熊訊 李永 阮涌 陳晨 宋林錦 石鵬飛 孫金魁 許厚強(qiáng)

摘要：【目的】明確脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）對香蘇雜交豬脂肪沉積的影響，為后續(xù)進(jìn)一步探究豬脂肪細(xì)胞內(nèi)FABP1和FABP2基因?qū)χ舅岽x的調(diào)控作用打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坎杉闾K雜交豬和柯樂豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、背最長肌及脂肪等組織樣品提取總RNA，利用PCR克隆香蘇雜交豬FABP1和FABP2基因編碼區(qū)（CDS）序列，通過ProtParam、ProtScale、SOPMA、SWISS-MODEL、PSORTⅡPreadict及SignalP-5.0等在線軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并采用實(shí)時熒光定量PCR檢測FABP1和FABP2基因在香蘇雜交豬和柯樂豬各組織中的表達(dá)情況?！窘Y(jié)果】香蘇雜交豬FABP1和FABP2基因CDS序列分別為384和399 bp，分別編碼127和132個氨基酸殘基，對應(yīng)的編碼蛋白相對分子量為14107.23和15217.34 Da，均為親水性蛋白;其二、三級結(jié)構(gòu)均以β-折疊和無規(guī)則卷曲為主，無信號肽剪切位點(diǎn)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。香蘇雜交豬FABP1和FABP2氨基酸序列表現(xiàn)為與人類、牛、山羊的FABP1和FABP2氨基酸序列高度同源，對應(yīng)的相似性均在80.0%以上，除斑馬魚外，與其他參考物種的相似性也在74.0%以上，故推測FABP1和FABP2基因序列的保守性較高; STRING預(yù)測結(jié)果顯示，與這2個蛋白可能互作的蛋白有FABP5、FABP7、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）、豬載脂蛋白A4（APOA4）、APOA1及脂酰輔酶A氧化酶1（ACOX1）等。FABP1和FABP2基因在香蘇雜交豬和柯樂豬的各組織中均有表達(dá)，且以在肝臟、小腸和脂肪中的相對表達(dá)量較高，而背最長肌中的相對表達(dá)量最低;此外，F(xiàn)ABP1和FABP2基因在香蘇雜交豬肝臟和小腸中的相對表達(dá)量極顯著高于其在柯樂豬對應(yīng)組織中的相對表達(dá)量（P<0.01）?！窘Y(jié)論】FABP1和FABP2基因在豬的各組織中均有表達(dá)，且以在甘油三酯和脂肪酸合成代謝的相關(guān)組織（肝臟、小腸和脂肪）中特異性高表達(dá)，可能對脂肪的合成代謝起重要調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：豬;FABP1基因;FABP2基因;分子特征;脂肪酸代謝

中圖分類號：S828.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）04-0935-11

Molecular characteristics and tissue expression analysis of FABP1 and FABP2 genes in pig

XIONG Xun1， LI Yong2， RUAN Yong1， CHEN Chen1， SONG Lin-jin1，

SHI Peng-fei1， SUN Jin-kui1， XU Hou-qiang*

（1College of Zoology，Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region， Ministry of Education/Guizhou Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction， Guiyang， Guizhou? 550025， China; 2College of Life Sciences， Guizhou University， Guiyang， Guizhou? 550025， China）

Abstract：【Objective】To clarify the effect of fatty acid binding proteins （FABPs） on fat deposition in Xiangsu hybrid pigs， so as to lay the foundation for further exploring the regulatory role of FABP1 and FABP2 genes on fatty acid metabolism in adipocytes of pigs. 【Method】Total RNA was extracted from the heart， liver， spleen， lung， kidney， large intestine， small intestine， longest back muscle and adipose tissue samples of Xiangsu hybrid pigs and Kole pigs， and the sequences of FABP1 and FABP2 gene coding region （CDS） of Xiangsu hybrid pigs were cloned by PCR， and were analyzed by ProtParam， ProtScale， SOPMA， SWISS-MODEL， PSORTⅡPreadict and SignalP-5.0 online software for bioinformatics analysis， and RT-qPCR was used to detect the expression of FABP1 and FABP2 genes in various tissues of Xiangsu hybrid pigs and Kole pigs. 【Result】CDS sequences of FABP1 and FABP2 genes of Xiangsu hybrid pigs were 384 and 399 bp， encoding 127 and 132 amino acid residues， respectively， corresponding to the relative molecular weights of 14107.23 and 15217.34 Da， which are both hydrophilic proteins; their secondary and tertiary structures were dominated by β-folding and irregular coiling， with no signal peptide shear sites，and localized in the cytoplasm. The amino acid sequences of both FABP1 and FABP2 of Xiangsu hybrid pigs showed high homology with those of human， bovine and goat， and the corresponding similarities were above 80.0%， and the similarities with other reference species， except zebrafish， were also above 74.0%， so the conserved sequences of FABP1 and FABP2 genes were presumed to be high; STRING prediction results showed that the proteins that might interact with these 2 proteins were FABP5， FABP7， peroxisome proliferator-activated receptor α （PPARα）， porcine apolipoprotein A4 （APOA4）， APOA1 and acyl-co A oxidase 1 （ACOX1）， etc. FABP1 and FABP2 genes were expressed in all tissues of the Xiangsu hybrid pigs and Kole pigs， and were mainly expressed in various tissues， and the relative expression of FABP1 and FABP2 genes was higher in liver， small intestine and fat， while the relative expression in the longest dorsal muscle was the lowest; in addition， the relative expression of FABP1 and FABP2 genes in liver and small intestine in Xiangsu hybrid pigs was significantly higher than that in the corresponding tissues of the Kole pigs （P<0.01）. 【Conclusion】FABP1 and FABP2 genes are expressed in various tissues of different pigs， with specific high expression in tissues related to triglyceride and fatty acid anabolism （liver， small intestine and adipose）， which may play an important role in regulating lipid anabolism.

