徐霞 周欣 梁景耀 彭麗倩 李仰琪 林春生 萬(wàn)長(zhǎng)蘭 李振潔 李潤(rùn)祥 葉興東

廣州市皮膚病防治所皮膚科，廣州 510095

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)的免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病。目前治療尋常型銀屑病的傳統(tǒng)藥物主要有環(huán)孢素、甲氨蝶呤、阿維A等，但傳統(tǒng)藥物的不良反應(yīng)較多。雖然一些針對(duì)銀屑病發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵炎癥因子的生物制劑［如腫瘤壞死因子（TNF）-α抑制劑和白細(xì)胞介素（IL）-17A拮抗劑］已應(yīng)用于臨床，并取得了良好的效果，但這些生物制劑價(jià)格昂貴，而且銀屑病合并炎癥性腸病、結(jié)核、肝炎的患者禁用［1］。因此，探索新的有效、不良反應(yīng)少且經(jīng)濟(jì)的治療藥物仍然是銀屑病領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

免疫學(xué)異常是銀屑病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，TNF-α–IL-23–Th17炎性反應(yīng)通路在T細(xì)胞介導(dǎo)的斑塊型銀屑病中起著重要作用［2］。此外，越來(lái)越多的研究表明機(jī)體氧化應(yīng)激水平的增高在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用［3］。銀屑病皮損中存在核因子E2相關(guān)因子-2（nuclear factor-E2-related factor 2，Nrf2）水平下調(diào)，其下游的人血紅素加氧酶1（heme oxygense-1，HO-1）水平下降［4］。在銀屑病皮損處，角質(zhì)形成細(xì)胞和浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量活性氧（reactive oxygen species，ROS）［5］，ROS可作為第二信使參與調(diào)控、活化細(xì)胞膜等相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生增殖和分化［6］。丹參酮（亦稱總丹參酮）是唇形科植物丹參根部的提取物，屬于二萜醌類化合物，包括隱丹參酮、二氫丹參酮、丹參酮-Ⅰ、丹參酮Ⅱ-A等有效成分，國(guó)內(nèi)外研究表明其具有較強(qiáng)的抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮通過(guò)降低衰老模型小鼠皮膚中脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物丙二醛含量，增加超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力，從而發(fā)揮抗氧化作用［8］。但在銀屑病中，丹參酮膠囊是否通過(guò)抗炎和抗氧化應(yīng)激發(fā)揮作用目前尚未清楚。因此本研究擬通過(guò)構(gòu)建咪喹莫特（imiquimod，IMQ）誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型，探討丹參酮膠囊對(duì)銀屑病的治療作用及其對(duì)銀屑病發(fā)病機(jī)制中關(guān)鍵炎癥因子和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，揭示其治療作用機(jī)制，為其用于銀屑病治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1、試劑與儀器

（1）試劑：IMQ乳膏（美國(guó)Sigma公司），酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）稀釋液（美國(guó)eBioscience，San Diego，CA），血清TNF-α和IL-17A的ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)eBioscience公司），丹參酮膠囊（河北興隆希力藥業(yè)有限公司），抗體Nrf2［ab76026，abcam，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司］，抗體HO-1［ab52947，abcam，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司］，抗體SOD2［ab68155，abcam，艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司］，免疫組化試劑盒［RE7280-CN，澳泉（AQ），中山市澳泉醫(yī)療科技有限公司］，Evo M-MLV RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（AG11705，ACCURATE BIOTECHNOLOGY，HUNAN，Co.，Ltd），SYBR Green Premix Pro Taq HSqPCR Kit（AG11701，ACCURATE BIOTECHNOLOGY，HUNAN，Co.，Ltd）。（2）儀器：酶標(biāo)儀（BioTek Synergy HTX，Agilent Technologies Inc，美國(guó)），光學(xué)顯微鏡（Olympus D72，Olympus Corporation，日本），LC480熒光PCR儀（LC480，Roche，美國(guó)），全自動(dòng)脫水機(jī)（Leica TP1020，Leica，德國(guó)），包埋機(jī)（Arcadia，Leica，德國(guó)），切片機(jī)（Leica RM2125RTS，Leica，德國(guó)），全自動(dòng)H&E（蘇木精-伊紅）染色機(jī)（Leica EM AC20，Leica，德國(guó)）。

