李穎利，卞 博，劉東嬌，趙晨光，郝元森，韓 立，卞 華，郭克磊

(南陽理工學(xué)院 1.張仲景國醫(yī)國藥學(xué)院、2.河南省張仲景方藥與免疫調(diào)節(jié)重點實驗室，河南 南陽 473004)

系統(tǒng)性硬化病(systemic sclerosis，SSc)是一種以皮膚增厚和纖維化及胃腸道、肺、心、血管等多個系統(tǒng)受累為特征的自身免疫性疾病。SSc的病因及發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前認為病因與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)，發(fā)病機制包括血管病變、免疫系統(tǒng)功能失調(diào)、纖維化及3者間的相互作用，共同導(dǎo)致了SSc的發(fā)生和發(fā)展[1]。毛細血管和小動脈等微血管的損傷和內(nèi)皮細胞的活化導(dǎo)致的血管病變是SSc進程中最早出現(xiàn)的病變[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Sema3A/Nrp1途徑的異常調(diào)節(jié)與血管病變過程密切相關(guān)，Sema3A/Nrp1軸已成為血管病變相關(guān)疾病的治療靶點。

中醫(yī)藥治療SSc有較好效果，藥理研究機制以抗纖維化為主[3]。本課題組基于肺脾腎-皮毛相關(guān)理論指導(dǎo)創(chuàng)立溫陽化濁通絡(luò)方治療SSc具有較好臨床療效，前期研究發(fā)現(xiàn)溫陽化濁通絡(luò)方能夠降低SSc患者血漿內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)、血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)水平、循環(huán)內(nèi)皮細胞數(shù)量，降低SSc患者甲襞血管管攀形態(tài)、血管流態(tài)、襻周狀態(tài)的積分；溫陽化濁通絡(luò)方還可抑制SSc模型小鼠血清VEGF、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)和ET-1的表達水平[4-6]。說明溫陽化濁通絡(luò)方具有保護血管，改善甲襞微循環(huán)障礙的作用，但其機制還不清楚。本研究通過建立SSc小鼠模型，觀察溫陽化濁通絡(luò)方對SSc小鼠Sema3A/Nrp1信號通路的影響，探討其治療SSc的作用機制，為SSc的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級C57BL/6N♀小鼠60只，體質(zhì)量(18～20) g，7～8周齡，購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(浙)2019-0001，所有動物的飼養(yǎng)及實驗操作均符合實驗動物福利及倫理要求。

1.2 藥物注射用鹽酸博來霉素(批號19033911，1.5萬U)購自瀚暉制藥有限公司；Sema3A抑制劑EGCG(純度99.87%，HY-13653)購自美國MedChemExpress；溫陽化濁通絡(luò)組方藥材黃芪30 g、黨參15 g、桂枝9 g、淫羊藿12 g、積雪草15 g、白芥子9 g等購自河南省張仲景大藥房。溫陽化濁通絡(luò)組方藥液制備方法如下：將所有組方藥材混合用蒸餾水浸泡30 min，置于陶瓷中藥煎鍋內(nèi)武火煎煮開后煎30 min，過濾并收集藥液，再次加入蒸餾水煎30 min，合并兩次濾液濃縮至藥液濃度相當(dāng)于生藥2.8 kg·L-1，于-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ罁?jù)人和小鼠每公斤體重劑量折算系數(shù)計算，溫陽化濁通絡(luò)方低、中、高劑量組的給藥劑量分別為21、42、84 g·kg-1。

1.3 主要試劑與儀器4%多聚甲醛固定液(P0099)、蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(C0105S)、DAB顯色試劑盒(P0203，上海碧云天)；BCA蛋白測定試劑盒(A53226)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(34577，美國Thermo Fisher)哺乳動物蛋白抽提試劑盒(CW0889，北京康為世紀)；GAPDH鼠單抗(AC002，武漢愛博泰克)，Sema3A兔多抗(DF8609)、VEGFA兔多抗(AF5131，江蘇親科)，Nrp1鼠單抗(sc-5307，美國Santa Cruz)，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(5220-0336)、羊抗鼠二抗(074-1806，美國KPL)；小鼠Sema3A ELISA試劑盒(CSB-EL020980MO，武漢華美生物)；石蠟切片機(CUT6062，德國SLEE)，包埋機(TKY-BMB，湖北泰康醫(yī)療)，組織脫水機(MTM，德國SLEE)，倒置顯微鏡(IX71，日本OLYMPUS)，組織細胞破碎儀(Bullet Blender STORM，美國Next Advance)，全功能酶標(biāo)儀(Synergy H1，美國BioTek)，蛋白電泳儀(Mini-PROTEAN 3)、凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+，美國Bio-Rad)。

1.4 模型構(gòu)建及實驗分組將60只小鼠隨機分為對照組(Control)、模型組(SSc model)、Sema3A抑制劑組(EGCG)、溫陽化濁通絡(luò)方低(Low dose)、中(Medium dose)、高(High dose)劑量組，每組各10只。對照組連續(xù)皮下注射4周PBS 0.1 mL·d-1，其余各組給予200 mg·L-1的博萊霉素(用pH 7. 4的PBS稀釋) 0.1 ml·d-1皮下注射連續(xù)4周，建立SSc模型[7]。

1.5 給藥方法對照組和模型組小鼠給予生理鹽水0.3 mL·d-1灌胃連續(xù)4周；Sema3A抑制劑組采用腹腔皮下注射10 mg·kg-1·3d-1，連續(xù)注射4周；溫陽化濁通絡(luò)方低、中、高劑量組灌胃劑量分別為21、42、84 g·kg-1·d-1，連續(xù)給藥4周。

