趙金玉，龍見坤，DAVID Tembong Cham，陳祥盛，常志敏，*

(1. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；2. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025；3. 貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴陽 550025；4. 貴州大學(xué)昆蟲資源開發(fā)利用省級(jí)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025)

東方蜜蜂Apiscerana又稱中華蜜蜂Apisceranacerana，是我國分布最廣、數(shù)量最多及飼養(yǎng)量最大的一個(gè)地理亞種，屬中國獨(dú)有蜜蜂品種，除新疆外，全國各地均有分布，尤其是南方的丘陵及山區(qū)(國家畜禽遺傳資源委員會(huì), 2011)。東方蜜蜂具有西方蜜蜂所不可比擬的優(yōu)勢(shì)，如抗寒御敵能力強(qiáng)，其7℃左右即可正常采集；另外，東方蜜蜂善于利用零星蜜源植物，采蜜期長，非常適合山區(qū)飼養(yǎng)。近年來，國家較重視東方蜜蜂的種質(zhì)遺傳資源保護(hù)，目前已劃建多個(gè)保護(hù)區(qū)及保種場(chǎng)。貴州省是東方蜜蜂重要分布區(qū)，近5年來，其蜂群數(shù)量增至約51萬群(韋小平等, 2020)。

目前，我國東方蜜蜂有北方型、華南型、華中型、云貴高原型、長白山型、海南型、滇南型、阿壩型及西藏型9個(gè)類型(國家畜禽遺傳資源委員會(huì), 2011)。東方蜜蜂遺傳分化現(xiàn)狀是其種質(zhì)資源保護(hù)及開發(fā)利用的基礎(chǔ)。近年來，mt DNA被廣泛應(yīng)用于東方蜜蜂遺傳多樣性研究。譚墾等(2004)對(duì)云南及北京地區(qū)東方蜜蜂mt DNA COⅡ基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其存在堿基差異且屬于不同類群。丁桂玲等(2008)對(duì)中國25個(gè)省100余個(gè)樣點(diǎn)的東方蜜蜂mt DNA tRNAleu-COⅡ非編碼區(qū)進(jìn)行研究，獲得18個(gè)單倍型及12個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，并認(rèn)為西北地區(qū)單倍型數(shù)量較多，蜜蜂多樣性較豐富。劉振國等(2015)分析了我國20個(gè)地理種群東方蜜蜂mt DNA COⅡ基因遺傳多樣性，結(jié)果表明不同地理種群間存在顯著遺傳分化。谷瑛等(2016)對(duì)重慶139群東方蜜蜂mt DNA tRNAleu-COⅡ片段非編碼區(qū)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同生境種群間存在基因交流。曹聯(lián)飛等(2017)基于tRNAleu-COⅡ序列對(duì)浙江省94個(gè)樣點(diǎn)東方蜜蜂進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)20個(gè)單倍型。李彪等(2018)基于mt DNA tRNAleu-COⅡ非編碼區(qū)對(duì)唐家河自然保護(hù)區(qū)37個(gè)蜂群進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)14個(gè)單倍型，指出單倍型分布與地理、氣候等因素有較大關(guān)系。劉意秋等(2019)基于COⅠ片段分析了陜、甘、寧、青、晉5省東方蜜蜂遺傳分化狀況，定義了21個(gè)單倍型，并指出該地區(qū)種群總體遺傳分化不顯著。曹聯(lián)飛等(2020)基于mt DNA tRNAleu-COⅡ序列對(duì)浙江金華地區(qū)東方蜜蜂遺傳多樣性分析，共發(fā)現(xiàn)14個(gè)單倍型，且發(fā)現(xiàn)該地區(qū)存在顯著遺傳分化。

