王 力，邸 靜

商洛國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院病理科，陜西商洛 726000

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移存在多因素、多階段過程，且具有發(fā)展快、預(yù)后較差等特點(diǎn)，是現(xiàn)階段嚴(yán)重危害人們生命健康的重要因素之一。胃癌患者根治術(shù)后5年存活率僅維持在20%～30%，因此，胃癌的早期診斷及治療對于改善預(yù)后有重要意義[1]。maspin 是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，相關(guān)研究表明，maspin可作為一種抑癌基因，對降低癌細(xì)胞活性、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、減少腫瘤組織內(nèi)血管新生等均具有調(diào)節(jié)作用[2]。細(xì)胞周期調(diào)控異常易引發(fā)腫瘤形成，而Cyclin-1是調(diào)控細(xì)胞周期的重要細(xì)胞因子，Cyclin-1基因發(fā)生移位或擴(kuò)增會導(dǎo)致其在胃癌組織中過度表達(dá)，從而加重病情[3]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是誘導(dǎo)腫瘤血管生長的關(guān)鍵因子之一，VEGF是已知最強(qiáng)有力的血管生成因子，在腫瘤的持續(xù)生長和轉(zhuǎn)移中起重要作用。相關(guān)研究表明，VEGF的表達(dá)與胃癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，參與胃癌的發(fā)生和發(fā)展[4]。在對maspin、Cyclin-1、VEGF作用的研究中發(fā)現(xiàn)，3項指標(biāo)均可作為判斷腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的潛能因子，并且在胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后預(yù)測中均具有一定作用，也在胃癌治療中明確病理的發(fā)生和發(fā)展具有一定影響，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究[5-6]。本研究對maspin、Cyclin-1與胃癌臨床分期及VEGF的相關(guān)性進(jìn)行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月至2021年5月本院收治的進(jìn)行根治手術(shù)的240例胃癌患者作為研究對象，男126例，女114例；≤50歲126例，>50歲114例；賁門部75例，胃體部86例，胃竇部79例；Borrmann分期：Ⅰ、Ⅱ期135例，Ⅲ、Ⅳ期105例；管狀腺癌63例，黏液腺癌57例，印戒細(xì)胞癌39例，鱗狀細(xì)胞癌81例；腫瘤最大徑≤4.0 cm 136例，>4.0 cm 104例；組織學(xué)類型：高分化型85例，中分化型87例，低分化型68例；有漿膜浸潤109例，無漿膜浸潤131例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移96例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移144例。不同病理類型、不同Borrmann分期、有無漿膜浸潤及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等一般資料比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其余資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)病理檢查確診為胃癌；術(shù)前未經(jīng)放療、化療或其他腫瘤相關(guān)治療，所有患者臨床資料均完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：有其他腫瘤病史，代謝異常性疾病，患急性心、腦血管疾病，肺、肝、膽、腎等重要器官發(fā)生可見占位性病變。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑 鼠抗人maspin濃縮型單克隆抗體，兔抗人Cyclin-1、VEGF濃縮型多克隆抗體和免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本留取 所有胃癌標(biāo)本均行常規(guī)10%甲醛固定，均在24 h內(nèi)取材。標(biāo)本采集：于距病灶3 cm以外的癌旁組織取1塊，癌中心部位取1塊，使用切片機(jī)將組織切片，每張切片厚度為3～5 cm。染色前將石蠟切片置于二甲苯中脫去石蠟，采用10%甲醛固定做石蠟切片，依次采用無水乙醇、90%乙醇、80%乙醇和 70%乙醇脫水后，用清水沖洗，在90 ℃烤箱中烘烤20 min后于蘇木素中染色10 min，清洗后，65 ℃烤箱烘干后用中性樹脂封片，組織切片于顯微鏡下觀察后拍照。

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色法 將二甲苯脫蠟2次，每次10 min，梯度95%乙醇水化2次,每次3 min,80%乙醇水化3 min，70%乙醇水化3 min，蒸餾水水化2次，每次5 min,后置于盛有pH值為6.0的檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)盒中，壓力鍋中高壓修復(fù)3 min。3% 過氧化氫37 ℃ 孵育10～20 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3 min，滴加一抗maspin、Cyclin-1及VEGF工作濃度分別為1∶200、1∶400 和1∶700，37 ℃ 孵 育60 min。滴加聚合物輔助劑，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG多聚體，37 ℃ 孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加新鮮配制的四鹽酸氨基苯胺顯色液，顯微鏡下觀察3～5 min，至出現(xiàn)陽性結(jié)果而又無明顯背景著色時終止反應(yīng)，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染5 min，2% 鹽酸乙醇分化10 s，自來水返藍(lán)15 min，切片自然風(fēng)干，中性樹膠封片。maspin、Cyclin-1蛋白表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中出現(xiàn)褐色或棕黃顆粒為陽性染色，VEGF表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)褐色或棕黃色顆粒為陽性染色，按每張切片隨機(jī)取5個高倍鏡視野，計數(shù)100個細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分;陽性強(qiáng)度黃色為1分，棕黃色為2分，褐色為3分。0～6分表示陽性(+)，8～12分表示強(qiáng)陽性(++)，所得積分相乘，將(+)、(++)歸為表達(dá)陽性組計算陽性率。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 所有患者均于治療前清晨抽取空腹靜脈血5 mL，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，吸取血清至 Eppendof 管中，做好標(biāo)記，-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆茫捎?ELISA 按照試劑盒說明書進(jìn)行嚴(yán)格操作，以450 nm 處測定吸光度值共3次，取平均值，參照廠家提供的血清VEGF水平及吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取標(biāo)本中血清VEGF水平。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織與癌旁組織maspin、Cyclin-1陽性表達(dá)情況比較 胃癌組織中maspin陽性42例，Cyclin-1陽性174例；癌旁組織中maspin陽性198例，Cyclin-1陽性66例，與胃癌組織比較，癌旁組織中maspin陽性表達(dá)情況較高，Cyclin-1陽性表達(dá)情況較低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

