.8、1.0∶4.7∶5.1∶7.9、1.0∶4.1∶4.5∶8.2和1.0∶4.8∶4.5∶2.3，且主產(chǎn)物也不盡相同，分別為M-Ⅴ、dMe-M-Ⅳ、dMe-M-Ⅳ和M-Ⅱ（圖5，C1～C4），其中N-FMN-MycG-C的催化效率明顯優(yōu)于另外3 種融合蛋白［圖4（d）i/ii，xi/xii；圖5，C1，C5］。值得指出的是，當(dāng)FMN 或Fe2S2融合在MycG 的N 端或者C 端時，脫甲基產(chǎn)物dMe-M-Ⅳ的產(chǎn)量均發(fā)生顯著改變。當(dāng)游離的Fe2S2被SelFdx1499替換后，反應(yīng)體系不再產(chǎn)生脫甲基產(chǎn)物dMe-M-Ⅳ；而當(dāng)SelFdR0978 將游離的FMN 替換后，脫甲基產(chǎn)物產(chǎn)量也出現(xiàn)降低。以上結(jié)果暗示RhFRED 蛋白的兩結(jié)構(gòu)域在脫甲基產(chǎn)物dMe-M-Ⅳ的產(chǎn)生過程中均發(fā)揮重要作用，其中Fe2S2結(jié)構(gòu)域的影響大于FMN結(jié)構(gòu)域。

對于RhFRED 蛋白本身，通過FMN 和Fe2S2結(jié)構(gòu)域相對位置互換構(gòu)建了N-Fe2S2-FMN-C（圖3，C2）“非天然”融合蛋白。反應(yīng)結(jié)果顯示MycG+N-Fe2S2-FMN-C 組合仍然能夠產(chǎn)生氧化產(chǎn)物M-Ⅰ、M-Ⅱ、M-Ⅴ和脫甲基產(chǎn)物dMe-M-Ⅳ［圖4（d）xvii/xviii，xix/xx］，其與MycG+N-FMN-Fe2S2-C（即RhFRED）相比，產(chǎn)物分布變化不明顯，分別為1.0∶5.8∶9.4∶12.1 和1.0∶3.9∶6.2∶15.1，但是產(chǎn)物生成效率下降約50%（圖5，C9，C10）。該結(jié)果表明雙組分系統(tǒng)中Fe2S2和FMN 相對位置改變會影響兩者之間電子傳遞效率，但對P450 酶催化構(gòu)象、反應(yīng)偏好及其產(chǎn)物分布的影響較小。

2.2 MycG與還原伴侶融合方式和組織形式對電子傳遞效率的影響

在P450催化系統(tǒng)中，來自于NAD（P）H的兩個電子依次經(jīng)過FdR（FMN）→Fdx（Fe2S2）→heme 的傳遞過程。電子傳遞鏈各組分之間的電子傳遞效率是影響P450 催化活性的關(guān)鍵因素。因此，分別以鐵氰化鉀和細(xì)胞色素C 作為替代型電子受體［16-17］，測定不同融合方式和組織形式對電子傳遞效率的影響。如表3所示，與自然進(jìn)化形成的天然融合蛋白N-FMN-Fe2S2-C（RhFRED）相比，兩個結(jié)構(gòu)域互換之后得到的N-Fe2S2-FMN-C 蛋白，對鐵氰化鉀和細(xì)胞色素C 的還原速率都有所下降，表明RhFRED 蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域相對位置的改變，造成兩者之間［FMN→Fe2S2，34.38 μmol/（L·min）±0.05 μmol/（L·min）vs24.37 μmol/（L·min）±0.02 μmol/（L·min）］以及與P450 蛋白之間（Fe2S2→heme，13.57 μmol/（L·min）±0.01 μmol/（L·min）vs10.21 μmol/（L·min）±0.01 μmol/（L·min））電子傳遞效率的下降，進(jìn)而影響到P450 酶的催化效率和產(chǎn)物產(chǎn)率：在N-Fe2S2-FMN-C 組成的雙組分反應(yīng)體系中，MycG 催化MIV 產(chǎn)生相應(yīng)產(chǎn)物的效率約為含有N-FMN-Fe2S2-C（RhFRED）雙組分體系的60%（圖5，C9、C10）。