Key words： pig; FABP1 gene; FABP2 gene; molecular characterizatics; fatty acid metabolism

Foundation items： Guizhou Science and Technology Plan Project [QKHFQ〔2018〕4007（002）];Guizhou Agricultural Major Industrial Scientific Research Tackling Project （QJH-KY〔2019〕011）

0 引言

【研究意義】脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty acid-binding proteins，F(xiàn)ABPs）是一族同源性細(xì)胞內(nèi)小分子蛋白，廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物細(xì)胞內(nèi)，主要負(fù)責(zé)將細(xì)胞膜上的長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至磷脂和甘油三酯合成的位置（鄒增丁等，2007;董飚等，2016;陳靜等，2021）。FABPs一般由126～134個氨基酸組成，不同家族成員間的氨基酸序列相似性為22%～73%，但其三維結(jié)構(gòu)高度保守（Zimmerman and Veerkamp，2002）。Zhang等（2020）研究表明，在18個物種中共發(fā)現(xiàn)12種FABPs基因，但未發(fā)現(xiàn)單一物種同時存在12種FABPs基因，且每個基因的結(jié)構(gòu)各不相同，究其原因可能是通過串聯(lián)復(fù)制從共同祖先進(jìn)化而來。L-FABP/FABP1（肝型）和I-FABP/FABP2（腸型）基因是較早被發(fā)現(xiàn)的2個FABPs基因，對脂肪代謝調(diào)控起重要作用（陳璐，2013）。因此，開展FABP1和FABP2基因的分子特征及組織表達(dá)分析研究，對揭示FABP1和FABP2基因調(diào)控脂肪酸代謝的作用機(jī)制起重要意義。【前人研究進(jìn)展】目前，有關(guān)FABP1和FABP2基因在家畜上的研究主要集中在雞、鴨和羊上，二者對長鏈脂肪酸具有高度的結(jié)合力（Ockner et al.，1972），通過對長鏈脂肪酸攝取、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、PPAR代謝通路等調(diào)控脂肪代謝（崔璐等，2016）;同時能結(jié)合潛在的有毒脂肪酸，降低脂肪酸對細(xì)胞的毒性，而對細(xì)胞起保護(hù)作用（Wang et al.，2015）。FABP1和FABP2可與配體靶向結(jié)合而影響酶功能，改變膜結(jié)構(gòu)及其流動性來調(diào)節(jié)酶活性，并通過激活核受體以調(diào)節(jié)基因表達(dá)（Jefferson et al.，1990;Lawrence et al.，2000;Gajda et al.，2013）。FABP1基因在鴨的各組織中均有表達(dá)，對脂肪代謝和多種脂肪代謝相關(guān)基因起調(diào)控作用（何俊，2013）。雞FABP2基因表達(dá)能促進(jìn)脂肪沉積，故可作為影響雞脂肪性狀的候選基因（Wang et al.，2006;俞英等，2011）;FABP2基因在鴨小腸各段位均有表達(dá)，以十二指腸和空腸前半段的表達(dá)量較高，且干擾FABP2基因?qū)χ愇障嚓P(guān)基因有影響（陳芳等，2011）;FABP2基因在貴州白山羊9個組織中均有表達(dá)，表達(dá)較高的組織包括肝臟和十二指腸（錢成，2016）。此外，Samulin等（2008）研究表明，F(xiàn)ABP1基因在細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用，同時與FABP2、FAPP3、FABP4、FAPP5、PPARA、PPARG1和PPRG2基因的共同表達(dá)可能對豬脂肪沉積的代謝調(diào)控過程有重要影響。脂肪又稱甘油三酯（Triglyceride，TG），是由長鏈脂肪酸和甘油縮合而成。脂肪代謝是在各種酶的作用下經(jīng)消化分解成甘油和脂肪酸等，并釋放能量的過程（Hunter，2001）。脂肪酸作為一種信號分子，能調(diào)節(jié)細(xì)胞與脂質(zhì)代謝，對生物體有重要的調(diào)控作用（Hotamisligil and Bernlohr，2015）。盡管所有FABPs家族成員都參與脂肪酸的代謝，但脂肪酸功能的多樣性很有可能反映在不同組織中FABPS基因的表達(dá)差異上，且不同功能可能由組織特異性的蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)—膜相互作用驅(qū)動（Storch and Thumser，2010）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，有關(guān)FABP1和FABP2基因在家畜上的研究較少，尤其在豬各組織中的具體分子結(jié)構(gòu)、功能及相互作用尚無系統(tǒng)研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過生物信息學(xué)分析香蘇雜交豬FABP1和FABP2基因的分子結(jié)構(gòu)和功能，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測這2種基因在香蘇雜交豬各組織中的表達(dá)差異，明確FABPs對香蘇雜交豬脂肪沉積的影響，為后續(xù)進(jìn)一步探究豬脂肪細(xì)胞內(nèi)FABP1和FABP2基因?qū)χ舅岽x的調(diào)控作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