圖1 胃癌組織和癌旁組織maspin陽性表達(dá)情況比較(×200)

圖2 胃癌組織和癌旁組織Cyclin-1陽性表達(dá)情況比較(×200)

表1 胃癌組織及癌旁組織maspin、Cyclin-1陽性表達(dá)情況比較[ n(%)]

2.2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者maspin、Cyclin-1陽性表達(dá)情況比較 Ⅰ期胃癌患者maspin陽性21例，Cyclin-1陽性36例；Ⅱ期胃癌患者maspin陽性12例，Cyclin-1陽性48例；Ⅲ期胃癌患者maspin陽性9例，Cyclin-1陽性42例；Ⅳ期胃癌患者maspin陽性0例，Cyclin-1陽性48例。各期胃癌患者maspin和Cyclin-1陽性表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與Ⅰ期胃癌患者比較，Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期胃癌患者Cyclin-1陽性表達(dá)情況差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期胃癌患者Cyclin-1陽性表達(dá)情況比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、圖4、表2。

圖3 各期胃癌患者maspin陽性表達(dá)情況(×200)

圖4 各期胃癌患者Cyclin-1陽性表達(dá)情況(×200)

表2 各期胃癌患者maspin、Cyclin-1陽性表達(dá)情況比較[ n(%)]

2.3 各期胃癌患者VEGF表達(dá)水平比較 Ⅰ期胃癌患者VEGF表達(dá)水平為(62.60±7.22)pg/mL，Ⅱ期胃癌患者為(85.20±15.25)pg/mL，Ⅲ期胃癌患者為(118.30±22.34)pg/mL，Ⅳ期患者為(140.30±30.56)pg/mL，各期胃癌患者VEGF表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

2.4 胃癌患者maspin、Cyclin-1與VEGF的相關(guān)性分析 maspin與VEGF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.365，P<0.05)，maspin與Cyclin-1呈負(fù)相關(guān)(r=-0.298，P<0.05)，Cyclin-1與VEGF呈正相關(guān)(r=0.386，P<0.05)。見圖6。

注：與Ⅰ期比較，*P<0.05；與Ⅱ期比較，#P<0.05；與Ⅲ期比較，△P<0.05。

圖6 胃癌患者maspin、Cyclin-1與VEGF的相關(guān)性分析

3 討 論

胃癌是由多基因調(diào)節(jié)和多因素導(dǎo)致的細(xì)胞大量增殖及細(xì)胞凋亡受抑制的結(jié)果，Cyclin-1作為周期蛋白的調(diào)控基因，當(dāng)基因表達(dá)異常時會引起細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[7]。maspin在生物學(xué)功能中通過抑制腫瘤細(xì)胞活性進(jìn)而提高細(xì)胞的黏附能力和細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性,降低癌變細(xì)胞運(yùn)動能力，抑制腫瘤增長，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[8]。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤相關(guān)血管的形成，并為其提供營養(yǎng)物質(zhì)，以及為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)提供通道。目前，常用的評價血管生成的指標(biāo)主要為VEGF，作為腫瘤細(xì)胞分泌的最重要的腫瘤血管形成促成因子，其在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用[9]。因此，加強(qiáng)對maspin、Cyclin-1、VEGF在胃癌中的作用機(jī)制研究，可為胃癌今后的診斷、治療及預(yù)后提供依據(jù)。