在6種不同蛋白組織結(jié)構(gòu)類型的“單組分”融合蛋白中，N-FMN-Fe2S2-MycG-C、N-Fe2S2-FMN-MycG-C與N-MycG-FMN-Fe2S2-C（MycG-RhFRED）對鐵氰化鉀的還 原 速 率 相 當(dāng)［FMN→Fe2S2，26.07 μmol/（L·min）±0.03 μmol/（L·min）vs25.36 μmol/（L·min）±0.02 μmol/（L·min）vs21.82 μmol/（L·min）±0.02 μmol/（L·min）］，說明還原伴侶位于P450 酶MycG 的N 端，或者FMN 和Fe2S2相對位置改變對FMN 與Fe2S2之間的電子傳遞效率影響較小。但是，N-FMN-Fe2S2-MycG-C、 N-Fe2S2-FMN-MycG-C 對細(xì)胞色素C的還原速率都低于N-MycG-FMN-Fe2S2-C［Fe2S2→heme，10.22 μmol/（L·min）± 0.01 μmol/（L·min）vs6.0 μmol/（L·min）± 0.01 μmol/（L·min）vs10.45 μmol/（L·min）± 0.01 μmol/（L·min）］（表3），表明當(dāng)還原伴侶蛋白位于MycG的N端時，F(xiàn)e2S2將電子傳遞給P450 酶的能力減弱（N-FMN-Fe2S2-MycG-C 和N-Fe2S2-FMN-MycG-C 的產(chǎn)率分別約為N-MycGFMN-Fe2S2-C 的10%和25%），可能是造成MycG催化效率降低的主要因素之一（圖5 B3、B4）。

將MycG 置于FMN 和Fe2S2之間獲得的兩種人工融合蛋白N-FMN-MycG-Fe2S2-C 和N-Fe2S2-MycG-FMN-C，以及通過結(jié)構(gòu)域置換獲得的融合蛋白N-MycG-Fe2S2-FMN-C 蛋白，對鐵氰化鉀的還原速率約為N-MycG-FMN-Fe2S2-C（MycG-RhFRED）的30%［FMN→Fe2S2，6.92 μmol/（L·min）± 0.01 μmol/（L·min）vs6.64 μmol/（L·min）± 0.02 μmol/（L·min）vs5.58 μmol/（L·min）± 0.01 μmol/（L·min）vs21.82 μmol/（L·min）± 0.02 μmol/（L·min）］，這3個融合蛋白對細(xì)胞色素C 的還原速率也同時降低［Fe2S2→heme，8.42 μmol/（L·min）±0.003 μmol/（L·min）vs3.23μmol/（L·min）±0.009μmol/（L·min）vs5.04 μmol/（L·min）±0.009 μmol/（L·min）vs10.45 μmol/（L·min）±0.009 μmol/（L·min）］（表3），表明FMN 和Fe2S2結(jié)構(gòu)域與MycG 相對位置的改變也會造成電子傳遞效率的降低。更為重要的是，盡管能夠檢測到電子傳遞，這3個反應(yīng)體系均無法檢測到反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生，結(jié)合CO 測定無法得到P450 酶的特征吸收峰，暗示3 個融合蛋白中的P450 功能域因某些未知原因喪失了催化功能。

由表3 可知，SelFdR0978 對鐵氰化鉀的還原速率約為游離狀態(tài)FMN 的5 倍［FMN→Fe2S2，24.23 μmol/（L·min）±0.04 μmol/（L·min）vs5.04 μmol/（L·min）±0.07 μmol/（L·min）］，在不同反應(yīng)組合中當(dāng)將FMN 替換為SelFdR0978 時，產(chǎn)物的產(chǎn)率都獲得了不同程度的提高（圖5）。例如：MycG+Fe2S2+FMN 組合檢測不到反應(yīng)產(chǎn)物，而當(dāng)FMN 替換為SelFdR0978后，MycG+Fe2S2+0978的組合成功實現(xiàn)了對M-Ⅳ的催化反應(yīng)（圖5 A1、A3）；N-MycGFe2S2-C+0978 組合的產(chǎn)率也略高于N-MycG-Fe2S2-C+FMN（圖5 B7、B8），表明FdR/FMN→Fe2S2的電子傳遞效率是影響P450酶催化效率的重要因素。