2、動(dòng)物飼養(yǎng)與分組給藥

Balb/C小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)：SCXK（粵）2018-0002］，雄性，體質(zhì)量18～22 g，用標(biāo)準(zhǔn)飲食和水喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)采用8周齡的小鼠，隨機(jī)分成3組：正常組、模型組和丹參酮膠囊組，每組3只。所有的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究委員會(huì)指南和機(jī)構(gòu)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的規(guī)定批準(zhǔn)的。剃除小鼠背毛露出2 cm×3 cm的皮膚區(qū)域，正常組小鼠每天背部涂抹凡士林，模型組和丹參酮膠囊組小鼠背部涂抹IMQ乳膏60 mg/d，共14 d。與此同時(shí)正常組和模型組給予腹腔注射生理鹽水，丹參酮膠囊組通過(guò)灌胃方式給予丹參酮膠囊內(nèi)容物［1 500 mg/（kg·d）］，分3次灌服，每天1次，連續(xù)8 d。于第8天，背部皮膚拍照后摘除眼球取血，脫頸處死，取皮損組織。血液室溫靜置30 min，2 000×g離心10 min，分裝后保存于-80℃冰箱中。

3、小鼠背部皮膚銀屑病表型的監(jiān)測(cè)及評(píng)分

借鑒臨床上使用的銀屑病PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)小鼠背部皮膚的炎性反應(yīng)程度進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)期間由同一人進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估內(nèi)容包括紅斑、鱗屑和増厚。評(píng)估內(nèi)容的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0＂無(wú)現(xiàn)象＂；1＂輕微＂；2＂中度＂；3＂顯著＂，4＂十分顯著＂?？偡值牡梅譃榧t斑、鱗屑以及增厚各項(xiàng)評(píng)分之和，以總分評(píng)估炎癥嚴(yán)重反應(yīng)程度。

4、組織學(xué)分析

將受試區(qū)皮膚置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片，然后對(duì)石蠟切片進(jìn)行HE染色。使用光學(xué)顯微鏡檢查觀察皮膚組織病理學(xué)變化。

5、ELISA

血液經(jīng)離心機(jī)2 000×g離心10 min，產(chǎn)生血清樣本。血清樣本用ELISA稀釋液（eBioscience，San Diego，CA，USA）稀釋10倍。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)（eBioscience），測(cè)定血清TNF-α和IL-17A濃度。使用BMG酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm和540 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度。

6、數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為計(jì)量資料，符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS軟件18.0（芝加哥，美國(guó)）軟件統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析各組間的差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1、丹參酮膠囊改善IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠的形態(tài)學(xué)特征

與正常對(duì)照小鼠相比，IMQ外擦5 d后小鼠背部出現(xiàn)銀屑病樣病變癥狀，如出現(xiàn)紅斑、鱗屑增多以及皮膚增厚（圖1）。與IMQ組相比，丹參酮膠囊處理組小鼠背部皮損紅斑減輕、鱗屑減少、皮膚厚度變薄，并且銀屑病PASI評(píng)分下降（P<0.05）（圖2）。HE染色顯示IMQ誘導(dǎo)組小鼠背部皮膚出現(xiàn)表皮增生，棘層增厚，丹參酮膠囊處理組表皮層厚度顯著降低（圖3）。以上結(jié)果提示丹參酮膠囊可以改善IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠的皮損，降低表皮厚度，說(shuō)明其對(duì)銀屑病樣皮損有治療效果。

