閆馨月，賈亦佳，孫詩艷，張東蒙，李 楊*，2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150050）

火麻油富含多不飽和脂肪酸，主要為亞油酸和亞麻酸[1]。火麻油中n-6與n-3系脂肪酸質(zhì)量比大致為4∶1~6∶1，與膳食營養(yǎng)素參考攝入量相符[2]。此外，火麻油富含氨基酸、礦物質(zhì)、植物甾醇、生育酚等多種成分，營養(yǎng)價值豐富[3]?；鹇橛途哂刑岣呷梭w免疫力、抑制癌細胞生長、預(yù)防動脈粥樣硬化、抗菌消炎、延緩皮膚衰老等功能，被譽為“長壽油”，是一種潛在的藥食同源食品?；鹇橛鸵装l(fā)生氧化酸敗，從而破壞其中的營養(yǎng)成分，并且造成風味損失。將火麻油制成納米乳液，可增強其穩(wěn)定性，擴大適用范圍。大豆分離蛋白（SPI）因具有良好的乳化性和兩親性，較適用于制備水包油型納米乳液[4]，但是大豆分離蛋白單獨作為乳化劑制備納米乳液穩(wěn)定性差[5]，通常情況下與其他乳化劑復(fù)配使用，如多糖[6]、大豆卵磷脂[7]。大豆卵磷脂是一種天然乳化劑，可增強大豆分離蛋白的乳化性，Mottola等發(fā)現(xiàn)，大豆卵磷脂與天然或變性大豆分離蛋白復(fù)配后可調(diào)節(jié)乳液的物理穩(wěn)定性[8]。李秋慧等研究發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白與適量磷脂進行復(fù)合，可在水-油界面形成較穩(wěn)定的薄膜，從而提高乳液的物理及氧化穩(wěn)定性[9]。山柰酚是提取于姜科植物中的一類黃酮化合物[10]。山柰酚擁有較強的抗氧化性，可清除多種自由基，延緩衰老[11]。但其水溶性較差，臨床應(yīng)用較難。因此，將山柰酚加入納米乳液，可以改善山柰酚的生物利用率，提高乳液的抗氧化能力。

納米乳液一般由水、油、乳化劑組成，有時會加入助乳化劑來調(diào)節(jié)乳液的穩(wěn)定性[12]，納米乳液的動力學(xué)穩(wěn)定性良好，在食品、化妝品、材料合成等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[13]。目前，制備納米乳液主要通過均質(zhì)、超聲、微射流等方法。其中，超聲乳化優(yōu)勢明顯，不僅操作簡單、成本低廉，而且制備的乳液粒徑小，穩(wěn)定性高[14]。超聲乳化主要是因為聲場引起的界面波破壞了油水界面的穩(wěn)定性，使油相以水滴的形式分離到水介質(zhì)中。其次，空化氣泡的內(nèi)爆產(chǎn)生沖擊波，引發(fā)連鎖反應(yīng)，破碎分散的液滴使之粒徑減小，直到液滴達到非常穩(wěn)定的乳化液的尺寸[15-16]。王霞等采用超聲技術(shù)制備了糖基化米糠蛋白納米乳液，并確定納米乳液的最佳制備條件，研究發(fā)現(xiàn)超聲乳化可提高納米乳液的穩(wěn)定性[17]。

因此，作者使用大豆分離蛋白、卵磷脂以及山柰酚作為復(fù)合乳化劑制備火麻油復(fù)合納米乳液。通過表征乳液的構(gòu)型變化及物理化學(xué)性質(zhì)，研究了火麻油復(fù)合納米乳液的物理穩(wěn)定性與氧化穩(wěn)定性，為火麻油在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大豆分離蛋白、卵磷脂、山柰酚：上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；三氯乙酸、正己烷、石油醚、乙二胺四乙酸二鈉、硫代巴比妥酸：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；1-苯胺基-8-萘磺酸（ANS）：Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 火麻油復(fù)合納米乳液的制備分別將大豆分離蛋白、卵磷脂和山柰酚用去離子水溶解，利用磁力攪拌器攪拌30 min。以體積比30∶3∶2混合均勻，再添加適量火麻油。使用IKA均質(zhì)機在10 000 r/min下均質(zhì)5 min。超聲波處理的方法參考文獻[18]并適當修改。將超聲波探頭伸入均質(zhì)后的粗乳液中，距離容器底部5 mm處。超聲頻率20 kHz，輸出功率100、200、300、400 W，處理10 min，超聲時間與間隔時間分別為5 s和4 s。