相較于游離狀態(tài)的Fe2S2，SelFdx1499 對細(xì)胞色素C 的還原效率更高（Fdx/Fe2S2→heme），與含有SelFdx1499 的MycG 催化系統(tǒng)比含有游離Fe2S2催化系統(tǒng)的產(chǎn)率更高的結(jié)果相符。與天然融合蛋白N-MycG-FMN-Fe2S2-C（MycG-RhFRED）相比，當(dāng)改變重組蛋白各組分的結(jié)構(gòu)組織方式時，大部分組合的鐵氰化鉀還原速率以及細(xì)胞色素C還原速率均出現(xiàn)降低，表明重組蛋白的融合方式和組分相對位置的改變會影響電子傳遞效率，進(jìn)而影響P450酶的催化效率和產(chǎn)物分布。

3 討論

為模擬自然界中P450 酶與還原伴侶經(jīng)過進(jìn)化形成的不同組織形式，探究還原伴侶與P450 酶的融合或分離狀態(tài)以及融合蛋白中功能域的組織方式對P450 酶催化功能的影響，以P450 酶MycG 與還原伴侶RhFRED 為研究對象，構(gòu)建了13 種重組蛋白（圖3），以麥新米星M-Ⅳ作為反應(yīng)底物進(jìn)行體外MycG 催化的生化反應(yīng)，系統(tǒng)比較了不同還原伴侶組合中MycG 對M-Ⅳ的催化效率和產(chǎn)物分布，以及不同組合中的電子傳遞效率，探究還原伴侶影響和重塑MycG 催化功能的潛在功能和機(jī)制。

在還原伴侶與MycG 組成的“非天然”催化系統(tǒng)中，所有蛋白均獲得可溶性表達(dá)，16 個組合能夠成功重建MycG 的催化功能，其中12 個組合中MycG 能夠催化產(chǎn)生3 個氧化產(chǎn)物M-Ⅰ、M-Ⅱ和M-Ⅴ以及1個脫甲基產(chǎn)物dMe-M-Ⅳ。4個組合僅產(chǎn)生氧化產(chǎn)物M-Ⅰ、M-Ⅱ和M-Ⅴ，剩余4個組合未檢測到反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生（圖4、圖5）。值得注意的是，可檢測到反應(yīng)產(chǎn)物的16 個組合中，有12 個組合產(chǎn)生了脫甲基產(chǎn)物dMe-M-Ⅳ，其催化體系中均含有游離或者融合狀態(tài)的Fe2S2結(jié)構(gòu)域。

在4個未檢測到任何反應(yīng)產(chǎn)物的組合中，同樣含有游離或者融合的Fe2S2結(jié)構(gòu)域，其中MycG+FMN+Fe2S2組合可能是由于將天然融合的雙結(jié)構(gòu)域FMN 和Fe2S2拆分后，造成蛋白構(gòu)象變化影響到電子傳遞過程，進(jìn)而喪失了催化活性。游離狀態(tài)的FMN和游離狀態(tài)的Fe2S2之間的電子傳遞效率最低，對細(xì)胞色素C 的還原效率僅為0.46 μmol/（L·min）±0.03 μmol/（L·min），僅為RhFRED（N-FMN-Fe2S2-C）的0.03%；游離的FMN 從NADPH 獲取電子的速率也是最低的［5.04 μmol/（L·min）± 0.07 μmol/（L·min）］（表3）。含有Fe2S2結(jié)構(gòu)域的融合蛋白N-MycG-Fe2S2-FMN-C、N-FMN-MycG-Fe2S2-C和N-Fe2S2-MycG-FMN-C，雖然成功獲得可溶性蛋白，但均檢測不到420 nm 的特征吸收峰和450 nm遷移峰，可能是因為還原伴侶和MycG 相對位置的改變，使得“非天然”融合蛋白在折疊的過程中構(gòu)象發(fā)生了改變，未能獲得活性形式的P450 酶。3 種融合蛋白對鐵氰化鉀和細(xì)胞色素C 均具有還原能力（表3）：FMN→Fe2S2，5.58 μmol/（L·min）±0.01 μmol/（L·min）vs6.92 μmol/（L·min）±0.01 μmol/（L·min）vs6.64 μmol/（L·min）±0.02 μmol/（L·min）；Fe2S2→heme，5.04 μmol/（L·min）± 0.009 μmol/（L·min）vs8.42 μmol/（L·min）± 0.003 μmol/（L·min）vs3.23 μmol/（L·min）± 0.009 μmol/（L·min），暗示融合蛋白不同組分之間仍然能夠建立電子傳遞鏈。

