李雪晗，張海洋，劉 琦，毛相朝*，2

（1.中國海洋大學 食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266237）

磷脂（phospholipids，PLs）是一類含磷的脂質的總稱，多數是天然產物，少數通過人工合成獲得。PLs中同時含有極性與非極性的部分，是一種重要的天然表面活性劑，在食品、醫(yī)藥及化妝品等領域應用廣泛[1]。PLs極性的頭基部分是磷脂分類的標準之一，其非極性部分的脂肪鏈長與飽和度用于劃分磷脂的亞組分。

近年來，糖基作為磷脂頭基的磷脂酰糖苷受到了廣泛關注，其中，以磷脂酰葡萄糖苷（phosphatidylglucoside，PtdGlc）的 研 究 最 為 充 分。PtdGlc可從生物體中分離獲得[2]，其通過脂筏富集在質膜中形成結構域，以維持生物體穩(wěn)態(tài)[3]，隨后PtdGlc及其衍生物亦被證明在膠質細胞發(fā)育與分化中具有重要的作用[4-5]。除此之外，多項研究表明，磷脂制備的脂質體作為靶向遞送的載體，可以減少包封物對生物體產生的副作用[6]，磷脂包埋還可以提高包封物透過細胞膜的能力[7]。此外，由于糖基中大量的羥基相互作用形成氫鍵，使得磷脂酰糖苷所制備的脂質體具備更好的穩(wěn)定性，因此在靶向藥物遞送與緩釋方面具有更為重要的應用前景。糖基的種類會對脂質體大小、聚集程度、脫水及復水穩(wěn)定性等方面產生影響，例如，磷脂酰蔗糖苷的穩(wěn)定性優(yōu)于磷脂酰葡萄糖苷和磷脂酰棉子糖苷[8]。

GlcNAc作為葡萄糖的一種衍生物，在結構上由乙酰氨基取代了葡萄糖2位的羥基。GlcNAc廣泛存在于自然界中，也是甲殼素與殼聚糖的主要組成單體。GlcNAc作為一種重要的功能性單糖，具有抗腫瘤及免疫調節(jié)活性[9]，在臨床中亦可有效治療骨關節(jié)損傷與炎癥[10]，參與肝腎解毒[11]。此外，GlcNAc作為具有保濕補水功能的透明質酸單體更易被人體吸收，進而可被添加至化妝品和護膚品中[12]，還可用于清除自由基并在一定程度上改善面部色素沉積[13]。

2008年，Greimel等利用PLD的催化作用，在雙相反應體系中合成了磷脂酰-β-D-磷脂酰葡萄糖苷[14]。PLD特異性作用于磷脂的磷酸二酯鍵，一般可以催化兩種反應[15]：在水解作用下，可將磷脂酰膽堿水解生成磷脂酸與膽堿；在轉酯作用下，將糖基作為頭基基團取代磷脂酰膽堿的膽堿部分，合成磷脂酰糖苷。雙相反應體系包括含有糖基供體和酶粉緩沖溶液的水相以及含有磷脂酰膽堿的有機溶劑相。在新型反應體系中，離子液體由于其環(huán)保溶劑的性質，被認為是催化反應介質的另一種選擇[16]。2012年，有研究者首次將離子液體應用于PLD介導的轉酯反應中合成磷脂酰絲氨酸，發(fā)現離子液體對PLD的水解作用有強抑制作用，能夠更高效地合成轉酯產物，具有廣泛的應用前景[17]。

為此，以PLD催化GlcNAc轉酯合成PtdGlcNAc的反應作為基礎，通過比較不同離子液體中酶的活性與反應參數的差異，優(yōu)化轉酯反應條件以高效制備PtdGlcNAc，利用合成的PtdGlcNAc制備脂質體并對其進行初步表征。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PLD:由實驗室保藏菌株發(fā)酵制備；GlcNAc（純度99%）：Solarbio公司產品；大豆卵磷脂（純度95%）：Avanti Polar Lipids公司產品；7種離子液體1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[EMIm][PF6]）、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIm][PF6]）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[BMIm][BF4]）、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽（[BMIm][Ac]）、1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（[BMIm][Cl]）、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽（[BMIm][NO3]）、1-己 基-3-甲 基 咪 唑 六 氟 磷 酸 鹽（[HMIm][PF6]）：上海成捷化學有限公司產品；0.22 μm尼龍66有機濾膜、0.45μm水相濾膜：津騰公司產品；膽堿氧化酶、過氧化物酶：美國Sigma-Aldrich公司產品；其余分析純試劑均為國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.2 實驗儀器與設備