貴州省地處云貴高原與湘桂丘陵之間，屬溫暖濕潤季風(fēng)高原山地氣候區(qū)，西部為高原地貌，最典型的威寧地區(qū)，平均海拔2 200 m以上，其氣候、植被與全省差異較大，年均氣溫13℃以下，降雨量較小，為低溫少雨區(qū)，日照較豐富(徐祖蔭, 1986)；東部主要為山地和丘陵，植被茂盛、受外界干擾小、有保存較好的東方蜜蜂資源。因此，貴州蜜蜂資源是研究復(fù)雜地形下東方蜜蜂遺傳分化的良好對(duì)象。近年來，僅于瀛龍等(2017)利用微衛(wèi)星標(biāo)記法對(duì)貴州省9個(gè)樣點(diǎn)東方蜜蜂遺傳多樣性進(jìn)行研究，認(rèn)為貴州省東方蜜蜂未發(fā)生遺傳分化。但由于涉及樣點(diǎn)較少，貴州省東方蜜蜂是否存在遺傳分化有待進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

樣本點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)：為減少實(shí)驗(yàn)誤差，采樣在蜜源植物豐富，種群群勢(shì)較強(qiáng)的季節(jié)進(jìn)行，并結(jié)合海拔、經(jīng)緯度及距離等因素，優(yōu)先選擇野生蜂群及原始飼養(yǎng)蜂群，其次選擇無人工育王蜂群。共采集79個(gè)理想樣點(diǎn)，具體采樣信息(見圖1，表1)，樣本采集后暫存于裝有無水乙醇的15 mL試管中，帶回實(shí)驗(yàn)室后更換無水乙醇并保存于-20℃冰箱待用。

圖1 東方蜜蜂樣本采集信息圖Fig.1 Information of Apis cerana sample collection

表1 東方蜜蜂樣本采集信息表Table 1 Information of Apis cerana sample collection

續(xù)表1 Continued table 1

續(xù)表1 Continued table 1

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1總DNA提取

每群隨機(jī)抽取1頭無水乙醇保存的蜜蜂樣本，取其胸部，盡量除去外表幾丁質(zhì)，置于1.5 mL離心管中加入TL Buffer后充分研磨，添加OB蛋白酶后55℃水浴4 h。具體方法及步驟參照動(dòng)物基因組DNA快速提取試劑盒DP302(天根生化科技有限公司)。

1.2.2序列擴(kuò)增與測(cè)序

依據(jù)東方蜜蜂mt DNA全基因組(Genbank Acession No: GQ162109)設(shè)計(jì)COI-COII片段的引物(Tanetal., 2016)。具體引物信息為R：5′-CTATACCTCGACGATACTCAG-3′，F(xiàn)：5′-TCAGGG TATTCATAGGATC-3′，并對(duì)mt DNA COI-COII序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中2×Taq MasterMix 10 μL，引物F及引物R各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min(預(yù)變性)、95℃ 30 s(變性)、54℃ 30 s(退火)、64℃ 30 s(延伸)、34個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min(終延伸)。PCR產(chǎn)物送生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3數(shù)據(jù)分析

以地級(jí)市行政區(qū)劃為單位，將貴州省79個(gè)樣點(diǎn)分為9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)，包括畢節(jié)地區(qū)(BJ)、六盤水地區(qū)(LPS)、黔西南地區(qū)(QXN)、黔南地區(qū)(QN)、黔東南地區(qū)(QDN)、銅仁地區(qū)(TR)、遵義地區(qū)(ZY)、貴陽地區(qū)(GY)、安順地區(qū)(AS)。

使用Mega 6.05(Kumaretal., 2016)對(duì)9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)、計(jì)算堿基組成、統(tǒng)計(jì)保守位點(diǎn)及變異位點(diǎn)、計(jì)算Kinura2-Parameter(K2P)平均遺傳距離等；運(yùn)用DNAsp 5.0(Rozasetal., 2017)檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)單倍型數(shù)目及分布，進(jìn)而計(jì)算單倍型多樣度及核苷酸多樣度；然后使用DNAsp 5.0依據(jù)Tauna’s值(D)及Fu’s Fs值(Fs)進(jìn)行中性檢驗(yàn)，當(dāng)兩者均呈一個(gè)相對(duì)較大的負(fù)值時(shí)，表明種群可能經(jīng)歷過群體擴(kuò)張；分別采用Mega 6.05 和Network 4.61(Bandeltetal., 1999)軟件ML法構(gòu)建單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹及單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 核苷酸堿基組成及變異位點(diǎn)