圖1 各組小鼠皮膚外觀

圖2 丹參酮膠囊顯著減輕銀屑病樣小鼠的紅斑（A）、鱗屑（B）、皮膚厚度（C）以及PASI評(píng)分（D）

圖3 A為HE染色觀察小鼠皮膚病理變化（原始放大倍數(shù)，頂部40×，底部200×）；B為顯微鏡下測(cè)定表皮厚度

2、丹參酮膠囊降低銀屑病樣小鼠血清中IL-17A和TNF-α水平

IL-17A和TNF-α是銀屑病發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子，為了探討丹參酮膠囊對(duì)這兩個(gè)關(guān)鍵細(xì)胞因子表達(dá)是否有影響，我們檢測(cè)了小鼠血清中IL-17A和TNF-α的水平。與正常對(duì)照組相比，IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠血清中IL-17A和TNF-α水平升高，而丹參酮膠囊處理后可以降低銀屑病樣小鼠血清中IL-17A和TNF-α水平（圖4）。

圖4 丹參酮膠囊降低銀屑病樣小鼠血清中IL-17A（A）和TNF-α（B）的水平

3、丹參酮膠囊在銀屑病樣小鼠中的抗氧化作用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，IMQ誘導(dǎo)后，組織中Nrf2、HO-1、SOD2和NAD（P）H醌氧還原酶-1［NAD（P）H quinoneoxid oreductase 1，NQO1］的mRNA水平顯著降低，丹參酮膠囊處理后，銀屑病樣小鼠組織中Nrf2、HO-1、SOD2和NQO1的mRNA水平明顯升高（圖5）。免疫組化染色也顯示丹參酮膠囊增加了IMQ誘導(dǎo)的銀屑病小鼠皮膚組織中Nrf2、HO-1和SOD2的表達(dá)（圖6）。以上結(jié)果提示丹參酮膠囊在銀屑病樣小鼠中具有抗氧化作用。

圖5 丹參酮膠囊誘導(dǎo)Nrf2（B）及下游基因HO-1（A）、SOD2（C）和NQO1（D）的mRNA轉(zhuǎn)錄

圖6 丹參酮膠囊誘導(dǎo)Nrf2（B）及下游蛋白HO-1（A）和SOD2（C）的表達(dá)

討 論

銀屑病是一種常見(jiàn)的慢性、復(fù)發(fā)性的炎癥性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化的異常，角質(zhì)層中性粒細(xì)胞聚集所形成的Munro微膿瘍以及真皮淺層血管周圍以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)是銀屑病的3個(gè)最主要的病理特點(diǎn)［9］。最近的研究表明，一些突變可能導(dǎo)致免疫系統(tǒng)異?；钴S系統(tǒng)，從而導(dǎo)致炎性反應(yīng)增強(qiáng)以及隨之而來(lái)的氧化應(yīng)激反應(yīng)［10］。

既往研究顯示，Th1細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)、Th17細(xì)胞活化及IL-23/IL-17軸參與了IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損的形成［11］。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣模型中也存在異常的氧化-抗氧化系統(tǒng)，例如髓過(guò)氧化物酶水平升高，SOD活性降低［12］。因此，我們選擇這一模型用于研究丹參酮膠囊的抗炎和抗氧化作用。IMQ外擦5 d后，小鼠背部出現(xiàn)銀屑病樣病變癥狀，包括紅斑、鱗屑、皮膚增厚。組織病理學(xué)檢查也證實(shí)小鼠背部皮膚表皮棘細(xì)胞層明顯增厚。我們用ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠血清中TNF-α和IL-17A水平較正常對(duì)照組升高，這與銀屑病患者血清中TNF-α和IL-17A的水平升高相一致［13-14］。此外本研究也發(fā)現(xiàn)銀屑病樣小鼠組織中Nrf2、HO-1、SOD2和NQO1的mRNA水平顯著降低，揭示銀屑病樣模型小鼠中存在抗氧化應(yīng)激反應(yīng)減弱。氧化應(yīng)激可通過(guò)多種信號(hào)通路促進(jìn)炎性反應(yīng)，包括NF-κB、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活因子3（STAT3）轉(zhuǎn)錄［2，4］。因此，我們推測(cè)銀屑病樣小鼠體內(nèi)可能由于抗氧化應(yīng)激能力減弱，導(dǎo)致過(guò)量的ROS不能被清除，增強(qiáng)了MAPK/AP-1、NF-κB和JAK-STAT等信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得炎癥因子及趨化因子表達(dá)增多，從而對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖與分化產(chǎn)生影響。

