張容亮 李進(jìn)濤 王子龍 馬藝斐 陸永萍*

1.云南大學(xué)附屬醫(yī)院/ 云南省第二人民醫(yī)院超聲科，昆明 650021；2.昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，昆明 650500

肝癌（liver cancer）是臨床常見(jiàn)三大惡性腫瘤之一，死亡率排在胃癌、食道癌之后，早期臨床癥狀不明顯，晚期主要表現(xiàn)為消瘦、肝痛、乏力、黃疸、腹水等[1]。世界各地肝癌發(fā)病率各不相同，非洲撒哈拉沙漠以南和亞洲沿海地區(qū)發(fā)病率較高，歐美等地區(qū)發(fā)病率則較低。流行病學(xué)調(diào)查及試驗(yàn)研究表明中國(guó)肝癌發(fā)病率高并呈現(xiàn)逐年增高的趨勢(shì)，每年因患肝癌死亡人數(shù)大約11 萬(wàn)人，約占全球肝癌死亡人數(shù)的1/2[2]。肝癌已經(jīng)成為我國(guó)人口致死的主因，嚴(yán)重影響我國(guó)公共健康問(wèn)題，我國(guó)每年投入大量的人力、科研經(jīng)費(fèi)進(jìn)行肝癌基礎(chǔ)研究。有研究資料表明病毒感染（如丙型肝炎病毒HCV、乙型肝炎病毒HBV 等）、性激素、飲水污染、黃曲霉素、亞硝胺類物質(zhì)、肝硬化、酒精、微量元素等都與肝癌發(fā)病相關(guān)。對(duì)于肝癌的早期診斷、治療方案優(yōu)化、新藥研發(fā)等研究將成為廣大醫(yī)學(xué)研究工作者的首要任務(wù)，成功制備適宜的動(dòng)物肝臟腫瘤模型并對(duì)其生長(zhǎng)特征進(jìn)行探索研究顯得很有必要，其探究結(jié)果可以為臨床肝癌的診治奠定前期基礎(chǔ)和提供有益的參考。傳統(tǒng)的開(kāi)腹瘤塊種植法成模率不高，在一定程度上影響了肝癌動(dòng)物模型試驗(yàn)研究的開(kāi)展。本試驗(yàn)對(duì)開(kāi)腹瘤塊種植法進(jìn)行了改良，以期建立一種更為有效且成模率高、能批量建模的種植方法。借助超聲影像技術(shù)對(duì)改良的開(kāi)腹瘤塊種植法制作兔VX2 腫瘤模型進(jìn)行觀察和分析其生長(zhǎng)特性，為下一步試驗(yàn)治療研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

VX2 肝癌種瘤新西蘭兔，購(gòu)于南京市浦口區(qū)萊芙養(yǎng)殖場(chǎng)，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（蘇）2019-0005。試驗(yàn)用新西蘭兔20 只，體重2.0～2.5 kg，3～4月齡，雌雄不限。由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供和飼養(yǎng)觀察，其生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滇）K2020-0004，使用許可證號(hào)為SYXK（滇）K2020-0006。開(kāi)展的動(dòng)物試驗(yàn)研究方案已通過(guò)昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)審查，其批準(zhǔn)號(hào)為kmmu20211434?？p合線購(gòu)于寧波醫(yī)用縫針有限公司，APLI0500 TUSA0500 全數(shù)字化彩色多普勒超聲診斷儀購(gòu)于日本東芝公司，注射用六氟化硫微泡造影劑購(gòu)于上海博萊科信誼藥業(yè)有限責(zé)任公司，試驗(yàn)兔手術(shù)臺(tái)購(gòu)于蘇州馮氏試驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備公司，陸眠寧、鹿醒寧均購(gòu)于吉林省華牧動(dòng)物保健品有限公司。

1.2 方 法

1）兔VX2 腫瘤塊制作。將種瘤兔VX2 肝腫瘤剪成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm 塊狀接種于兔大腿部肌肉（同一個(gè)入口并以60°為邊界朝3 個(gè)方向接種3 塊腫瘤塊），讓接種腫瘤塊生長(zhǎng)14 d 左右，手摸有高致密的包塊，使用陸眠寧（0.2 mL/kg）肌注麻醉后在無(wú)菌的條件下剝離出腫瘤，棄除腫瘤周圍壞死組織和筋膜等結(jié)蹄組織，并用生理鹽水沖洗腫瘤，用滅菌眼科剪剪取腫瘤組織邊緣生長(zhǎng)較好的魚(yú)肉樣組織，剪成大小約1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm 小塊放入加入抗生素的4 ℃生理鹽水中待用。