對(duì)貴州省9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)東方蜜蜂mt DNA COI-COII序列測(cè)序校正后，獲得片段長度約760 bp，堿基A、T、C、G平均含量分別為39.2%、43.1%、11.0%、6.7%，A+T平均含量為82.3%，C+G平均含量為17.7%，表現(xiàn)出明顯的A+T偏移性。該片段中發(fā)現(xiàn)簡約信息位點(diǎn)19個(gè)及單突變位點(diǎn)14個(gè)，共33個(gè)變異位點(diǎn)，其中變異位點(diǎn)A/G有10個(gè)，T/A有7個(gè)，T/C有8個(gè)，C/T 有6個(gè)，C/A有1個(gè)，T/G有1個(gè)。

2.2 單倍型分析

貴州省9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)共檢測(cè)到33種單倍型，分別命名為H1-H33。其中，共享單倍型11個(gè)(H1、H2、H3、H4、H5、H11、H13、H14、H16、H21、H23)，占全部單倍型的33.33%；獨(dú)有單倍型22個(gè)，占所有單倍型的66.67%(見表2)。在9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)中，從單倍型出現(xiàn)的種類及數(shù)量來看，畢節(jié)地區(qū)最多，包括H1、H11、H14、H19、H20、H21、H22、H23、H24、H25、H26 11種單倍型，11種單倍型分布在17個(gè)樣點(diǎn)；其次為黔東南地區(qū)，包括H1、H3、H5、H6、H7、H8、H28、H30、H31、H32 10種單倍型，分布在19個(gè)樣點(diǎn)。

表2 33個(gè)單倍型分布情況Table 2 Distribution of 33 haplotypes

11個(gè)共享單倍型中，H1廣泛分布在9個(gè)地區(qū)。從其出現(xiàn)頻率來看，H1分布最多，其中六盤水地區(qū)分布4個(gè)樣點(diǎn)(SC1、PZ1、PZ4、PZ5)、畢節(jié)地區(qū)分布5個(gè)樣點(diǎn)(QX1、DF3、QX2、WN9、WN10)、黔東南地區(qū)分布8個(gè)樣點(diǎn)(CJ、RJ1、RJ3、DZ1、JH、LP1、LP2、ZF1)等9個(gè)地區(qū)共分布33個(gè)樣點(diǎn)；其次為H3，分布在六盤水地區(qū)(SC4、LPS)、黔南地區(qū)(HS1)、貴陽地區(qū)(HX5)共分布4個(gè)樣點(diǎn)；H4、H11及H14均分布在2個(gè)樣點(diǎn)，H4分布在貴陽地區(qū)(HX8)及六盤水地區(qū)(SC5)；H11分布在六盤水地區(qū)(SC3)及畢節(jié)地區(qū)(WN11)；H14分布在黔南地區(qū)(HS2)及畢節(jié)地區(qū)(WN2)。部分單倍型出現(xiàn)次數(shù)較多，但僅存在相鄰較近樣點(diǎn)，如H5僅分布在黔東南地區(qū)(HP3、DZ2、SS、LS2)4個(gè)較近樣點(diǎn)，H13分布在六盤水地區(qū)(PZ2、PZ3)2個(gè)較近樣點(diǎn)，H16、H21及H23均分布在相鄰樣點(diǎn)。

22個(gè)獨(dú)有單倍型主要分布在畢節(jié)、黔東南、貴陽等地區(qū)，其中畢節(jié)地區(qū)有H19、H20、H22、H24、H25、H26 6種，分布在QX3、DF1、WN3、WN4、WN1、WN8 6個(gè)樣點(diǎn)；黔東南有H6-H8、H28、H30-H32 7種，分布在HP2、HP4、HP5、TJ、CG、LS1 7個(gè)樣點(diǎn)；六盤水地區(qū)有H9、H10、H12 3種，分布在SC2、SC6及SC7 3個(gè)樣點(diǎn)；安順地區(qū)有H17、H18 2種，分布在PB1及AS2 2個(gè)樣點(diǎn)；貴陽、銅仁、遵義及黔西南地區(qū)均有1種，分別為H27、H29、H15、H33，分別分布在XW2、SN、MT1、ZF1 4個(gè)樣點(diǎn)；黔南地區(qū)未發(fā)現(xiàn)獨(dú)有單倍型。