水浴搖床：上海知楚儀器有限公司產品；TGL16型離心機：長沙英泰儀器有限公司產品；LC-20AT型高效液相色譜儀、ELSD-16型蒸發(fā)光散射探測器：日本島津公司產品；MULTISKAN FC型酶標儀、Q Exactive組合型四極桿Orbitrap質譜儀：賽默飛世爾科技公司產品；N-1300系列旋轉蒸發(fā)儀：EYELA東京理化器械株式會社產品；HH-3A型水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司產品；超聲波細胞粉碎機：寧波新芝生物科技股份有限公司產品。

1.3 試劑配制

1.3.1 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液A：100 mmol/L一水合檸檬酸溶液（C6H8O7·H2O）；B：100 mmol/L二水合檸檬酸鈉溶液（Na3C6H5O7·2H2O）。A、B溶液以體積比3.8∶16.2充分混合，配置成pH 6.0的100 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PLD水解反應顯色液將50 U膽堿氧化酶、100 U過氧化物酶、100 mg 4-氨基安替比林、50 mg苯酚、1.0 g曲拉通TristanX-100溶解至100 mL的1 mol/L Tris-HCl緩沖液中，超聲混勻后分裝，保存至-80℃冰箱中，用時提前取出，常溫解凍。

1.4 實驗方法

1.4.1 離子液體預處理PLD將1 U的PLD酶粉加至600μL離子液體中，將混合物置于水浴搖床中孵育1 h，控制溫度為40℃。孵育結束后，用pH 6.0的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液300μL萃取酶粉兩次。將所得的600μL離子液體與600 μL緩沖液直接加入后續(xù)轉酯反應體系中。

1.4.2 PLD離子液體轉酯反應體系實驗在15 mL的棕色具塞螺口瓶中進行。在孵育后的水相中加入0.172 g GlcNAc，充分溶解后得到600μL含有GlcNAc與PLD的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）以及600μL孵育后的離子液體，最后加入含有10 mg PC的有機溶劑。將棕色具塞螺口瓶密封后置于水浴搖床中，控制轉速為200 r/min，溫度為40℃，反應時間為12 h。定期取樣，將反應混合物在8 000 r/min下離心5 min后，吸取上層有機相溶液100μL用于后續(xù)高效液相色譜分析。

1.4.3 PLD水解活力的測定利用酶聯比色法測定PLD的水解活力[18]。PLD水解PC產生的膽堿在膽堿氧化酶和過氧化物酶的作用下可生成紅色顯色物質，利用其在500 nm下的最大吸收峰來計算PLD的水解活力。稱取不同質量濃度的氯化膽堿制作標準曲線。PLD水解活力定義為每分鐘水解產生1μmol膽堿所需要的酶量為一個酶活單位。

1.4.4 離子液體的篩選取1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[EMIm][PF6]）、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[BMIm][PF6]）、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[BMIm][BF4]）、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸鹽（[BMIm][Ac]）、1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽（[BMIm][Cl]）、1-丁基-3-甲基咪唑硝酸鹽（[BMIm][NO3]）、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽（[HMIm][PF6]）7種離子液體預處理PLD后測定PLD的水解活力與轉酯生成PtdGlcNAc的產率，選取產率高的離子液體用于后續(xù)反應優(yōu)化。