香蘇雜交豬和柯樂豬均來自貴州大學(xué)種豬場，隨機(jī)選取相同飼養(yǎng)條件下的成年豬各3頭，依照GB/T 17236—2008《豬屠宰操作規(guī)程》進(jìn)行屠宰，采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、背最長肌及脂肪等組織樣品用于總RNA提取。TRIzol? Reagent總RNA提取試劑盒、GenStar逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（StarScript II Onestep RT-PCR Kit）購自西寶生物科技（上海）股份有限公司;熒光定量試劑TB Green? Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）、pMD19-T載體、大腸桿菌（Escherichi acoli）DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司;DL2000 DNA Marker、膠回收試劑盒及卡那霉素（Kanamycin）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI已發(fā)布的豬FABP1基因（NM_001004 046.2）、FABP2基因（NM_001031780.1）核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增特異性引物及編碼區(qū)（CDS）擴(kuò)增引物（表1），以GADPH為內(nèi)參基因。所有引物均委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 組織總RNA提取及cDNA合成

采用TRIzol? Reagent總RNA提取試劑盒分別提取香蘇雜交豬和柯樂豬的組織總RNA，以超微量分光光度計(jì)測定其濃度和純度，合格的RNA置于-80 ℃冰箱中保存。采用StarScript II Onestep RT-PCR Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 實(shí)時熒光定量PCR檢測各組織表達(dá)差異

以cDNA為模板，采用實(shí)時熒光定量PCR檢測FABP1、FABP2基因在香蘇雜交豬和柯樂豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、大腸、小腸、背最長肌及脂肪等組織中的表達(dá)情況。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus） 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，50×ROX Reference Dye或50×ROX Reference Dye II 0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，滅菌水6.0 μL。然后通過2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因在不同組織中的相對表達(dá)量，并以SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

1. 5 目的基因CDS序列擴(kuò)增及測序

以香蘇雜交豬cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因CDS序列。PCR反應(yīng)體系20.0 μL：cDNA模板1.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×Taq PCR StarMix 10.0 μL，ddH2O 8.2 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 30 s， 51 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，進(jìn)行30個循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。膠回收試劑盒回收純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，然后與pMD19-T載體在16 ℃下連接12 h，再轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板后37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，經(jīng)抗性篩選，挑選出單個菌落進(jìn)行擴(kuò)繁，菌液PCR驗(yàn)證呈陽性的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 6 FABP1和FABP2基因生物信息學(xué)分析

利用DNAStar-MegAlign進(jìn)行FABP1和FABP2基因同源性分析，運(yùn)用ProtParam（https：//web.expasy. org/protparam/）和ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分別進(jìn)行編碼蛋白理化性質(zhì)及親/疏水性分析，以SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html%5D）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）預(yù)測蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)，利用PSORTⅡPreadict（https：//www.genscript.com/psort.html）和SignalP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk）對FABP1和FABP2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位及信號肽預(yù)測，采用STRING（https：//string-db.org/）預(yù)測FABP1蛋白與FABP2蛋白間的相互作用，最后以MEGA 7.0進(jìn)行FABP1和FABP2氨基酸同源性分析，并基于氨基酸序列相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 豬FABP1和FABP2基因CDS序列擴(kuò)增結(jié)果

以香蘇雜交豬cDNA為模板，PCR擴(kuò)增FABP1和FABP2基因CDS序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果在400 bp附近分別獲得清晰單一的目的條帶（圖1），且擴(kuò)增片段長度與預(yù)期結(jié)果相符。

2. 2 目的基因克隆載體構(gòu)建及鑒定結(jié)果

將香蘇雜交豬FABP1和FABP2基因CDS序列的膠回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接過夜，涂板轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后，挑選單個菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，香蘇雜交豬FABP1和FABP2基因片段大小分別為384 bp（圖2-A）和399 bp（圖2-B），與預(yù)期結(jié)果一致。將陽性菌液測序結(jié)果與NCBI已發(fā)布的豬基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，香蘇雜交豬FABP1和FABP2基因序列與野豬的FABP1和FABP2基因序列完全吻合，不存在堿基或氨基酸突變。以上結(jié)果也表明，pMD19-T-FABP1和pMD19-T-FABP2克隆載體構(gòu)建成功。

2. 3 香蘇雜交豬FABP1和FABP2基因生物信息學(xué)分析結(jié)果

2. 3. 1 香蘇雜交豬FABP1和FABP2基因編碼蛋白理化性質(zhì) 香蘇雜交豬FABP1基因CDS序列長384 bp，共編碼127個氨基酸殘基。經(jīng)ExPASy-ProtParam預(yù)測得知，F(xiàn)ABP1蛋白分子式為C623H1021N163O197S5，原子數(shù)為2009，相對分子量為14107.23 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為6.60;以賴氨酸含量最高，占11.8%，含量最低的分別是半胱氨酸、組氨酸和脯氨酸，各占0.8%;蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為10.51，屬于穩(wěn)定蛋白。由圖3-A可看出，香蘇雜交豬FABP1蛋白的第10位谷氨酰氨親水性最強(qiáng)（-2.144），而第116位甘氨酸疏水性最強(qiáng)（1.322），且負(fù)值氨基酸數(shù)遠(yuǎn)多于正值氨基酸，故推測該蛋白為親水性蛋白。