2）試驗(yàn)分組和改良的種植操作。20 只新西蘭兔，隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組2 組，每組10 只，術(shù)前予以禁食不禁水24 h。肌注陸眠寧麻醉后，固定四肢，用推剪推剃除胸腹部劍突周圍的毛，手術(shù)區(qū)域常規(guī)消毒后鋪手術(shù)巾。用碘酒消毒手術(shù)區(qū)域皮膚，劍突下稍微偏左側(cè)切開(kāi)2.0～2.5 cm 口，盡量避開(kāi)血管鈍性分離各層肌肉后暴露肝臟，用套有塑料軟管的無(wú)齒鑷將左肝的較大一葉向腹壁外牽拉并用滅菌的皮筋固定，用滅菌的不銹鋼彎尖頭鑷子或者帶針芯的腫瘤植入針（2.1*50）從同一個(gè)入口并以60°為邊界朝3 個(gè)方向刺破肝組織建立竇道，接種3 塊腫瘤塊。用8 號(hào)縫合線縫合肝膜開(kāi)口并按壓止血，在縫合處涂上適量青霉素；縫合腹膜肌肉層并涂上適量青霉素；縫合皮膚后碘酒消毒并涂上適量青霉素和紅霉素軟膏。術(shù)前肌注青霉素80 萬(wàn)IU，手術(shù)后每天注射1 次，連續(xù)3 d。對(duì)照組采用改良的手術(shù)操作但不植入腫瘤塊。

1.3 種植后觀察和檢測(cè)

1）觀察并記錄有無(wú)感染，如有感染及時(shí)處理。

2）肝功能生化指標(biāo)測(cè)定，種植后14 d 時(shí)兔耳中央動(dòng)脈采血分離血清送化驗(yàn)室檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（又稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶，ALT）、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（又稱谷草轉(zhuǎn)氨酶，AST）活性。

3）種植后14 d 時(shí)采用全數(shù)字化彩色多普勒超聲診斷儀并造影觀察肝臟腫瘤生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)兔麻醉（種植腫瘤兔麻醉使用劑量為正常麻醉劑量的1/3～2/3，視具體狀況而定）后仰臥位固定，用推剪推除觀察區(qū)域的兔毛。超聲探頭掃描觀察兔肝，觀察各組試驗(yàn)兔肝腫瘤的形態(tài)、大小、腫瘤內(nèi)部及周邊回聲、有無(wú)壞死及瘤體血供狀況。經(jīng)耳緣靜脈快速注入0.2 mL 生理鹽水稀釋的注射用六氟化硫微泡，觀察試驗(yàn)兔肝腫瘤造影特征。

4）種植后14 d 時(shí)處死試驗(yàn)兔，取出兔肝并用肉眼進(jìn)行大體觀察。取兔肝及腫瘤組織用10%甲醛溶液固定、包埋、常規(guī)HE 染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)一步觀察確認(rèn)是否具有腫瘤的組織學(xué)特征。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用百分率表示，2 組差異比較采用單因素方差分析，采用SPSS 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2 組試驗(yàn)兔手術(shù)后均無(wú)感染，精神狀態(tài)良好，活動(dòng)正常，采食、飲水及糞便正常，毛色有光澤，均無(wú)死亡。

2.1 種植后14 d 時(shí)2 組試驗(yàn)兔肝功能生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，試驗(yàn)組AST、ALT 均顯著高于對(duì)照組。

表1 2 組試驗(yàn)兔種植后14 d 肝功能檢測(cè)結(jié)果（n =10）

2.2 種植后14 d 時(shí)全數(shù)字化彩色多普勒超聲診斷儀觀察情況

彩色多普勒超聲診斷儀觀察可見(jiàn)腫瘤種植兔肝臟都有腫瘤生長(zhǎng)，成模率為100%。二維超聲可見(jiàn)內(nèi)部不均質(zhì)低回聲，呈圓形或橢圓形，邊界尚清，未見(jiàn)明顯壞死的無(wú)回聲區(qū)（圖1）。彩色多普勒超聲可見(jiàn)腫瘤內(nèi)和腫瘤周邊有點(diǎn)狀、條狀或環(huán)抱狀血流信號(hào)（圖2）。經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注0.2 mL 六氟化硫微泡造影劑數(shù)秒后可見(jiàn)腫瘤組織周邊出現(xiàn)點(diǎn)狀增強(qiáng)并逐漸延伸至腫瘤內(nèi)部，隨后迅速消退，呈明顯的“快進(jìn)快出”特征（圖3）。腫瘤種植14 d 時(shí)兔肝腫瘤最大直徑a為（1.20±0.16）cm，最小直徑b為（0.96±0.12）cm，體積V為（0.57±0.21）cm3（V=0.5ab2）。對(duì)照組未見(jiàn)異常變化。

圖1 二維超聲提示不均質(zhì)低回聲，邊界尚清

圖2 彩色多普勒顯示有血流信號(hào)