1.2.2 粒徑及Zeta電位的測定參考文獻[19]的方法并適當修改。將乳液用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋至0.5 mg/mL，采用粒度分析儀在室溫下對樣品的粒徑和Zeta電位進行測定。

1.2.3 內(nèi)源熒光光譜的測定參照文獻[20]的方法并適當修改。將樣品用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）稀釋至0.02 mg/mL后掃描。發(fā)射波長320~400 nm，激發(fā)波長285 nm，狹縫寬度2.0 nm，掃描速率2 000 nm/min。

1.2.4 表面疏水性的測定參照文獻[21]的方法，使用ANS法測量所有樣品溶液（pH 7.2）的表面疏水性（H0）。將樣品稀釋至0.005~2 mg/mL，黑暗中反應(yīng)30 min后進行光度測量。以添加ANS的磷酸鹽緩沖液作為空白對照。激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為380 nm和480 nm，縫隙寬度5 nm，樣品的H0為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與熒光強度線性方程的斜率。

1.2.5 乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測定參照文獻[22]的方法并適當修改。將樣品用SDS溶液（質(zhì)量分數(shù)0.1%）稀釋100倍并混合均勻，以SDS標準溶液作為空白對照。在500 nm處測定吸光度，計為A0。靜置10 min再次測定吸光度，記為A10，計算乳化活性（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ESI）。

式中：ρ為樣品質(zhì)量濃度，g/mL；φ為乳液與油相的體積比，φ=0.25；L為比色杯直徑，cm；N為稀釋倍數(shù)；A0為乳液的初始吸光度；A10為10 min時的吸光度；T為乳液靜置時間，min。

1.2.6 乳析指數(shù)的測定用乳析指數(shù)表征分層程度，取新鮮乳液于15 mL透明玻璃瓶中，旋緊玻璃蓋以防樣品蒸發(fā)。室溫避光儲存，在3、6、9、12、15 d時進行觀察，計算乳析指數(shù)。

式中：CI為乳析指數(shù)，%；HS為上層乳化層的高度，cm；HE為乳液總高度，cm。

1.2.7 抗氧化活性的測定

1）DPPH自由基清除率 參考文獻[23]的方法適當修改。準確稱取3.5 mg DPPH，用甲醇定容至10 mL，獲得DPPH原始溶液。每次使用前將溶液稀釋，獲得DPPH實驗溶液。測定時，將樣品用甲醇稀釋至合適質(zhì)量濃度，再與適量DPPH實驗溶液混勻，避光靜置30 min。在517 nm處測定吸光度（A3），以純?nèi)橐何舛龋ˋ2）為樣品對照組，DPPH-甲醇吸光度（A1）為空白組，甲醇吸光度（A0）為空白對照組。分別測定吸光度，計算DPPH自由基清除率。

2）ABTS自由基清除率 參考文獻[24]的方法并適當修改。取0.5 mL樣品加入4 mL ABTS工作液，避光靜置50 min。在734 nm處測定吸光度（A3），以純?nèi)橐何舛龋ˋ2）為樣品對照組，ABTS-甲醇吸光度（A1）為空白組，甲醇吸光度（A0）為空白對照組。分別測定吸光度，計算ABTS自由基清除率。

1.2.8 氧化穩(wěn)定性的測定

1）初級氧化產(chǎn)物 參照文獻[25]的方法，將6 mL異辛烷-異丙醇（體積比2∶1）混合液加到適量樣品中，振蕩混勻后在6 000 r/min下離心。取出上層溶液，添加甲醇-正丁醇（體積比2∶1）混合液至10 mL，再加入40μL硫氰酸鉀溶液（3.94 mol/L）和40 μL硫酸亞鐵溶液（0.144 mol/L），避光反應(yīng)30 min，在510 nm處測定吸光度。以純凈火麻油作為對照。脂質(zhì)氫過氧化物的濃度（以POV表示）根據(jù)異丙苯過氧化氫標準品繪制的標準曲線計算。