2.3 核苷酸多樣度及中性檢驗(yàn)

總體平均單倍型多樣度為0.802，其中黔南地區(qū)最高，為1.000，遵義地區(qū)最低，為0.500；總體平均核苷酸多樣度為0.014，其中六盤水地區(qū)最高，為0.102，黔西南及安順地區(qū)最低，均為0.002(表3)。

中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，黔東南、黔南、安順、畢節(jié)地區(qū)的Tauna’s值(D)及Fu’s Fs值(Fs)均為負(fù)數(shù)，分別為-0.162和-1.330、-0.797和-1.514、-1.048和-0.186、-0.707和-0.227，表明上述地區(qū)東方蜜蜂可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張，其余地區(qū)均有正有負(fù)(表3)。

表3 核苷酸多樣度及中性檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Nucleotide diversity and neutral test results

2.4 遺傳距離分析

9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)間平均遺傳距離介于0.0012～0.0044之間，其中畢節(jié)與黔東南地區(qū)間最大，為0.0044；安順與黔南、遵義地區(qū)間最小，均為0.0012(表4)。

表4 9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)間的K2P平均遺傳距離Table 4 Average genetic distance of K2P among 9 sampling locations of Apis cerana

2.5 基于單倍型系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于ML法構(gòu)建33個(gè)單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示所有單倍型聚為2個(gè)大類群。一個(gè)類群包括H6、H15、H18及H23 4種單倍型，另外一大枝除3個(gè)小枝(H22及H25為一枝、H27及H28為一枝、H4及H29為一枝)外，均各自單獨(dú)聚類在一起(圖2)。

圖2 基于ML法構(gòu)建的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Construction of haplotype phylogenetic tree based on ML method

2.6 單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖

構(gòu)建9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)中33個(gè)單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖，其中H1面積最大，顏色類型最多，表明H1出現(xiàn)次數(shù)最多，分布最廣，存在貴州省9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)群體中，黔東南群體中分布最豐富，H1為最原始單倍型，其余單倍型均起源于此。同時(shí)可根據(jù)單倍型起源情況，將其分為3個(gè)大類，第一類包括H6、H15、H18、H23及H19，此大類和單倍型進(jìn)化樹基本一致；第二類包括H22、H25、H27-28及H14；其余單倍型為第三類(圖3)。

圖3 單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖Fig.3 Haplotype network mediation diagram注：通過單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖可直觀看出33個(gè)單倍型之間的親緣關(guān)系，不同顏色代表不同樣點(diǎn)種群，圓圈面積代表所含樣本數(shù)量大小。Note: The relationship among 33 haplotypes could be obtainedby the haplotype network intermediary diagram. Different colors represented different geographical populations, and the circle area represented the number of samples.

3 結(jié)論與討論

3.1 遺傳多樣性分析

本研究基于COⅠ-COⅡ片段對(duì)采自貴州省9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)東方蜜蜂進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，東方蜜蜂mt DNA序列在9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)間存在一定變異。

堿基組成分析表明COⅠ-COⅡ序列中，A+T平均含量為82.3%，此片段為A+T富集區(qū)，該結(jié)果與前人研究結(jié)果相似，該序列堿基偏移性明顯。Tan等(2011)研究表明亞洲地區(qū)東方蜜蜂該片段A+T平均含量為77.5%；馮毅楠等(2016)指出云南地區(qū)東方蜜蜂COⅠ-COⅡ片段A+T平均含量為82.4%；徐國威等(2014)指出四川省東方蜜蜂COⅠ-COⅡ片段A+T平均含量為82.8%。綜上可知，貴州省與云南省、四川省東方蜜蜂的mt DNA COⅠ-COⅡ片段A+T平均含量相近。張卓等(2015)研究發(fā)現(xiàn)黑帶食蚜蠅EpisyrphusbalteatusCOⅠ-COⅡ序列A+T平均含量為70.3%，其含量明顯低于東方蜜蜂。