1.4.5 轉酯反應條件單因素優(yōu)化PLD轉酯合成PtdGlcNAc的反應中，以產物產率為指標進行單因素實驗設計。分別固定其他因素，依次評價轉酯時間（2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h）、酶添加量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 U）、底物PC與GlcNAc的物質的量比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70）、有機溶劑（乙醚、甲苯、環(huán)戊基甲醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、二甲亞砜）、離子液體相與水相體積比 （0∶1、1∶4、2∶3、1∶1、3∶2、4∶1）對PtdGlcNAc產率的影響。此外，由于GlcNAc在水溶液中溶解度的局限性，故降低PC質量濃度后繼續(xù)優(yōu)化底物PC與GlcNAc的物質的量比（1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120）對PtdGlcNAc產率的影響。

1.4.6 高效液相色譜條件用HPLC-ELSD分析法測定PtdGlcNAc的產率。參照作者所在團隊建立的檢測方法[19]。檢測所需硅膠柱為YMC DIOL（5μm，250 mm×4.6 mm）和ELSD檢測器（SHIMADZU，日本）。ELSD的噴霧器壓力保持在0.45 MPa，漂移管溫度為40℃，氮氣流量為3 L/min。流動相A：正己烷、異丙醇、醋酸、三乙胺體積比為81.42∶17∶1.5∶0.08；流動相B：異丙醇、水、醋酸、三乙胺體積比為84.42∶14∶1.5∶0.08。色譜分離采用線性梯度洗脫：從初始流動相B體積分數5%開始逐漸增加其占比，25 min時體積分數達到100%，后降低至初始水平。洗脫液總流量控制在1 mL/min。PtdGlcNAc的保留時間為16.5 min。用純化的PtdGlcNAc制作標準曲線，從而對其進行定量檢測，產物結構通過質譜（MS）分析確定。

1.4.7 轉酯產物的質譜檢測利用MS分析PtdGlcNAc的相對分子質量。將高流量的氮氣通過樣品，在保持產物穩(wěn)定性的同時將原有的有機溶劑完全去除。用氯仿、甲醇體積比為1∶1的混合溶液將PtdGlcNAc復溶后進行一級質譜與二級質譜（MS與MS/MS）檢測。電噴霧離子源（ESI），負離子掃描模式，掃描范圍：m/z為80~1 200。

1.4.8 脂質體的制備首先，取轉酯反應合成的磷脂酰糖苷800μL置于旋蒸茄形瓶中，200 hPa壓力下，使物質混合均勻后調壓至50 hPa除去混合體系中的有機溶劑，直至在茄形瓶底端形成一層薄膜。真空干燥30 min，充分除凈體系內有機溶劑。然后加入5 mL去離子水，使薄膜完全溶解在水溶液中。在冰水浴環(huán)境下，超聲破碎處理制得脂質體懸濁液，超聲處理條件為：超聲功率300 W，超聲2 s，間歇2 s，處理時間10 min。最后將制得的脂質體（LipPNA）通過0.45μm水相濾膜，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.9 脂質體的表征

1）粒徑及Zeta電位表征 將新鮮制備的800 μL LipPNA加至樣品池，測量條件為：儀器平衡120 s，溫度25℃，檢測角度90°，樣品設置每組3個平行。采用馬爾文激光粒度電位儀檢測粒徑與電位并進行記錄[20]。

2）樣品形態(tài)表征 將新鮮制備的LipPNA滴于200目的方華膜上，靜置3 min，將方華膜移至烤燈下除去膜上多余水分，然后在干燥的方華膜上滴加一滴2%（體積分數）磷鎢酸染液進行負染[21]，靜置3 min，用濾紙吸干膜上多余液體后放在烤燈下使方華膜液體蒸發(fā)。通過透射電子顯微鏡在80 kV的電壓下觀察樣品的形態(tài)并拍照記錄。