2）次級氧化產(chǎn)物 參照文獻[26]的方法。將4 mL TBARS測試液（質(zhì)量分數(shù)15%三氯乙酸與質(zhì)量分數(shù)0.375%硫代巴比妥酸溶于0.25 mol/L HCl）加到2 mL乳液中。沸水加熱20 min后冷卻至室溫，用直徑1.2μm的微孔濾膜過濾，取適量濾液于532 nm處測定吸光度。以純凈火麻油作為對照。乳液中硫代巴比妥酸（TBA）的質(zhì)量分數(shù)通過1，1，3，3-四乙氧基丙烷標準品繪制的標準曲線計算。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)均在測定3次后得出，結(jié)果表示為平均值±標準差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 18.5軟件，P＜0.05為差異顯著。繪圖采用Origin 9.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑及Zeta電位

不同超聲功率對火麻油復(fù)合納米乳液的平均粒徑、多分散性指數(shù)（PDI）以及Zeta電位的影響見表1。當超聲功率逐漸提高至300 W時，乳液的平均粒徑由未超聲處理的2 262.00 nm降低到804.33 nm。這是由于超聲處理產(chǎn)生了較強的空化效應(yīng)和湍流作用，使乳液顆粒尺寸減小[27]。然而，超聲功率達到400 W時，平均粒徑并未繼續(xù)減小。推測原因可能是蛋白質(zhì)經(jīng)過一段時間的高功率處理后分子間重新聚集，這與Kentish等研究結(jié)果相一致[28]。通常復(fù)合乳液液滴的平均粒徑越小，對應(yīng)的PDI也會越低[29]。因此當超聲功率達到300 W時，PDI為0.183，遠小于未經(jīng)超聲處理樣品的0.676。說明超聲處理后，納米乳液的粒徑分布更加集中，在此范圍內(nèi)的液滴分散性提高，體系穩(wěn)定性隨之增加。

Zeta電位用來表征復(fù)合物的電負性。通過測定樣品表面的電荷數(shù)量，確定粒子間的靜電相互作用，進而明確穩(wěn)定體系的作用力。如表1所示，當超聲功率在300 W時，乳液顆粒表面帶電數(shù)量最多。說明在此條件下，納米顆粒間具有強烈的靜電作用。原因在于適當?shù)某曁幚硎箯?fù)合物粒徑減小，顆粒的比表面積增大，暴露出更多的帶電殘基，導(dǎo)致靜電作用增強[30]。靜電相互作用的提高會破壞復(fù)合乳液中的大分子聚集體，改善體系的穩(wěn)定性。

表1 不同超聲處理條件下火麻油復(fù)合納米乳液的物理性質(zhì)Table 1 Physical properties of hemp seed oil composite nano-emulsion under different ultrasonic treatment conditions

2.2 內(nèi)源熒光光譜

內(nèi)源熒光是通過觀察光譜的強度以及最大發(fā)射波長的位置來分析蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的方法[31]。以SPI的色氨酸（Trp）殘基作為發(fā)色基團，研究超聲處理后蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化。不同超聲功率處理樣品的熒光強度發(fā)生顯著變化（見圖1）。隨著功率的提高，熒光強度逐漸增加。原因可能是超聲處理使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生解聚，空間構(gòu)象變得更加舒展。原本包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的Trp殘基暴露于分子表面，導(dǎo)致熒光強度增加。超聲功率由0增加到400 W的過程中，光譜逐漸紅移。表明超聲處理主要影響SPI的三級結(jié)構(gòu)，功率的增加使芳香族氨基酸處于極性更強的微環(huán)境。

圖1 不同超聲處理條件下火麻油復(fù)合納米乳液的內(nèi)源熒光光譜Fig.1 Intrinsic fluorescence spectra of hemp seed oil composite nano-emulsion under different ultrasonic treatment conditions

2.3 表面疏水性

ANS是檢測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)狀態(tài)的敏感性探針，處理后的樣品折疊程度越高則熒光發(fā)射強度越大。H0可以直觀地表示蛋白質(zhì)表面的疏水基團數(shù)目，同時可以間接表明蛋白質(zhì)構(gòu)象、功能以及體系穩(wěn)定性的變化[32]。如表1所示，超聲功率提高的同時H0也隨之增加，未經(jīng)超聲處理的樣品H0最低（7 411.06）。推測原因可能是疏水性殘基被親水基團包裹，封裝在大豆分離蛋白的結(jié)構(gòu)內(nèi)部。當功率為400 W時H0增大至17 140.16。出現(xiàn)這種結(jié)果可能是超聲處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)的亞基解離以及肽鏈的部分擴張，使得內(nèi)部疏水性殘基游離于分子表面。Wu等利用不同的超聲波功率加工扇貝中的蛋白質(zhì)也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[33]。