單倍型分析表明，9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)中COⅠ-COⅡ基因共存在33個(gè)單倍型，11個(gè)為共享單倍型，22個(gè)為獨(dú)有單倍型，平均總體單倍型多樣度為0.802，其中遵義地區(qū)單倍型多樣度為0.500，在所有樣點(diǎn)中相對(duì)偏低，王俊杰(2018)研究發(fā)現(xiàn)遵義地區(qū)單倍型多樣度在所有樣本中也相對(duì)偏低，為0.400，可見該地區(qū)的東方蜜蜂種群與外界交流相對(duì)較少，也有學(xué)者認(rèn)為這可能是東方蜜蜂與該地區(qū)特殊地理氣候相適應(yīng)而產(chǎn)生的一種結(jié)果(田嵩浩, 2014)。黔西南地區(qū)單倍型多樣度也相對(duì)較低，其余7個(gè)樣點(diǎn)單倍型遺傳多樣度均大于0.800。

3.2 遺傳距離分析

9個(gè)地區(qū)樣點(diǎn)間平均遺傳距離介于0.0012～0.0044之間，其中黔東南地區(qū)與其它8個(gè)地區(qū)平均遺傳距離相對(duì)較大，均大于0.0030；安順地區(qū)與其它8個(gè)地區(qū)平均遺傳距離相對(duì)較小，均小于0.0030。徐國威等(2014)研究表明四川省東方蜜蜂平均遺傳距離介于0.0018～0.0049之間；馮毅楠等(2016)研究表明云南地區(qū)東方蜜蜂平均遺傳距離介于0.0004～0.0012之間。綜上，貴州省東方蜜蜂平均遺傳距離大于云南省，略小于四川省。在實(shí)際距離上，畢節(jié)地區(qū)與黔東南地區(qū)相離最遠(yuǎn)，而遺傳距離也最大；黔西南、貴陽與黔東南相離較遠(yuǎn)，其遺傳距離也相對(duì)較大。黔東南地區(qū)與其它地區(qū)整體遺傳較大，這可能與人為措施有關(guān)，如蜂群引進(jìn)、人工育王、放蜂普遍等因素(張明華等, 2019; 徐祖蔭, 2019)。安順地區(qū)位于貴州省中部，其實(shí)際距離與其它地區(qū)相對(duì)較近，與其它地區(qū)遺傳距離也最小。綜上，貴州省東方蜜蜂各樣點(diǎn)種群間遺傳距離與實(shí)際距離可能存在一定相關(guān)性。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，33個(gè)單倍型聚為2個(gè)大類，第一大類包含H6、H15、H18及H23 4種單倍型，分別對(duì)應(yīng)黔東南州黃平縣紙坊鄉(xiāng)、遵義市湄潭縣云貴山、安順市唐家灣、畢節(jié)市威寧縣觀風(fēng)海樣點(diǎn)；其余種群均包含在第二類群中。綜上，東方蜜蜂種群未能按照相應(yīng)地理區(qū)域聚類，這可能與盲目引種、放蜂等有關(guān)，張明華等(2019)調(diào)查發(fā)現(xiàn)每年初春兩廣及福建地區(qū)華南型中蜂被引入貴州地區(qū)，徐祖蔭(2019)調(diào)查發(fā)現(xiàn)貴州地區(qū)有引進(jìn)越南東方蜜蜂的現(xiàn)象，徐祖蔭(2019)研究表明盲目引種，會(huì)導(dǎo)致當(dāng)?shù)胤浞N混亂及退化，生產(chǎn)性能降低等現(xiàn)象。

33個(gè)單倍型網(wǎng)絡(luò)圖顯示，單倍型H1擴(kuò)散最廣，出現(xiàn)頻率最高，分布于以地級(jí)市為單位劃分的所有樣點(diǎn)，其次為H14，出現(xiàn)在畢節(jié)、黔南、銅仁及貴陽4個(gè)樣點(diǎn)。根據(jù)逆祖理論(Gyllensten, 1991)，可將H1認(rèn)定為起源單倍型或祖先單倍型。