3）穩(wěn)定性分析 將制得的LipPNA脂質體放置在4℃條件下，定期取樣，記錄粒徑和電位的變化，以此為依據，判斷其短期內的穩(wěn)定性。

2 結果與討論

2.1 離子液體的篩選

2.1.1 離子液體處理后PLD水解活力測定離子液體處理后的PLD，經pH 6.0的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（300μL）萃取兩次至水相中。用酶聯比色法測定水相中PLD的水解活力，設定水解活力最高的實驗組酶活為100%。所得結果見圖1。[BMIm][PF6]處理后PLD的水解活力與未處理組相當，僅僅略高于未處理組。其次，[HMIm][PF6]和[EMIm][PF6]處理后的PLD水解活力約為[BMIm][PF6]處理后酶活的85%。而[BMIm][BF4]、[BMIm][NO3]、[BMIm][Cl]、[BMIm][Ac]離子液體處理之后導致PLD的水解活力受到很大的影響，[BMIm][BF4]處理組僅為[BMIm][PF6]處理后酶活的4.4%。從水解活力角度出發(fā)，探究不同離子液體處理后的PLD催化性能差異，可為轉酯反應提供參考。

圖1 不同離子液體處理前后PLD水解活力的變化Fig.1 Changes of PLD hydrolysis activity before and after pretreatment with different ionic liquids

2.1.2 離子液體處理后PLD轉酯活力測定離子液體反應體系由三相構成：預處理PLD后的離子液體相、含有預處理后的PLD與GlcNAc的0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）水相以及含有底物PC的有機相。轉酯反應結束后，將有機相收集，利用HPLC-ELSD定量計算PtdGlcNAc產率，7種離子液體處理后的產物產率見圖2（a）。其中，經[BMIm][PF6]孵育后的PLD實驗組具有明顯高于其他組分的產率。[HMIm][PF6]、[EMIm][PF6]和[BMIm][Cl]的產率次之，為[BMIm][BF6]產率的90%、84%以及42%。相反，經[BMIm][BF4]、[BMIm][NO3]、[BMIm][Ac]處理后，PtdGlcNAc幾乎無法合成，可能是因為這3種離子液體的處理對PLD的結構造成了負向的改變，導致PLD的關鍵催化位點發(fā)生變化，抑制了PLD的轉酯催化活性。通過比較圖2（b）中結果發(fā)現，[BMIm][PF6]相較于其他離子液體反應副產物最少，使PC更高效率地向PtdGlcNAc方向合成。[BMIm][PF6]是一類疏水型的離子液體，當PLD在此環(huán)境中，離子液體傾向于保存蛋白質分子周圍的基本水層[17]，因此常用于催化不同脂肪酶。綜上，由于[BMIm][PF6]參與的轉酯反應產率最高，因此可以作為后續(xù)離子液體三相反應體系中對PLD的預處理試劑。

圖2 不同離子液體預處理后PLD轉酯活力的比較Fig.2 Comparison of transphosphatidylation activities of different ionic liquids after pretreatment of PLD

2.2 產物結構鑒定

對產物的結構確定至關重要，由于缺少產物標品，故無法通過液相直接確定產物種類。因此，將轉酯反應產物溶解至氯仿、甲醇體積比為1∶1的溶劑中直接進樣進行質譜檢測。一級質譜如圖3（a）所示，一系列優(yōu)勢峰中，[M-H]-分別對應898.546 23（相對分子質量899.55）和874.436 15（相對分子質量875.44），與PtdGlcNAc的相對分子質量完全一致。質譜結果出現較多的離子峰，是因為底物PC疏水端脂肪酸為混合物，故生成的產物亦為混合物。第一個主峰相對分子質量為899.55，此峰以GlcNAc為親水頭基，兩條亞油酸殘基（C18∶2）為疏水尾端；另一個優(yōu)勢峰相對分子質量為875.44，此峰以GlcNAc為親水頭基，一條亞油酸殘基（C18∶2）和一條棕櫚酸殘基（C16∶0）為疏水尾端。此結果與底物PC中含有63%的亞油酸以及14.9%的棕櫚酸結果相對應。分別對兩個優(yōu)勢峰進行二級質譜檢測，見圖3（b）、圖3（c）。以PtdGlcNAc（C16∶0，C18∶2）為例，會進一步碎裂成m/z為153.00、255.23、279.23、391.23、671.47、773.50等特異性碎片離子，其中m/z為153.00的離子來源于N-乙酰-D-氨基葡萄糖基，m/z為255.23的離子來源于棕櫚酸殘基，m/z為279.23的離子來源于亞油酸殘基，m/z為391.23的離子來源于棕櫚酸殘基與磷酸基團，m/z為671.47的離子來源于兩個脂肪酸殘基與磷酸基團，m/z為773.50的離子來源于PtdGlcNAc的葡萄糖環(huán)碎片。由此可證明PLD催化成功合成了PtdGlcNAc。