近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，maspin、Cyclin-1在胃癌患者中的表達(dá)水平與腫瘤的生長和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及浸潤等均具有相關(guān)性，maspin、Cyclin-1在正常胃黏膜組織和胃癌組織中均有不同表現(xiàn)，且在胃癌組織中的表達(dá)與癌旁組織中的表達(dá)水平存在明顯差異[10]。本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中maspin陽性表達(dá)較低，Cyclin-1陽性表達(dá)較高，癌旁組織中maspin陽性表達(dá)較高，Cyclin-1陽性表達(dá)較低，二者呈負(fù)相關(guān)，提示maspin表達(dá)缺失、Cyclin-1表達(dá)升高在胃癌中可能發(fā)生致癌基因的作用。WANG 等[11]研究表明，胃癌組織中maspin的表達(dá)缺失高達(dá)71.00%，maspin的低表達(dá)和表達(dá)缺失與胃癌的分化、分期及腫瘤的生物學(xué)特性和臨床預(yù)后、治療轉(zhuǎn)歸等均密切相關(guān)，且maspin在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致癌細(xì)胞黏附增加和細(xì)胞運(yùn)動能力加強(qiáng)，引起胃癌發(fā)生和發(fā)展。相關(guān)研究顯示，Cyclin-1可與周期抑制蛋白相結(jié)合增強(qiáng)癌細(xì)胞活性，Cyclin-1過表達(dá)可加速細(xì)胞周期進(jìn)展甚至使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化，Cyclin-1也是控制真核細(xì)胞周期進(jìn)展的重要蛋白分子，可結(jié)合細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4而形成復(fù)合物Cyclin D1-CDK4，使Rb蛋白磷酸化，將細(xì)胞周期從低分期進(jìn)入高分期，進(jìn)而加重胃癌病變[12-13]。

maspin、Cyclin-1在胃癌分期中的表達(dá)水平與胃癌的惡性程度具有重要相關(guān)性，因此，maspin、Cyclin-1在參與胃癌發(fā)生和發(fā)展過程中可能是重要的生物學(xué)標(biāo)志物。本研究中胃癌患者maspin陽性呈低表達(dá)，與之相反，Cyclin-1在胃癌患者中陽性呈高表達(dá)，由此提示，maspin、Cyclin-1水平與胃癌分期具有相關(guān)性。BOSTANCI等[14]通過免疫組織化學(xué)法研究表明，高分期胃癌中maspin的陽性表達(dá)明顯低于胃癌低分期，且發(fā)現(xiàn)maspin在低分期中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而在高分期中主要表達(dá)于細(xì)胞核中。隨著胃癌分期增加，maspin在胃癌中胃黏膜的表達(dá)量隨之降低，表明maspin在胃癌中呈低表達(dá)且腫瘤的惡性程度較高，檢測其水平對預(yù)后評估具有重要意義[15]。HUANG等[16]研究顯示，Cyclin-l在胃癌低分期中能夠形成復(fù)合物，并通過激活蛋白激酶的活性使母細(xì)胞瘤蛋白磷酸化，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子釋放，進(jìn)而驅(qū)使癌細(xì)胞由低分期進(jìn)入高分期，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和腫瘤發(fā)生。Cyclin-1過表達(dá)能夠提前實(shí)現(xiàn)母細(xì)胞瘤蛋白的磷酸化過程，同時加快細(xì)胞從低分期向高分期的轉(zhuǎn)變速度，增加癌細(xì)胞增殖。

有關(guān)研究證實(shí)，所有惡性腫瘤的生物學(xué)行為均與腫瘤內(nèi)新生血管有關(guān)，而腫瘤血管的生成在實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移等各階段均具有促進(jìn)作用[17]。VEGF是已知最強(qiáng)有力的血管生成因子，并且可作為胃癌診斷、治療及預(yù)后動態(tài)觀察的指標(biāo)。本研究中Ⅰ期胃癌患者VEGF表達(dá)水平最低，并且隨著分期越高VEGF表達(dá)水平不斷升高，表示VEGF與胃癌分期具有相關(guān)性，也是胃癌等惡性生物學(xué)行為的重要標(biāo)志。相關(guān)研究表明，在處于進(jìn)展階段的胃癌中，腫瘤組織增生活躍會分泌大量的VEGF進(jìn)入血液，可能是由于環(huán)氧化酶的過度表達(dá)促進(jìn)了前列腺素的合成，進(jìn)而刺激VEGF分泌，伴隨腫瘤血管形成和胃癌分期升高，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，這也是晚期胃癌患者血清VEGF水平較高的重要原因[17]。唐歡等[18]研究表明，胃癌組織內(nèi)的大量新生腫瘤血管的形成受多種血管生成因子的調(diào)節(jié)，在排除創(chuàng)傷和炎性反應(yīng)前提下，血清VEGF水平呈高表達(dá)，提示腫瘤分期的提高可能伴隨活躍癌癥中新生血管因子及潛在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的趨勢。因此，VEGF在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用。ZANG等[19]研究結(jié)果顯示，maspin與VEGF、Cyclin-1的表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)，原因可能是因?yàn)閙aspin陽性表達(dá)下調(diào)或缺失為腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了適合的微環(huán)境，間接促進(jìn)了Cyclin-1、VEGF-C等的表達(dá)、分泌及趨化作用。而maspin陽性表達(dá)下調(diào)后對凋亡相關(guān)基因的誘導(dǎo)作用下降，又為癌細(xì)胞浸潤后淋巴細(xì)胞的增殖創(chuàng)造了條件，進(jìn)一步上調(diào)VEGF、Cyclin-1的表達(dá)水平。

綜上所述，maspin在胃癌組織中呈低表達(dá)，Cyclin-1在胃癌組織中呈高表達(dá)，且不同分期胃癌患者maspin、Cyclin-1陽性表達(dá)情況及VEGF水平不同，提示通過檢測maspin、Cyclin-1陽性表達(dá)情況及VEGF水平對胃癌的診斷和分期有重要作用。