崔 潔，陳紫鶯，王宏麗，郭靈麗,2，郝小惠,2，劉和亮,2

矽肺是一種古老的塵肺病，主要由長(zhǎng)期吸入游離二氧化硅(SiO2)引起，作為采礦和制造等行業(yè)工人面臨的主要職業(yè)健康問(wèn)題，每年可導(dǎo)致約24 000人死亡[1]。由于矽肺的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的治療方法。因此，對(duì)其發(fā)病機(jī)制展開深入研究意義重大。有證據(jù)[2]表明，肺淋巴系統(tǒng)在矽肺發(fā)病機(jī)制中占據(jù)重要地位，淋巴結(jié)纖維化導(dǎo)致肺部矽塵的清除受阻，加速肺損傷。Yu et al[3]和課題組前期研究[4]表明，促進(jìn)大鼠肺部淋巴管生成可改善矽肺大鼠肺淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)，減少肺間質(zhì)內(nèi)SiO2沉積，延緩矽肺進(jìn)展。但肺部淋巴循環(huán)障礙對(duì)矽肺發(fā)病進(jìn)程的影響尚未有研究，該研究擬在探討肺淋巴循環(huán)障礙對(duì)矽肺發(fā)病進(jìn)程的影響。研究通過(guò)手術(shù)結(jié)扎大鼠胸導(dǎo)管，建立矽肺淋巴循環(huán)障礙模型，通過(guò)檢測(cè)肺組織內(nèi)淋巴管的變化以及參與淋巴管生成因子和纖維化進(jìn)程相關(guān)因子的表達(dá)，從新的視角探討肺淋巴管在矽肺發(fā)病機(jī)制中的重要作用，為矽肺的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)成年雄性SD大鼠24只(體質(zhì)量180～250 g)購(gòu)自北京華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心屏障實(shí)驗(yàn)室[SYXK(冀)2020-0007]；SiO2粉塵購(gòu)自河北省煤礦衛(wèi)生與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。該研究經(jīng)華北理工大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(審批號(hào)：LX2019035)。

1.2 主要試劑與儀器天狼猩紅染色試劑盒(北京雷根生物科技有限公司)，手術(shù)黏合劑(唐山華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院)，蘇木精(武漢珠海貝索生物科技有限公司)，平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(英國(guó)Abcam公司)，手術(shù)電凝針(張家港市航天醫(yī)療電器廠)，核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-κBp65，NF-κBp65)(美國(guó)Affinity Biosciences公司)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor-3，VEGFR-3)(英國(guó)Abcam公司)。

1.3 動(dòng)物分組與模型建立將28 d大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、結(jié)扎對(duì)照組、矽肺組及矽肺+結(jié)扎組，n=6。對(duì)照組不做處理；結(jié)扎對(duì)照組大鼠被麻醉后先手術(shù)分離頸部組織，暴露胸導(dǎo)管，后采用手術(shù)電凝針將胸導(dǎo)管結(jié)扎，用手術(shù)黏合劑閉合手術(shù)部位，于小動(dòng)物體溫維持毯上進(jìn)行術(shù)后保溫，待其意識(shí)恢復(fù)后正常飼養(yǎng)1 d；矽肺模型組大鼠采用HOPE-MED8050系列動(dòng)式染毒控制裝置(染塵倉(cāng)內(nèi)濃度2 000 mg/m3，每天給予動(dòng)式染塵3 h)建立矽肺模型；矽肺+結(jié)扎組大鼠先手術(shù)暴露并結(jié)扎胸導(dǎo)管，用手術(shù)黏合劑閉合手術(shù)組織后正常飼養(yǎng)1 d，然后給予與矽肺組相同處理。

1.4 肺組織病理學(xué)檢查腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，將其固定于鼠板上。采用腹主動(dòng)脈采血法處死大鼠，獲取右下肺，并將其置于4%多聚甲醛固定液中，24 h后制作石蠟切片，并進(jìn)行HE和天狼猩紅染色。正置光學(xué)顯微鏡和偏振光顯微鏡下獲取圖片。其余肺組織分裝于高壓EP管內(nèi)置于-80 ℃冰箱備用。