圖3 PtdGlcNAc質譜結果鑒定Fig.3 Characterization of phosphatidyl-N-acetylglucosamine（PtdGlcNAc）by mass spectrometry

2.3 離子液體三相反應體系與傳統(tǒng)雙相反應體系的比較

目前傳統(tǒng)雙相反應體系的研究最為充分與廣泛，而離子液體反應體系在酶催化過程中的應用是近年來的研究趨勢[22]。不同轉酯時間下，PtdGlcNAc的產率見圖4。兩種反應體系隨時間的變化趨勢幾乎一致，在0~4 h內，PtdGlcNAc產率呈快速升高的趨勢；4~12 h內，PtdGlcNAc產率相較于前4 h增速趨于緩和；在12 h時達到最高產率；12 h后，產率維持在一定水平，證明在12 h時酶促反應達到平衡。最終，離子液體[BMIm][PF6]預處理PLD后，產物產率為60%，而傳統(tǒng)雙相反應體系下，產物產率僅為46%，在相同反應條件下，產率提升了將近25%。由此證明優(yōu)化后的反應體系更有助于PtdGlcNAc的合成，為研究提供了必要性。綜合考慮轉酯時間與產物產率的關系，選擇轉酯時間為12 h。

圖4 [BMIm][PF6]三相反應體系與雙相反應體系的產率比較Fig.4 Comparison of yield between[BMIm][PF6]three phase reaction system and biphase reaction system

2.4 離子液體三相反應體系條件優(yōu)化

2.4.1 酶添加量固定其余反應參數，設置0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5 U的酶添加量梯度，以考察酶添加量對轉酯反應的影響，結果見圖5（a）。隨著酶添加量的增加，GlcNAc的酯化速度不斷加快，PtdGlcNAc的產率在1 U加酶量時達到59.5%。繼續(xù)增加酶的添加量，產率維持在60%左右，為了充分發(fā)揮PLD的酶活，選擇1 U為轉酯反應的最優(yōu)酶添加量。

2.4.2 底物PC與GlcNAc的物質的量比固定其余反應參數，PC與GlcNAc的物質的量比梯度設置為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70，以考察不同物質的量比對PLD催化酯化反應的影響，結果見圖5（b）。由于GlcNAc在水溶液中溶解度的局限性，故降低PC質量濃度至原先的50%后，設置1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120的實驗組同時進行研究。隨著GlcNAc物質的量增加，PtdGlcNAc產率逐漸升高。當PC初始質量濃度為16.67 mg/mL時，物質的量比在1∶60之前，反應產率快速增加，在1∶60時增速趨緩但仍未達到平衡。同樣地，當PC初始質量濃度為8.33 mg/mL時，物質的量比在1∶120之前，產率一直處于快速增加的階段。但是，這個水平已經達到GlcNAc在水溶液中的最大溶解度，物質的量比很難再繼續(xù)增加。根據已有結論進行推測，繼續(xù)在反應體系中加大物質的量比，產物轉化率會繼續(xù)增加從而達到平衡。其原因推測是，在高質量濃度的糖溶液存在時，糖會優(yōu)先與PLD結合形成糖-PLD復合體，使糖成了優(yōu)勢的?；w，進而進行轉酯反應；當糖質量濃度較低時，水分子會更易于與PLD形成復合體從而形成大量副產物磷脂酸（phosphatidic acid，PA），導致產物產率降低。在保證產率的條件下，考慮到實驗的簡易與便捷性，當PC初始質量濃度為16.67 mg/mL時，選擇物質的量比為1∶60。