丹參酮膠囊處理后銀屑病樣小鼠血清中IL-17A和TNF-α水平下降。本研究提示丹參酮膠囊可以降低銀屑病發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞因子IL-17A和TNF-α的水平，從而對(duì)銀屑病的炎癥水平造成影響。TNF-α是一種在炎癥和自身免疫性疾病中具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，通過(guò)多種方式直接或間接地誘導(dǎo)銀屑病的病理發(fā)生。使用TNF-α受體拮抗劑依那西普可以降低斑塊型銀屑病患 者 體 內(nèi)IL-1、IL-8、干 擾 素（IFN）-γ誘導(dǎo)蛋白（CXCL10）和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3a（CCL20）mRNA的表達(dá)，從而分別引起中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)減少［15］。IL-17A被認(rèn)為是建立和維持銀屑病表型的關(guān)鍵細(xì)胞因子。IL-17A通過(guò)結(jié)合角質(zhì)形成細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、皮膚纖維母細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞上的IL-17A受體而發(fā)揮作用［16］。IL-17A可以激活皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞促進(jìn)其增殖，亦可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞釋放趨化因子從而導(dǎo)致中性粒細(xì)胞和可產(chǎn)生IL-17A的CCR6+免疫細(xì)胞的募集［17］。此外，IL-17還可與TNF-α等炎癥因子協(xié)同，放大加強(qiáng)其致炎效應(yīng)［18］。

機(jī)體氧化與抗氧化的平衡有多種機(jī)制參與，其中Nrf2是啟動(dòng)抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，Nrf2激活劑可上調(diào)其下游的抗氧化酶基因如HO-1、SOD、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶等和Ⅱ相解毒酶如NQO1、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸羧基轉(zhuǎn)移酶等靶基因。國(guó)外Ⅲ期臨床試驗(yàn)顯示二甲基延胡索酸對(duì)中、重度銀屑病患者有較強(qiáng)療效［19］。二甲基延胡索酸對(duì)銀屑病的治療作用與其可通過(guò)激活Nrf2，上調(diào)谷胱甘肽、誘導(dǎo)抗氧化基因的表達(dá)，進(jìn)而減少ROS的產(chǎn)生相關(guān)［5］。因此，糾正銀屑病患者體內(nèi)異常的氧化應(yīng)激，是銀屑病治療的潛在靶點(diǎn)。Tao等［20］對(duì)紫外線光損傷的研究，發(fā)現(xiàn)總丹參酮中的丹參酮-Ⅰ、二氫丹參酮、丹參酮Ⅱ-A和隱丹參酮可以通過(guò)激活Nrf2，誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)NQO1和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因表達(dá)，增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的水平。因此，我們推測(cè)丹參酮膠囊可能可以通過(guò)激活Nrf2在銀屑病模型中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。我們的研究結(jié)果也顯示丹參酮膠囊可以增加銀屑病樣小鼠皮膚組織中Nrf2、HO-1、SOD2和NQO1的mRNA水平，免疫組化也證實(shí)HO-1、SOD2和Nrf2的蛋白水平表達(dá)增加。以上研究提示丹參酮膠囊可以通過(guò)激活Nrf2及其下游抗氧化基因從而在銀屑病樣小鼠模型中發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

綜上所述，丹參酮膠囊對(duì)小鼠銀屑病樣病變癥狀的改善作用，與其可降低血清中IL-17A和TNF-α的水平及激活Nrf2通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)。由于丹參酮膠囊是復(fù)合成分，后續(xù)可進(jìn)一步對(duì)其中的單體進(jìn)行研究，篩選出對(duì)銀屑病模型治療具有最佳效果的單體及其合適的劑量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突