香蘇雜交豬FABP2基因CDS序列長399 bp，共編碼132個氨基酸殘基，F(xiàn)ABP2蛋白分子式為C680H1072N184O204S4，原子數(shù)為2144，相對分子量為15217.34 Da，理論等電點(diǎn)為6.61;以賴氨酸含量最高，占10.8%，含量最低的是組氨酸，僅占0.8%;蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為24.24，屬于穩(wěn)定蛋白。由圖3-B可看出，香蘇雜交豬FABP2蛋白的第14位天冬酰氨親水性最強(qiáng)（-2.711），而第65位亮氨酸疏水性最強(qiáng)（1.967），負(fù)值氨基酸數(shù)遠(yuǎn)多于正值氨基酸，故推測該蛋白為親水性蛋白。

2. 3. 2 香蘇雜交豬FABP1和FABP2蛋白二、三級結(jié)構(gòu) SOMPA預(yù)測結(jié)果顯示，香蘇雜交豬FABP1蛋白二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲組成，以β-折疊為主，占34.65%，其他3種結(jié)構(gòu)依次為無規(guī)則卷曲（占31.50%）、α-螺旋（占22.83%）和β-轉(zhuǎn)角（占11.02%）;香蘇雜交豬FABP2蛋白二級結(jié)構(gòu)同樣由4種結(jié)構(gòu)組成，其中，β-折疊占40.15%，無規(guī)則卷曲占28.03%，α-螺旋占18.94%，β-轉(zhuǎn)角占12.88%。SWISS-MODEL預(yù)測結(jié)果（圖4）顯示，香蘇雜交豬FABP1和FABP2蛋白三級結(jié)構(gòu)與其二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)構(gòu)基本一致。

2. 3. 3 香蘇雜交豬FABP1和FABP2蛋白信號肽及亞細(xì)胞定位 SignalP-5.0預(yù)測結(jié)果（圖5）顯示，香蘇雜交豬FABP1和FABP2蛋白均無信號肽剪切位點(diǎn)，表明FABP1和FABP2蛋白可能不是分泌蛋白。通過PSORTⅡPreadict對香蘇雜交豬FABP1和FABP2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP1蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體的可能性分別為56.5%、30.4%和13.0%，F(xiàn)ABP2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體的可能性分別為52.2%、26.1%和21.7%。

2. 3. 4 香蘇雜交豬FABP1和FABP2蛋白的互作蛋白

使用STRING預(yù)測香蘇雜交豬FABP1和FABP2蛋白的互作蛋白，結(jié)果（圖6）顯示與這2個蛋白可能互作的蛋白有FABP5、FABP7、過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPARα）、豬載脂蛋白A4（APOA4）、APOA1及脂酰輔酶A氧化酶1（ACOX1）等。其中，F(xiàn)ABP5和FABP7蛋白同屬于FABPs家族，也是參與脂肪酸吸收、運(yùn)輸、儲存及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵細(xì)胞內(nèi)分子（Sharifi et al.，2013）;PPARα通過對參與脂肪酸氧化基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，在脂肪酸催化中發(fā)揮重要作用，因此其編碼基因被視為影響豬脂肪特征的候選基因（Stachowiak et al.，2014）;APOA4能促進(jìn)脂質(zhì)運(yùn)輸和新陳代謝，在小腸中合成、在胸腺中包裝，然后分泌至腸道淋巴中并通過循環(huán)輸送到脂肪和其他組織（Qu et al.，2021）;ACOX1作為過氧化物β-氧化途徑的第一個限速酶，受PPARα基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，對脂肪酸氧化和沉積至關(guān)重要，尤其是在長鏈脂肪酸的脂質(zhì)代謝過程中（Wu et al.，2018）。

2. 4 FABP1和FABP2氨基酸序列同源比對分析結(jié)果

使用MegAlign對不同物種的FABP1和FABP2氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析，結(jié)果顯示，香蘇雜交豬FABP1氨基酸序列與斑馬魚、人類、馬、雞、小鼠、大鼠、山羊、牛和綿羊的FABP1氨基酸序列相似性分別為62.2%、89.8%、78.7%、72.7%、82.8%、82.0%、83.6%、83.6%和82.8%（圖7-A），除了與斑馬魚的相似性較低外，與其他幾個物種均有較高的相似性;利用MEGA 7.0構(gòu)建基于FABP1氨基酸序列相似性的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖8-A），發(fā)現(xiàn)香蘇雜交豬與人類的親緣關(guān)系最近，其次是與牛的親緣關(guān)系，與雞和斑馬魚的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。香蘇雜交豬FABP2氨基酸序列與斑馬魚、人類、馬、雞、小鼠、大鼠、山羊、牛和綿羊的FABP2氨基酸序列相似性分別為67.7%、86.5%、76.7%、74.4%、79.7%、83.5%、88.7%、88.0%和88.7%（圖7-B），與山羊和綿羊的相似性最高，與斑馬魚的相似性最低;基于FABP2氨基酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖8-B）顯示，香蘇雜交豬與牛的親緣關(guān)系最近，與山羊和綿羊的親緣關(guān)系較近，而與雞和斑馬魚的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