2.4.3 有機溶劑固定其余反應參數，從乙醚、甲苯、環(huán)戊基甲醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、二甲亞砜中選擇最適有機溶劑。不同有機溶劑對PLD轉酯反應的影響見圖5（c）。當有機溶劑為乙醚時，PtdGlcNAc產率最高達61.2%，環(huán)戊基甲醚中產率略低，為59.5%。除此之外，甲苯、丁酸乙酯、乙酸乙酯中的產率較低，分別為51.9%、40.9%和27.7%。使用乙酸丁酯和二甲亞砜作為有機相時則幾乎無法合成目標產物。與環(huán)戊基甲醚相比，乙醚具有刺激性與急性毒性且致迷、致幻，而環(huán)戊基甲醚作為一種新型環(huán)保高性能疏水性醚類溶劑[23]，可以降低醚類物質的毒性[24]，是其他醚類物質的綠色替代品，在各類反應中被廣泛應用。由此，選擇環(huán)戊基甲醚作為后續(xù)轉酯反應的有機溶劑。

2.4.4 離子液體相與水相體積比固定其余反應參數，設置梯度為0∶1、1∶4、2∶3、1∶1、3∶2、4∶1的離子液體相與水相體積比，以優(yōu)化離子液體添加量，結果見圖5（d）。實驗結果表明，在少量離子液體預處理PLD時會對酶造成抑制作用，隨著離子液體相體積的增加，產物PtdGlcNAc產率逐漸增加。在體積比為2∶3時，產率為38.3%略低于未經離子液體處理的44.5%，但在體積比為1∶1時，產率增加至61.5%，隨著離子液體相體積的逐漸增加，產率在體積比4∶1時達到最高為79.7%。根據結果表明，離子液體的加入能抑制水解副產物PA的生成。綜合實驗結果，選擇離子液體相與水相體積比為4∶1。

圖5 轉酯反應條件的優(yōu)化Fig.5 Optimization of transphosphatidylation reaction conditions

2.5 納米脂質體的表征

2.5.1 粒徑分析脂質體粒徑測定結果見圖6（a）。LipPNA的平均粒徑為（64.2±1.6）nm，平均多分散性指數（PDI）為0.296±0.002。根據前人的研究指出，當PDI的數值小于0.3時，制備的樣品具有更高的穩(wěn)定性，不易分層與變質[20]。此項結果證明，制備的LipPNA比較成功。

2.5.2 Zeta電位表征Zeta電位可表征帶電粒子間的排斥作用，其表面的電荷越大，穩(wěn)定性也越高[19]。根據前人的研究指出，當電位的絕對值大于30 mV時，體系穩(wěn)固，不易發(fā)生破裂，保存時間大大增加[21]。如圖6（b）所示，LipPNA帶負電荷，其Zeta電位為（-46.3±2.5）mV，絕對值大于30 mV，說明制備的樣品具有良好的穩(wěn)定性。這可能與GlcNAc糖基上存在的多個羥基之間形成了穩(wěn)定的氫鍵有關，由此增強了LipPNA的結構穩(wěn)定性。

2.5.3 透射電子顯微鏡（TEM）分析新鮮制備的LipPNA的TEM成像見圖6（c）。LipPNA呈不規(guī)則的圓形結構，大小相對均一，具有良好的分散性。

2.5.4 穩(wěn)定性評價脂質體的穩(wěn)定性是一個非常重要的評價指標。因此，對制得的脂質體在15 d內進行了定期的粒徑與電位測量，以此考察其短期內的穩(wěn)定性。如圖6（d）、圖6（e）所示，在4℃條件下放置過程中，脂質體的粒徑與電位變化不顯著，說明該方法制備的脂質體穩(wěn)定性較好。

3 結 語

將離子液體-水-有機溶劑三相反應體系應用于PLD轉酯合成磷脂酰糖苷類化合物的反應中，提升了酶促轉酯反應的性能。結果表明，PLD在[BMIm][PF6]中孵育后具有更高的活性與穩(wěn)定性。離子液體的存在也抑制了PLD水解反應副產物PA的生成，驅動反應向轉酯?；磻较蜻M行，顯著提高了PtdGlcNAc的產率。此外，離子液體容易回收，可以重復利用，具有環(huán)保性。該研究為磷脂酰糖苷脂質體的高效制備和應用提供了理論依據。

圖6 LipPNA的表征Fig.6 Characterization of LipPNA