1.5 肺部淋巴管的變化將肺組織石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟至水，高壓修復(fù)抗原。于切片上滴加內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min。滴加LYVE-1(1 ∶100)，4 ℃過(guò)夜，滴加IgG聚合物37 ℃孵育30 min,用DAB顯色試劑盒顯色，常規(guī)復(fù)染，脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡獲取圖像。

1.6 肺組織內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)將各組大鼠肺組織研磨勻漿，并提取肺組織蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳和電轉(zhuǎn)。孵育一抗 VEGFR-3(1 ∶800)、NF-κBp65(1 ∶500)、α-SMA(1 ∶500)于4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。山羊抗兔或抗小鼠二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h。使用ECL發(fā)光試劑于ECLTM蛋白檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)，使用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)結(jié)果HE染色結(jié)果(圖1)顯示，與對(duì)照組相比，矽肺組大鼠肺組織內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁增厚；矽肺+結(jié)扎組大鼠相較于對(duì)照組和矽肺組病變更為嚴(yán)重，表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)被破壞，以巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞為主細(xì)胞性結(jié)節(jié)形成。

圖1 HE染色 ×100 A：對(duì)照組；B：結(jié)扎對(duì)照組；C：矽肺組；D：矽肺+結(jié)扎組

2.2 天狼猩紅染色結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組比較，矽肺模型組大鼠肺組織內(nèi)出現(xiàn)條索樣Ⅰ(綠色)、Ⅲ型(強(qiáng)橙黃色)膠原沉積；與矽肺模型組相比，矽肺+結(jié)扎組大鼠肺組織內(nèi)膠原沉積更為明顯。

圖2 天狼猩紅染色 ×100 A：對(duì)照組；B：結(jié)扎對(duì)照組；C：矽肺組；D：矽肺+結(jié)扎組

2.3 肺組織內(nèi)淋巴管免疫組化結(jié)果如圖3所示，對(duì)照組內(nèi)未觀察到淋巴管，而矽肺組大鼠肺組織內(nèi)有明顯的LYVE-1陽(yáng)性淋巴管的出現(xiàn)，矽肺+結(jié)扎組大鼠肺組織內(nèi)有陽(yáng)性淋巴管出現(xiàn)，但官腔萎縮塌陷。

圖3 免疫組化染色 ×200

2.4 各組大鼠淋巴管生成因子VEGFR-3表達(dá)含量的比較與對(duì)照組相比，矽肺組大鼠肺組織內(nèi)VEGFR-3的表達(dá)上調(diào)[分別為(0.35±0.01)、(0.97±0.03)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；結(jié)扎矽肺大鼠胸導(dǎo)管后，VEGFR-3的表達(dá)(0.87±0.01)相較于矽肺組下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 356.72，P<0.05)。見圖4。

圖4 各組大鼠肺組織中VEGFR-3的表達(dá)

2.5 各組大鼠肺組織內(nèi)炎癥因子和致纖維化因子的表達(dá)含量的比較Western blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，矽肺組大鼠肺組織內(nèi)NF-κBp65[(1.80±0.01)vs(0.60±0.11)，F(xiàn)=421]和α-SMA[(2.57±0.01)vs(0.40±0.05)，F(xiàn)=1 801]的表達(dá)明顯增高，矽肺+結(jié)扎組[分別為(2.42±0.05)、(3.24±0.06)]高于矽肺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組大鼠肺組織中NF-κBp65和α-SMA的含量

3 討論

矽肺是中國(guó)最嚴(yán)重的職業(yè)病[5]，SiO2的累積呼吸暴露量(暴露強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的函數(shù))是矽肺發(fā)生的主要因素[6]。矽肺動(dòng)物模型的建立，為矽肺發(fā)病機(jī)制研究提供了便利。動(dòng)式染塵是近年來(lái)新興的一種建立矽肺模型的新方法[7]。此方法相較于以往的矽肺造模方式如一次性非氣管暴漏灌注和暴漏氣管灌注SiO2懸濁液，采用該方法建立矽肺動(dòng)物模型可以較好的模擬工人接觸SiO2粉塵的過(guò)程，減少因人為操作不當(dāng)造成的動(dòng)物死亡，但是此法耗時(shí)長(zhǎng)，成本高。該研究HE和天狼猩紅染色結(jié)果表明，采用動(dòng)式染塵法成功建立了矽肺大鼠模型，且在造模過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物未出現(xiàn)死亡情況。