圖3 超聲造影后呈明顯的“快進(jìn)快出”特征

2.3 腫瘤種植兔肝的大體和病理觀察

肉眼可見(jiàn)腫瘤種植兔肝實(shí)質(zhì)內(nèi)呈灰白色結(jié)節(jié)狀，呈魚(yú)肉樣，質(zhì)硬，無(wú)包膜（圖4）。HE 染色后低倍鏡下可見(jiàn)肝內(nèi)多有癌巢，與周圍肝實(shí)質(zhì)邊界不清晰，結(jié)締組織較少。腫瘤細(xì)胞排列分散，腫瘤細(xì)胞間可見(jiàn)新生毛細(xì)血管（圖5）。高倍鏡下可見(jiàn)瘤細(xì)胞體積增大，形態(tài)不規(guī)整，細(xì)胞呈無(wú)序排列。胞漿豐富、淡紅色，胞核肥大，瘤細(xì)胞大小及形態(tài)各異，染色不均勻，多見(jiàn)核分裂（圖6）。對(duì)照組未見(jiàn)異常變化。

圖4 兔腫瘤呈白色魚(yú)肉樣

圖5 HE 染色后低倍鏡病理觀察

圖6 HE 染色后高倍鏡病理觀察

3 討 論

1）兔VX2 肝癌模型制備改良的探究很有必要。目前，常規(guī)的制備肝癌模型動(dòng)物有大鼠、小鼠、兔、樹(shù)鼩、土撥鼠、斑馬魚(yú)等，由于動(dòng)物成本、飼養(yǎng)條件、外科手術(shù)和介入等條件因素的限制，比較常見(jiàn)的還是選用兔來(lái)制作肝癌模型[3]。兔VX2 腫瘤細(xì)胞株是由Shope 病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗狀細(xì)胞癌，經(jīng)過(guò)70 多次移植傳代建立腫瘤細(xì)胞株。它是一種侵襲強(qiáng)可移植的腫瘤細(xì)胞株，可接種到兔的肌肉、腎臟、腦、肝臟、乳腺、子宮等組織器官內(nèi)制備成種植性腫瘤動(dòng)物模型。其中，種植接種兔VX2 肝癌模型比較類似于人的肝癌，經(jīng)常將其應(yīng)用于肝癌診斷、發(fā)病機(jī)制等的基礎(chǔ)研究，是臨床研究肝癌較為常用動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭籟4]。制作兔VX2 肝癌模型常用VX2 細(xì)胞懸液種植、腫瘤組織懸液種植及肝內(nèi)腫瘤塊移植3 種方法。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，肝內(nèi)腫瘤塊移植可在超聲、CT、MRI、DSA 等引導(dǎo)下進(jìn)行種植[5]。但是種植之后腫瘤塊會(huì)經(jīng)竇道口脫落而影響建模的成功率，建模的穩(wěn)定性相對(duì)較差，難以滿足大批量兔VX2 肝癌模型的應(yīng)用研究需要。所以本試驗(yàn)對(duì)傳統(tǒng)開(kāi)腹肝內(nèi)種植瘤塊法進(jìn)行了改良，為大批量穩(wěn)定建模提供了保障。改良開(kāi)腹肝內(nèi)種植瘤塊法是使用滅菌的不銹鋼彎尖頭或者帶針芯的腫瘤植入針（2.1*50）從同一個(gè)入口并以60°為邊界朝3 個(gè)方向刺破肝組織建立竇道，接種3 塊腫瘤塊。入口只是一個(gè)，對(duì)肝臟的機(jī)械損傷不大。同一個(gè)入口接種3塊腫瘤塊在一定程度上提高了種植腫瘤成活的機(jī)率。在接種3 塊腫瘤塊后在開(kāi)口處用縫合線縫合肝包膜，可有效防止腫瘤塊的脫出，很大程度上防止異位種植瘤的發(fā)生。改良法采用壓迫止血，未使用明膠海綿止血，也降低因使用明膠海綿與腹壁發(fā)生粘連的概率。因此，試驗(yàn)采用改良開(kāi)腹肝內(nèi)同一口三點(diǎn)種植腫瘤塊制備VX2 兔肝癌模型，具有操作簡(jiǎn)單、成模率高、可重復(fù)性好和可大批量建模的優(yōu)點(diǎn)。

2）肝功能生化指標(biāo)ALT 和AST 對(duì)肝細(xì)胞損傷與否及損傷程度有敏感的變化[6]。當(dāng)肝細(xì)胞急性損傷時(shí)，血清ALT 升高反應(yīng)最為靈敏。當(dāng)肝細(xì)胞慢性損傷時(shí)，血清AST 升高反應(yīng)超過(guò)ALT，因此AST 主要提示的是肝臟損傷程度。試驗(yàn)中兔VX2 肝癌模型ALT 和AST 都顯著高于對(duì)照組，這與吳海東等[7]研究結(jié)果相接近。說(shuō)明兔VX2 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)破壞兔肝細(xì)胞，引起了肝細(xì)胞的損傷。