2. 5 FABP1和FABP2基因在香蘇雜交豬和柯樂豬不同組織中的表達(dá)情況

2. 5. 1 FABP1基因在香蘇雜交豬和柯樂豬不同組織中的表達(dá)情況 FABP1基因在香蘇雜交豬和柯樂豬不同組織中均有表達(dá)，F(xiàn)ABP1基因在香蘇雜交豬各組織中的相對表達(dá)量排序?yàn)樾∧c>肝臟>大腸>腎臟>脂肪>肺臟>脾臟>心臟>背最長?。▓D9-A），在小腸、肝臟和大腸中的相對表達(dá)量極顯著高于在其他組織中的相對表達(dá)量（P<0.01，下同），其他組織間的相對表達(dá)量無顯著差異（P>0.05，下同）。FABP1基因在柯樂豬各組織中的相對表達(dá)量排序?yàn)榇竽c>腎臟>小腸>肝臟>脾臟>脂肪>肺臟>心臟>背最長?。▓D9-B），在大腸中的相對表達(dá)量極顯著高于在其他組織中的相對表達(dá)量，背最長肌中的相對表達(dá)最低。FABP1基因在香蘇雜交豬肝臟和小腸中的相對表達(dá)量極顯著高于其在柯樂豬對應(yīng)組織中的相對表達(dá)量（圖10），在脂肪中的相對表達(dá)量顯著高于其在柯樂豬脂肪中的相對表達(dá)量（P<0.05，下同），在脾臟和腎臟中的相對表達(dá)量則極顯著低于其在柯樂豬對應(yīng)組織中的相對表達(dá)量。

2. 5. 2 FABP2基因在香蘇雜交豬和柯樂豬不同組織中的表達(dá)情況 FABP2基因在香蘇雜交豬和柯樂豬的不同組織中也均有表達(dá)，F(xiàn)ABP2在香蘇雜交豬各組織中的相對表達(dá)量排序?yàn)樾∧c>肝臟>大腸>脂肪>脾臟>腎臟>心臟>肺臟>背最長?。▓D11-C），在肝臟和小腸中的相對表達(dá)量極顯著高于在其他組織中的相對表達(dá)量，其他組織間的相對表達(dá)量差異不顯著。FABP2基因在柯樂豬各組織中的相對表達(dá)量排序?yàn)槠⑴K>大腸>小腸>肝臟>脂肪>肺臟>心臟>腎臟>背最長?。▓D11-D），以脾臟中的相對表達(dá)量最高，顯著高于其他組織中的相對表達(dá)量，而背最長肌中的相對表達(dá)量最低。FABP2基因在香蘇雜交豬肝臟和小腸中的相對表達(dá)量極顯著高于其在柯樂豬對應(yīng)組織中的相對表達(dá)量（圖12），在脂肪中的相對表達(dá)量顯著高于其在柯樂豬脂肪中的相對表達(dá)量，在脾臟和腎臟中的相對表達(dá)量也極顯著低于其在柯樂豬對應(yīng)組織中的相對表達(dá)量。

3 討論

FABPs是由多個編碼14～15 kD蛋白的基因組成，具有結(jié)合疏水生物分子如脂肪酸的能力（田鎏等， 2017），通過與PPARs進(jìn)行功能性合作（Venkatachalam et al.，2017），而有助于脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對動物的脂肪沉積產(chǎn)生重要影響。近年來，有關(guān)FABP1和FABP2的研究報道主要集中在人類和斑馬魚上，且多與疾病、癌癥及免疫等相關(guān)，而針對畜禽脂肪酸代謝調(diào)控的研究較少，具體調(diào)控機(jī)制也尚未明確（Chen et al.，2020;Tsai et al.，2020）。本研究成功克隆獲得香蘇雜交豬FABP1和FABP2基因CDS序列，與NCBI已發(fā)布的豬基因序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與野豬的FABP1和FABP2基因序列完全吻合，不存在堿基或氨基酸突變，說明這2個基因在香蘇雜交豬上穩(wěn)定遺傳。SignalP-5.0信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，香蘇雜交豬FABP1和FABP2蛋白均無信號肽剪切位點(diǎn)，與Chen等（2020）在魚類上的研究結(jié)果一致，表明FABP1和FABP2可能不是分泌蛋白。香蘇雜交豬FABP1和FABP2氨基酸序列表現(xiàn)為與人類、牛、山羊的FABP1和FABP2氨基酸序列高度同源，對應(yīng)的相似性均在80.0%以上，除斑馬魚外，與其他參考物種的相似性也在74.0%以上，由此推測香蘇雜交豬FABP1和FABP2基因序列的保守性較高，不易發(fā)生突變，與Ordovas（2009）的研究結(jié)果一致。此外，香蘇雜交豬FABP1、FABP2分別有56.5%和52.2%的可能位于細(xì)胞質(zhì)，其二、三級結(jié)構(gòu)主要由β-折疊和無規(guī)則卷曲構(gòu)成。