2.4 乳化活性及乳化穩(wěn)定性

乳化性與蛋白質(zhì)在油-水界面上的吸附、擴散和重排有關(guān)，是蛋白質(zhì)的界面性質(zhì)之一。其中EAI表示蛋白質(zhì)在水相中的溶解性以及磷脂在油-水界面的成膜性；ESI是指油-水界面聚集并穩(wěn)定小液滴的能力[34]。圖2為復(fù)合納米乳液的EAI和ESI。與未超聲處理的樣品相比，超聲處理納米乳液的EAI及ESI均顯著提高（P＜0.05）。這是因為處理后的樣品結(jié)構(gòu)進一步伸展，內(nèi)部組織暴露于表面，柔性結(jié)構(gòu)的區(qū)域發(fā)生變化。分子形態(tài)由緊湊的球狀轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮⒔Y(jié)構(gòu)，有利于更多的蛋白質(zhì)吸附在油水界面。因此，超聲處理的樣品EAI增大。同時，根據(jù)復(fù)合體系粒徑的研究結(jié)果表明（見表1），超聲處理后樣品的粒徑逐漸減小，使得蛋白質(zhì)吸附到油水界面的速度加快，進一步降低界面張力，導(dǎo)致形成的小液滴持續(xù)聚集并且難以破裂，因此ESI得到改善。Greta等也發(fā)現(xiàn)超聲波可以改變蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，提高H0從而改善蛋白質(zhì)的乳化性能[35]。當超聲功率達到400 W時，復(fù)合納米乳液的EAI和ESI都有降低的趨勢。推測原因可能是高強度超聲使蛋白質(zhì)輕微變性，形成不溶性聚集體。由于聚集體表面電荷分布不均勻，導(dǎo)致蛋白質(zhì)顆粒受到靜電斥力而脫離油-水界面，造成體系乳化性能下降。

2.5 乳析指數(shù)

乳析指數(shù)是表征乳液中油-水兩相的聚集或分散程度，是評價體系儲存穩(wěn)定性的重要指標。儲存15 d內(nèi)不同超聲功率處理條件下火麻油復(fù)合納米乳液的CI變化見圖3。未經(jīng)超聲處理的乳液在儲存3 d后具有明顯分層，而經(jīng)過超聲處理的樣品僅有輕微分層現(xiàn)象。隨著儲存時間的延長，所有樣品的CI都出現(xiàn)不同程度的增加。超聲功率為0的樣品變化最明顯，而超聲功率較大的樣品增加幅度較小。推測可能是由于超聲處理的空化作用產(chǎn)生劇烈的物理效應(yīng)（微射流、剪切力、沖擊波、湍流等）和高活性的自由基，這些自由基可以攻擊蛋白質(zhì)分子的側(cè)鏈和骨干結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。進一步增強SPI與磷脂的相互作用，有助于形成界面吸附膜，提高乳液的穩(wěn)定性[36]。

圖2 不同超聲處理條件下火麻油復(fù)合納米乳液的EAI及ESIFig.2 Emulsifying activity and emulsion stability of hemp seed oil composite nano-emulsion under different ultrasonic treatment conditions

圖3 不同超聲處理條件下火麻油復(fù)合納米乳液的乳析指數(shù)Fig.3 Creaming index of hemp seed oil composite nanoemulsion under different ultrasonic treatment conditions

2.6 抗氧化活性

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，當抗氧化劑存在時，DPPH接受一個電子或氫離子形成穩(wěn)定的DPPH-H化合物，褪色程度反映了抗氧化劑的清除能力[37]。如圖4所示，火麻油復(fù)合納米乳液在經(jīng)過超聲處理后的DPPH自由基清除率均大于未經(jīng)處理的樣品?？赡艿脑蚴浅曁幚砗蟠蠖狗蛛x蛋白的空間構(gòu)象改變，暴露了大量具有抗氧化活性的氨基酸。超聲功率為400 W時，樣品的抗氧化能力出現(xiàn)下降的趨勢。原因可能是過度超聲使蛋白質(zhì)形成較大的聚集體，導(dǎo)致樣品的溶解度下降。因此，DPPH自由基清除能力較弱。