在還原伴侶的電子傳遞鏈中，鐵氧還蛋白Fdx與P450 直接發(fā)生相互作用，F(xiàn)dx 將來自于FdR 的電子傳遞到P450 酶的heme 鐵催化中心。相較于FdR，F(xiàn)dx 與P450 的適配性是P450 催化系統(tǒng)中更為主要的因素［19］。例如P450cam對其特有的鐵氧還蛋白Pdx 具有高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪x擇性，在對P450cam與Pdx 復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)解析中發(fā)現(xiàn)，Pdx 不僅具有傳遞電子的功能，還具有誘導(dǎo)P450cam發(fā)生構(gòu)象變化的作用［25］。張麗蘭等［26］利用X 射線晶體學(xué)技術(shù)，成功解析了“自給自足P450 酶”CYP116B46的高分辨率蛋白結(jié)構(gòu)：由兩段連接肽相連3個結(jié)構(gòu)域，從N 端到C 端依次為P450、FMN 和Fe2S2，電子 的 傳 遞 方 向 為FMN→Fe2S2→heme，F(xiàn)MN 和Fe2S2之間的直線距離為0.79 nm，但Fe2S2和heme的直線距離為2.53 nm，超過目前認(rèn)定的有效電子可直接傳遞的距離，因此兩者的氨基酸可能在電子傳遞過程中扮演著重要角色，該結(jié)果也證明了Fe2S2結(jié)構(gòu)域不僅具有傳遞電子的功能。

本研究實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，還原伴侶RhFRED 或者其結(jié)構(gòu)域蛋白（FMN 與Fe2S2）存在時，MycG催化M-Ⅳ獲得的產(chǎn)物多樣性提高，既含有氧化產(chǎn)物M-Ⅰ、M-Ⅱ和M-Ⅴ，又產(chǎn)生脫甲基產(chǎn)物dMe-M-Ⅳ，暗示不同類型還原伴侶能夠影響和改變P450 催化效率和產(chǎn)物組成［17］。值得一提的是，單組分融合蛋白N-MycG-Fe2S2-FMN、 N-FMN-Fe2S2-MycG-C和雙組分系統(tǒng)MycG+N-FMN-Fe2S2-C（RhFRED）3 種組合中，脫甲基產(chǎn)物dMe-M-Ⅳ為主產(chǎn)物（圖5 B2、B3 和C9）；而在單組分系統(tǒng)N-MycG-FMNFe2S2-C，雙組分系統(tǒng)N-FMN-MycG-C+Fe2S2和三組分系統(tǒng)MycG+0978+Fe2S2組合中，羥基化產(chǎn)物M-Ⅴ為主產(chǎn)物（圖5 B1、C1 和A2）。上述結(jié)果說明，除還原伴侶的選擇之外［27-28］，還原伴侶與P450 酶的融合方式和催化系統(tǒng)蛋白組成的改變均會對產(chǎn)物分布造成影響。

不同于傳統(tǒng)P450 蛋白自身的改造，本研究通過模擬P450 酶與還原伴侶的不同進(jìn)化形式，利用還原伴侶工程策略構(gòu)建“非天然”P450 催化系統(tǒng)，通過改變還原伴侶和P450 酶的融合方式和相對位置，成功影響和改變了MycG 反應(yīng)的產(chǎn)物分布和產(chǎn)物類型，是一種有效的酶工程策略，將有助于開發(fā)最佳的細(xì)胞色素P450酶及其還原伴侶催化系統(tǒng)，實現(xiàn)特定的目標(biāo)化學(xué)反應(yīng)。值得指出的是，還原伴侶影響和改變P450 酶催化性質(zhì)的隱藏機(jī)制，以及P450 催化構(gòu)象和產(chǎn)物偏好性的選擇性機(jī)制仍需更加深入的研究和探索。

致謝：本工作得到國家重點研發(fā)計劃（2019YFA0905 700 和2019YFA0905100）、國家自然科學(xué)基金項目（82022066 和32000039）和山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室開放課題（M2021-4）支持。感謝日本Toho University 的Yojiro Anzai 教授為本研究提供麥新米星M-Ⅰ、M-Ⅱ、M-Ⅳ和M-Ⅴ等標(biāo)準(zhǔn)品化合物；感謝山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點實驗室生命環(huán)境研究公共技術(shù)平臺的朱敬、曲徑遙和黎志鳳老師在LC-HRMS 樣品檢測和數(shù)據(jù)分析方面提供的幫助。