FABP1和FABP2主要以小分子蛋白的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，共同參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的運(yùn)輸，但其具體功能有所不同。FABP1是腸細(xì)胞中高度豐富的細(xì)胞內(nèi)蛋白，存在于整個腸道，且以十二指腸和空腸的表達(dá)水平較高（Agellon et al.，2002）。FABP1有2個FA結(jié)合位點(diǎn)，較其他FABPs具有更高的結(jié)合力，可直接通過擴(kuò)散機(jī)制將脂肪酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上（Hsu and Storch，1996;Storch et al.，2002）。FABP2主要在小腸和肝臟中表達(dá)，與其他FABPs家族成員一樣，僅擁有單一的結(jié)合位點(diǎn)，對不飽和脂肪酸具有較高的親和力，通過碰撞機(jī)制將脂肪酸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜上（Hsu and Storch，1996;Storch et al.，2002）。本研究通過實(shí)時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP1、FABP2基因在香蘇雜交豬和柯樂豬的各組織中均有不同程度的表達(dá)，可能與基因在組織中的特異性有關(guān)（Alves-Costa et al.，2008;Liu et al.，2008）。肝臟、小腸和脂肪是甘油三酯和脂肪酸合成代謝的主要部位，能改變肌間脂肪及肌內(nèi)脂肪的含量（Jensen et al.，1990;Hunter，2001）。無論是香蘇雜交豬還是柯樂豬，F(xiàn)ABP1、FABP2基因均以在肝臟、小腸和脂肪中的相對表達(dá)量較高，以背最長肌中的相對表達(dá)量最低，表明FABP1和FABP2基因可能廣泛參與各組織的表達(dá)調(diào)控。此外，F(xiàn)ABP1和FABP2基因在香蘇雜交豬肝臟和小腸中的相對表達(dá)量極顯著高于其在柯樂豬對應(yīng)組織中的相對表達(dá)量，在脂肪中的相對表達(dá)量則顯著高于其在柯樂豬脂肪中的相對表達(dá)量，故推測這2個基因?qū)ο闾K雜交豬的調(diào)控作用大于柯樂豬。綜上所述，F(xiàn)ABP1和FABP2基因在豬的肝臟、小腸和脂肪中呈特異性表達(dá)，可能與脂肪酸的合成代謝有關(guān)。該結(jié)論為揭示FABP1和FABP2基因?qū)χ舅岽x的調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。

4 結(jié)論

FABP1和FABP2基因在豬的各組織中均有表達(dá)，且以在甘油三酯和脂肪酸合成代謝的相關(guān)組織（肝臟、小腸和脂肪）中特異性高表達(dá)，可能對脂肪的合成代謝起重要調(diào)控作用。

參考文獻(xiàn)：

陳芳，張昊，盧立志. 2011. 鴨I-FABP基因的克隆、組織表達(dá)模式及功能研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，47（5）：1041-1048. [Chen F，Zhang H，Lu L Z. 2011. Molecular cloning，expression pattern and function of duck I-FABP gene[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，47（5）：1041-1048.] doi：10.11843/j.issn.0366-6964.2016.05.023.

陳靜，尤瑞國，劉慧敏，楊國慶. 2021. 檸檬醛對小鼠生長性能、肌內(nèi)脂肪含量及脂肪酸代謝酶的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，55（4）：721-726. [Chen J，You R G，Liu H M，Yang G Q. 2021. Effects of citral on growth performance，intramuscular fat content and fatty acid metaboli-zing enzymes in mice[J]. Journal of Henan Agricultural University，55（4）：721-726.] doi：10.16445/j.cnki.1000-2340.20210531.001.

陳璐. 2013. 脂肪酸結(jié)合蛋白（FABPs）基因多態(tài)性對畜產(chǎn)品品質(zhì)的影響[J]. 畜牧與飼料科學(xué)，34（10）：82-84. [Chen L. 2013. Effects of fatty acid-binding proteins （FABPs） gene polymorphisms on animal products quality[J]. Animal Husbandry and Feed Science，34（10）：82-84.] doi：10.3969/j.issn.1672-5190.2013.10.040.

崔璐，陳星，周穎，張淑君. 2016. FABPs家族基因的研究進(jìn)展[J]. 畜牧與獸醫(yī)，48（7）：128-131. [Cui L，Chen X，Zhou Y，Zhang S J. 2016. Research progress on FABPs family genes[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine，48（7）：128-131.]

董飚，秦豪榮，王健，孫國波，紀(jì)榮超. 2016. 鴨A-FABP基因多態(tài)性在品種和世代間的比較分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，45（8）：131-135. [Dong B，Qin H R，Wang J，Sun G B，Ji R C. 2016. Comparative study of polymorphism in breeds and generations based on duck A-FABP gene[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，45（8）：131-135.] doi：10.15933/j.cnki.1004-3268.2016.08.025.

何俊. 2013. 鴨L-FABP、A-FABP基因多態(tài)性與肌內(nèi)脂肪含量的相關(guān)性及其對脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響[D]. 杭州：浙江大學(xué). [He J. 2013. Study on the associations of duck L-FABP and A-FABP gene polymorphisms with intramuscular fat contents and their influences on the expression of lipid-metabolism related genes[D]. Hangzhou：Zhejiang University.]