ABTS自由基清除原理類似于DPPH，同樣是與自由基清除劑反應(yīng)導(dǎo)致體系褪色。ABTS自由基的變化趨勢與DPPH相似（見圖4）。有研究指出抗氧化能力包括斷鏈和供氫兩種能力[37]。因此，該實驗結(jié)果表明不同超聲功率處理復(fù)合納米乳液對這兩種能力有一定影響。

圖4 不同超聲處理條件下火麻油復(fù)合納米乳液的抗氧化活性Fig.4 Oxidative activity of hemp seed oil composite nano-emulsion under different ultrasonic treatment conditions

2.7 氧化穩(wěn)定性

氧化穩(wěn)定性是評價油脂質(zhì)量的重要參數(shù)之一，作者研究了45℃加速氧化條件對火麻油復(fù)合納米乳液POV和TBA的影響（見圖5）。在初始階段，樣品的POV幾乎為零。隨著時間延長，各組分的POV均緩慢增加。第4天，火麻油的POV迅速攀升，并與火麻油復(fù)合納米乳液形成顯著差異。第8天，與超聲處理樣品相比，未經(jīng)超聲處理樣品的POV也出現(xiàn)大幅增長。經(jīng)過14 d儲存后，火麻油的POV是復(fù)合納米乳液的2倍。由此可見，火麻油與其他大分子物質(zhì)復(fù)合后被包埋在內(nèi)部，可以有效阻止油脂接觸外界氧氣，減緩氧化速度，延長儲存時間[38]。未經(jīng)超聲處理樣品的POV是超聲功率為300 W樣品的1.84倍。原因可能是適當超聲處理使火麻油與其他大分子物質(zhì)的結(jié)合更加緊密，表面存在的油脂減少，氧氣可以攻擊的位點數(shù)量下降。

油脂氧化產(chǎn)物的不穩(wěn)定性使其容易分解成醛、酮、醇和酸類等小分子物質(zhì)[39]，這些物質(zhì)對食品的風味、色澤、口感和質(zhì)量均有消極影響，同時會產(chǎn)生自由基等有害物質(zhì)，引發(fā)慢性疾病[40]。TBA法是測定不飽和脂肪酸自動氧化產(chǎn)物的常用方法[41]。如圖5（b）所示，45℃加速氧化條件下，火麻油及復(fù)合納米乳液的TBA隨著時間的推移而增加。TBA的變化趨勢與POV類似。這一結(jié)果與陳雅琪等關(guān)于南瓜子油乳液的制備及穩(wěn)定性的研究結(jié)果一致[39]。原因可能是由于體系中的乳化劑將火麻油包裹在液滴內(nèi)，避免了油脂與氧氣以及促氧化物質(zhì)的接觸。

圖5 不同超聲處理條件下火麻油復(fù)合納米乳液的氧化穩(wěn)定性Fig.5 Oxidative stability of hemp seed oil composite nano-emulsion under different ultrasonic treatment conditions

3 結(jié) 語

以火麻油作為油相，大豆分離蛋白、卵磷脂、山柰酚作為乳化劑，應(yīng)用超聲處理制備火麻油復(fù)合納米乳液。探究不同超聲功率（100、200、300、400 W）對乳液穩(wěn)定性的影響，揭示復(fù)合體系穩(wěn)定性隨超聲條件變化的規(guī)律。通過對乳液粒徑、PDI、Zeta電位、內(nèi)源熒光光譜、H0、乳化性、CI以及氧化穩(wěn)定性的測定發(fā)現(xiàn)，當超聲功率為300 W時，由于超聲處理的空化作用使體系分散均勻，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性殘基暴露于表面，乳液的內(nèi)源熒光光譜紅移，熒光強度與H0均提高，并且具有較好的物理穩(wěn)定性和氧化穩(wěn)定性。隨著功率增大至400 W，蛋白質(zhì)聚集，弱化與其他大分子的相互作用，導(dǎo)致復(fù)合體系的穩(wěn)定性下降。這表明適當?shù)某曁幚恚?00 W）可以改善復(fù)合乳液的儲存特性。該結(jié)果為提高火麻油的穩(wěn)定性，延長產(chǎn)品貨架期提出了可行的思路。同時為超聲技術(shù)運用于產(chǎn)品的加工提供一定的理論依據(jù)。