由于矽肺的發(fā)病機(jī)制尚不明確，因此，對(duì)矽肺發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究十分必要。課題組前期研究[4]表明，改善肺淋巴管循環(huán)可以有效的延緩矽肺病情進(jìn)展，但是肺淋巴循環(huán)障礙對(duì)矽肺發(fā)病進(jìn)程的影響尚待證實(shí)。胸導(dǎo)管是肺部淋巴系統(tǒng)通向體液循環(huán)系統(tǒng)的重要通道[8]。因此，結(jié)扎胸導(dǎo)管可中斷正常淋巴循環(huán)?；诖?，該研究旨在通過(guò)結(jié)扎胸導(dǎo)管建立肺淋巴循環(huán)障礙模型，探討肺淋巴循環(huán)障礙對(duì)矽肺病情進(jìn)展的影響。HE、天狼猩紅染色結(jié)果顯示，矽肺+結(jié)扎胸導(dǎo)管組大鼠肺組織病變更為嚴(yán)重，表明矽肺淋巴循環(huán)障礙模型建立成功。

淋巴管的活化、生成以及淋巴引流的增強(qiáng)可對(duì)機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥過(guò)程產(chǎn)生一定調(diào)節(jié)作用，當(dāng)淋巴管網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行重塑時(shí)，淋巴組織引流能力加強(qiáng)，由此可去除體內(nèi)積聚的組織液、免疫細(xì)胞、組織碎片、生長(zhǎng)因子等加快炎癥的消退[9]。巨噬細(xì)胞等白細(xì)胞受到刺激產(chǎn)生的大量VEGF-C是淋巴管生成的重要調(diào)節(jié)因子[10-11]，可使組織炎癥部位及其下游淋巴結(jié)處的淋巴管密度增加。該研究免疫組化和免疫印跡結(jié)果顯示，矽肺大鼠和矽肺+結(jié)扎組大鼠染塵后肺部出現(xiàn)了淋巴管增生，且淋巴管特異性標(biāo)記因子VEGFR-3[12-13]的表達(dá)相較于對(duì)照組上調(diào)，推測(cè)大鼠染塵初期由于粉塵進(jìn)入后被巨噬細(xì)胞吞噬，從而促進(jìn)了肺部淋巴管增生，這與該課題組體外研究[14]結(jié)果一致。

胸導(dǎo)管到肺實(shí)質(zhì)的淋巴循環(huán)異常是肺淋巴疾病的重要原因[15]。該研究進(jìn)一步探討了結(jié)扎矽肺大鼠胸導(dǎo)管后對(duì)矽肺發(fā)病進(jìn)程的影響。該研究表明，矽肺+結(jié)扎胸導(dǎo)管組大鼠雖出現(xiàn)肺部淋巴管增生，但 NF-κBp65和α-SMA的表達(dá)均高于矽肺模型組，可能由于其胸導(dǎo)管被結(jié)扎，導(dǎo)致染塵初期肺內(nèi)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，粉塵及炎性細(xì)胞因子不能及時(shí)排出而積聚于肺組織，導(dǎo)致炎癥長(zhǎng)時(shí)間無(wú)法消退，加重了肺組織損傷，從而導(dǎo)致了纖維化。

在對(duì)矽肺機(jī)制的研究[2]中，人們已經(jīng)開始注意到淋巴結(jié)，尤其是肺門淋巴結(jié)在清除肺部粉塵中的作用，并認(rèn)為淋巴結(jié)瘀滯堵塞可能是肺纖維化進(jìn)展的一個(gè)因素。該研究首次探討矽肺淋巴循環(huán)障礙對(duì)矽肺發(fā)病進(jìn)程的影響，通過(guò)手術(shù)結(jié)扎胸導(dǎo)管成功建立肺淋巴循環(huán)障礙模型，并證明了肺淋巴循環(huán)障礙會(huì)加快矽肺病情進(jìn)展。但是該研究未進(jìn)行淋巴液T細(xì)胞的檢測(cè)以確定結(jié)扎胸導(dǎo)管的成功率，其影響矽肺進(jìn)程的具體機(jī)制也還需進(jìn)一步探討。