錢成. 2016. 貴州白山羊L-FABP和H-FABP基因表達(dá)、多態(tài)性與生長性狀的遺傳效應(yīng)研究[D]. 貴陽：貴州大學(xué). [Qian C. 2016. Association of expression，polymorphism and effects of L-FABP and H-FABP gene with growth traits in Guizhou white goat[D]. Guiyang：Guizhou University.]

田鎏，張昌軍，刁紅錄. 2017. 脂肪酸結(jié)合蛋白研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)，29（2）：164-169. [Tian L，Zhang C J，Diao H L. 2017. Advances in fatty acid binding proteins research[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences，29（2）：164-169.] doi：10.13376/j.cbls/2017021.

俞英，王棟，孫東曉，徐桂云，李俊英，張沅. 2011. 雞L-FABP基因全長cDNA克隆表達(dá)及與雜種雞脂肪沉積的關(guān)系[J]. 遺傳，33（7）：763-767. [Yu Y，Wang D，Sun D X，Xu G Y，Li J Y，Zhang Y. 2011. Whole cDNA sequence cloning and expression of chicken L-FABP gene and its relationship with lipid deposition of hybrid chickens[J]. Hereditas，33（7）：763-767.] doi：10.3724/SP.J.1005.2011. 00763.

鄒增丁，陳立祥，蘇建明. 2007. 脂肪酸結(jié)合蛋白生物學(xué)特性及對脂肪代謝調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 飼料工業(yè)，28（11）：24-26. [Zou Z D，Chen L X，Su J M. 2007. Research progress in fatty acid-binding protein biology and regulation to fatty metabolism[J]. Feed Industry，28（11）：24-26.] doi：10.3969/j.issn.1001-991X.2007.11.007.

Agellon L B，Toth M J，Thomson A B R. 2002. Intracellular lipid binding proteins of the small intestine[J]. Molecular and Cellular Biochemistry，239（1-2）：79-82. doi：10. 1023/A：1020520521025.

Alves-Costa F A，Denovan-Wright E M，Thisse C，Thisse B，Wright J M. 2008. Spatio-temporal distribution of fatty acid-binding protein 6 （FABP6） gene transcripts in the developing and adult zebrafish （Danio rerio）[J]. The FEBS Journal，275（13）：3325-3334. doi：10.1111/j.1742-4658. 2008.06480.x.

Chen X，Gao Y，Wu G，Gu J，Cai Y，Xu J，Cheng H. 2020. Molecular cloning，tissue expression，and transcriptional regulation of FABP1 and FABP2 in javelin goby（Syne-chogobius hasta）in response to starvation stress[J]. Comparative Biochemistry and Physiology. Part B：Biochemistry and Molecular Biology，250：110484. doi：10.1016/j.cbpb.2020.110484.

Gajda A M，Zhou Y X，Agellon L B，F(xiàn)ried S K，Kodukula S，F(xiàn)ortson W，Patel K，Storch J. 2013. Direct comparison of mice null for liver or intestinal fatty acid-binding proteins reveals highly divergent phenotypic responses to high fat feeding[J]. Journal of Biological Chemistry，288（42）：30330-30344. doi：10.1074/jbc.M113.501676.

Hotamisligil G S，Bernlohr D A. 2015. Metabolic functions of FABPs—Mechanisms and therapeutic implications[J]. Nature Reviews Endocrinology，11（10）：592-605. doi：10. 1038/nrendo.2015.122.

Hsu K. T，Storch J. 1996. Fatty acid transfer from liver and intestinal fatty acid-binding proteins to membranes occurs by different mechanisms[J]. Journal of Biological Chemi-stry，271（23）：13317-13323. doi：10.1074/jbc.271.23.13317.

Hunter J E. 2001. Studies on effects of dietary fatty acids as related to their position on triglycerides[J]. Lipids，36（7）：655-668. doi：10.1007/s11745-001-0770-0.

Jefferson J R，Powell D M，Rymaszewski Z，Kukowska-Latallo J，Lowe J B，Schroeder F. 1990. Altered membrane structure in transfected mouse L-cell fibroblasts expres-sing rat liver fatty acid-binding protein[J]. The Journal of Biological Chemistry，265（19）：11062-11068. doi：10. 1016/S0021-9258（19）38557-6.

Jensen G L，Mascioli E A，Seidner D L，Istfan N W，Domnitch A M，Selleck K，Babayan V K，Blackburn G L，Bistrian B R. 1990. Parenteral infusion of long- and medium-chain triglycerides and reticuloendothelial system function in man[J]. Journal of Parenteral and Enteral Nutrition，14（5）：467-471. doi：10.1177/0148607190014005467.

Lawrence J W，Kroll D J，Eacho P I. 2000. Ligand-dependent interaction of hepatic fatty acid-binding protein with the nucleus[J]. Journal of Lipid Research，41（9）：1390-1401. doi：10.1016/S0022-2275（20）33451-9.

Liu R Z，Li X D，Godbout R. 2008. A novel fatty acid-bin-ding protein （FABP） gene resulting from tandem gene duplication in mammals：Transcription in rat retina and testis[J]. Genomics，92（6）：436-445. doi：10.1016/j.ygeno. 2008.08.003.