3）超聲影像技術(shù)在兔VX2 肝癌模型觀察中發(fā)揮重要的作用。本試驗(yàn)改良建立兔VX2 肝癌模型，因兔腹壁相對(duì)較薄，且肝左葉的厚度與人的甲狀腺相當(dāng)，故可充分利用超聲高頻探頭在淺表器官顯像上的特有優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)兔肝內(nèi)種植瘤的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，獲得清楚的腫瘤聲像圖。在超聲聲像圖上，種植瘤與人類原發(fā)性肝癌的表現(xiàn)相類似，呈低回聲。本試驗(yàn)采用彩色多普勒超聲診斷儀觀察到腫瘤種植兔肝臟可見(jiàn)內(nèi)部不均質(zhì)低回聲圓形或橢圓形結(jié)節(jié)，這與孫一欣等[8]研究結(jié)果一致。超聲影像技術(shù)檢查不用開(kāi)創(chuàng)，可多次進(jìn)行，對(duì)種植瘤內(nèi)部的生長(zhǎng)狀態(tài)可作動(dòng)態(tài)觀察，而且利用全數(shù)字彩色多普勒血流成像技術(shù)，可觀察腫瘤內(nèi)外的血供情況。在試驗(yàn)中，我們應(yīng)用超聲影像技術(shù)觀察腫瘤的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)情況，說(shuō)明超聲影像技術(shù)檢查是一種簡(jiǎn)便、實(shí)時(shí)、準(zhǔn)確觀察兔VX2 肝癌影像學(xué)方法。

4）病理學(xué)檢查是兔VX2 肝癌模型建模是否成功的重要指征之一。通過(guò)10%甲醛固定經(jīng)過(guò)HE 染色制成病理切片，觀察兔肝細(xì)胞和組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，以確定病變性質(zhì)，作出病理診斷。試驗(yàn)觀察兔VX2 肝癌病理變化符合腫瘤的組織學(xué)病變特征。這與牛洪欣等[9]制備兔VX2 肝癌模型后取兔做肝病理組織學(xué)檢查相一致。從病理變化的觀察結(jié)果說(shuō)明制備兔VX2 肝癌模型是成功的。

5）手術(shù)全程操作必須時(shí)刻貫穿無(wú)菌概念，包括推剪兔毛后皮膚消毒、腫瘤組織剪小后放在加有抗生素的生理鹽水里、肝臟和各層肌肉縫合使用抗生素預(yù)防感染、最外層縫合碘酒消毒后涂擦抗生素、紅霉素預(yù)防感染等，盡可能把感染的風(fēng)險(xiǎn)和幾率降到最低，以免嚴(yán)重影響建模的成功率和試驗(yàn)進(jìn)程。

6）麻醉劑選用應(yīng)盡可能符合試驗(yàn)開(kāi)展的需要。陸眠寧具有較好的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和肌肉松弛作用、用藥量少、麻醉效果好、麻醉維持時(shí)間長(zhǎng)、安全范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[10]。穩(wěn)定麻醉狀態(tài)中降低了兔的呼吸幅度，這給超聲檢查帶來(lái)便捷，但是陸眠寧麻醉劑量必須要控制好。正常兔使用劑量為0.2 mL/kg，兔VX2 肝癌模型建模后檢查使用劑量為正常使用的1/3～2/3，視具體麻醉效果進(jìn)行實(shí)時(shí)調(diào)整。在建模超聲檢查時(shí)前期預(yù)試驗(yàn)中按正常劑量麻醉引起VX2 肝癌兔的死亡，推測(cè)可能是VX2 肝癌兔建模后的抵抗力和免疫力下降所致。試驗(yàn)意外死亡致使前期試驗(yàn)工作成果毀于一旦，浪費(fèi)了大量的人力物力財(cái)力和寶貴的時(shí)間。超聲影像技術(shù)檢查完成時(shí)及時(shí)使用鹿醒寧進(jìn)行麻醉拮抗，使VX2 肝癌試驗(yàn)兔迅速恢復(fù)自主意識(shí)，盡可能減少試驗(yàn)兔的意外死亡，進(jìn)而保證試驗(yàn)順利開(kāi)展。

7）兔VX2 肝癌模型生長(zhǎng)發(fā)育可分為3 個(gè)時(shí)期即實(shí)質(zhì)期（種植后2～3 周）、壞死期（種植后4～5 周）、囊變期（種植后6～7 周）[11]。藥物試驗(yàn)、血管介入、射頻消融、腫瘤移植等盡量選擇實(shí)質(zhì)期作為最佳時(shí)期進(jìn)行，時(shí)間過(guò)早過(guò)遲試驗(yàn)效果均不佳。