Ockner R K，Manning J A，Poppenhausen R B，Ho W K L. 1972. A Binding Protein for fatty acids in cytosol of intestinal mucosa，liver，myocardium，and other tissues[J]. Science，177（4043）：56-58. doi：10.1126/science.177.4043. 56.

Ordovas J M. 2009. Genetic influences on blood lipids and cardiovascular disease risk：Tools for primary prevention[J]. The American Journal of Clinical Nutrition，89（5）：1509S-1517S. doi：10.3945/ajcn.2009.27113E.

Qu J，F(xiàn)ourman S，F(xiàn)itzgerald M，Liu M，Nair S，Oses-Prieto J，Burlingame A，Morris J H，Davidson W S，Tso P，Bhargava A. 2021. Low-density lipoprotein receptor-related protein 1 （LRP1） is a novel receptor for apolipoprotein A4 （APOA4） in adipose tissue[J]. Scientific Reports：11：13289. doi：10.1038/s41598-021-92711-0.

Samulin J，Berget I，Lien S，Sundvold H. 2008. Differential gene expression of fatty acid binding proteins during porcine adipogenesis[J]. Comparative Biochemistry and Physio-logy. Part B：Biochemistry and Molecular Biology，151（2）：147-152. doi：10.1016/j.cbpb.2008.06.010.

Sharifi K，Ebrahimi M，Kagawa Y，Islam A，Tuerxun T，Yasumoto Y，Hara T，Yamamoto Y，Miyazaki H，Tokuda N，Yoshikawa T，Owada Y. 2013. Differential expression and regulatory roles of FABP5 and FABP7 in oligodendrocyte lineage cells[J]. Cell and Tissue Research，354（3）：683-695. doi：10.1007/s00441-013-1730-7.

Stachowiak M，Szydlowski M，F(xiàn)lisikowski K，F(xiàn)lisikowska T，Bartz M，Schnieke A，Switonski M. 2014. Polymorphism in 3' untranslated region of the pig PPARA gene influen-ces its transcript level and is associated with adipose tissue accumulation[J]. Journal of Animal Science，92（6）：2363-2371. doi：10.2527/jas.2013-7509.

Storch J，Thumser A E. 2010. Tissue-specific functions in the fatty acid-binding protein family[J]. Journal of Biological Chemistry，285（43）：32679-32683. doi：10.1074/jbc.R110.135210.

Storch J，Veerkamp J H，Hsu K T. 2002. Similar mechanisms of fatty acid transfer from human anal rodent fatty acid-binding proteins to membranes：Liver，intestine，heart muscle，and adipose tissue FABPs[J]. Molecular and Cellular Biochemistry，239（1-2）：25-33. doi：10.1023/A：1020 546321508.

Tsai I T，Wu C C，Hung W C，Lee T L，Hsuan C F，Wei C T，Lu Y C，Yu T H，Chung F M，Lee Y J，Wang C P. 2020. FABP1 and FABP2 as markers of diabetic nephropathy[J]. Internationl Journal of Medical Sciences，17（15）：2338-2345. doi：10.7150/ijms.49078.

Venkatachalam A B，Parmar M B，Wright J M. 2017. Evolution of the duplicated intracellular lipid-binding protein genes of teleost fishes[J]. Molecular Genetics and Geno-mics，292（4）：699-727. doi：10.1007/s00438-017-1313-5.

Wang G Q，Bonkovsky H L，de Lemos A，Burczynski F J. 2015. Recent insights into the biological functions of liver fatty acid binding protein 1[J]. Journal of Lipid Research，56（12）：2238-2247. doi：10.1194/jlr.R056705.

Wang Q，Li H，Li N，Leng L，Wang Y. 2006. Tissue expression and association with fatness traits of liver fatty acid-binding protein gene in chicken[J]. Poultry Science，85（11）：1890-1895. doi：10.1093/ps/85.11.1890.

Wu X F，Liu Y，Gao C F，Chen X Z，Zhang X P，Li W Y. 2018. Novel alternative splicing variants of ACOX1 and their differential expression patterns in goats[J]. Archives Animal Breeding，61（1）：59-70. doi：10.5194/aab-61-59-2018.

Zhang Y R，Zhang J M，Ren Y H，Lu R H，Yang L P，Nie G X. 2020. Tracing the evolution of fatty acid-binding proteins （FABPs） in organisms with a heterogeneous fat distribution[J]. FEBS Open Biology，10（5）：861-872. doi：10.1002/2211-5463.12840.

Zimmerman A W，Veerkamp J H. 2002. New insights into the structure and function of fatty acid-binding proteins[J]. Cellular and Molecular Life Sciences，59（7）：1096-1116. doi：10.1007/s00018-002-8490-y.

收稿日期：2021-12-20

基金項(xiàng)目：貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合服企〔2018〕4007（002）號）;貴州省農(nóng)業(yè)重大產(chǎn)業(yè)科學(xué)研究攻關(guān)項(xiàng)目（黔教合KY字〔2019〕011號）

通訊作者：許厚強(qiáng)（1957-），https：//orcid.org/0000-0002-4696-5671，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事細(xì)胞分子生物學(xué)及動物遺傳育種研究工作，E-mail：gzdxxhq@126.com

第一作者：熊訊（1997-），https：//orcid.org/ 0000-0001-9653-1153，研究方向?yàn)閯游镞z傳育種與繁殖，E-mail：445182432@qq.com