1.6 皮膚組織病理學(xué)檢測取背部造模部位皮膚，4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片、脫水，HE染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚病理改變。每組內(nèi)每張切片隨機挑選3個100倍視野進行拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件以100倍標(biāo)尺為標(biāo)準(zhǔn)，選取合適的視野，每張切片測量5處皮膚真皮層厚度(μm)，并求出平均值。

1.7 免疫組化法檢測皮膚組織VEGFA表達將4%多聚甲醛固定的小鼠皮膚取出進行蠟塊包埋、切片置載玻片，脫蠟至水，EDTA進行抗原修復(fù)，3% BSA室溫孵育30 min，滴加VEGFA(1 ∶100)一抗，洗滌，加二抗(1 ∶200)，洗滌后DAB顯色封片于顯微鏡下觀察拍攝。每組內(nèi)每張切片隨機挑選3個200倍視野進行拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析陽性的累積光密度值(IOD)以及組織的像素面積(AREA)，并求出平均光密度值IOD/AREA(Mean Density)。

1.8 Western blot法檢測皮膚組織Sema3A、Nrp1及VEGFA蛋白表達給藥4周后，取小鼠背部皮膚，加入哺乳動物蛋白抽提試劑進行組織勻漿，冰浴裂解，離心后取上清液，BCA蛋白定量試劑盒定量上清中蛋白濃度，取30 μg待測蛋白加入上樣緩沖液，煮沸10 min；SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5% BSA封閉1 h，加入Sema3A、Nrp1、VEGFA一抗孵育2 h，TBST洗滌5次，加入對應(yīng)HRP標(biāo)記兔、鼠二抗孵育2 h，TBST洗滌5次，ECL試劑顯影后使用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.9 ELISA法檢測血清Sema3A水平末次灌胃后半小時，麻醉小鼠通過眼眶動脈采血，收集血液放入不含抗凝劑的試管中，4 ℃靜置2～3 h，以2 500 r·min-1離心10 min，取上層血清，按照ELISA試劑盒操作步驟檢測各組血清中Sema3A的水平。

2 結(jié)果

2.1 HE染色檢測各組小鼠皮膚組織病理變化Fig 1結(jié)果顯示，與對照組比較，SSc模型組真皮層可見炎性細胞浸潤，毛囊、汗腺等結(jié)構(gòu)減少，血管壁增厚，局部可見成纖維細胞增生，炎性細胞浸潤；與模型組比較，溫陽化濁通絡(luò)方低、中、高劑量組和抑制劑組小鼠真皮層炎性細胞浸潤減少。如Fig 2所示，與對照組相比，模型組真皮層明顯增厚(P<0.01)；與模型組相比，EGCG組真皮厚度明顯減弱(P<0.01)，低、中、高劑量溫陽化濁通絡(luò)方處理后真皮層厚度均變薄(P<0.05)。

Fig 1 HE staining of mouse skin tissues (×100)

Fig 2 Effect of WYHZTLF on dermal thickness n=5)1:Control;2:SSc model;3:Low dose;4:Medium dose;5:High dose;6:EGCG. △△P<0.01 vs Control; *P<0.05, **P<0.01 vs SSc model

2.2 免疫組化法檢測各組小鼠皮膚組織VEGFA蛋白表達如Fig 3、4所示，與對照組比較，SSc模型組VEGFA蛋白表達增加(P<0.05)；與模型組比較，EGCG組VEGFA蛋白表達明顯降低(P<0.05)，溫陽化濁通絡(luò)方低、中、高劑量組VEGFA蛋白表達均降低，中、高劑量組差異具有顯著性(P<0.05)。

Fig 3 Immunohistochemistry of VEGFA in mouse skin tissues (×200)

Fig 4 Effect of WYHZTLF on VEGFA protein 1:Control;2:SSc model;3:Low dose;4:Medium dose;5:High dose;6:EGCG. △P<0.05 vs Control; *P<0.05 vs SSc model

2.3 Western blot檢測小鼠皮膚Sema3A、Nrp1及VEGFA蛋白表達結(jié)果如Fig 5所示，與對照組比較，SSc模型組Sema3A、VEGF蛋白表達明顯增加(P<0.05，P<0.01)，Nrp1蛋白表達明顯減弱(P<0.01)；與模型組相比，溫陽化濁通絡(luò)方低、中、高劑量組Sema3A、VEGFA蛋白表達均降低，差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，Nrp1蛋白表達均增強，高劑量組差異具有顯著性(P<0.05)，EGCG組Sema3A表達降低(P<0.05)，VEGFA表達顯著降低(P<0.01)，Nrp1蛋白表達明顯增強(P<0.05)。

Fig 5 Effect of WYHZTLF on Sema3A, Nrp1 and VEGFA protein expression n=5)A: Western blot results for Sema3A、Nrp1 and VEGFA. B, C, D;The relative protein expressions levels of Sema3A, Nrp1 and VEGF A. 1:Control;2:SSc model;3:Low dose;4:Medium dose;5:High dose;6:EGCG. △P<0.05，△△P<0.01 vs Control; *P<0.05, **P<0.01 vs SSc model

2.4 ELISA檢測血清Sema3A表達水平結(jié)果如Fig 6所示，與對照組相比，SSc模型組血清Sema3A水平明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，溫陽化濁通絡(luò)方低、中、高劑量組血清Sema3A水平均降低，差異具有顯著性(P<0.01)，EGCG組血清Sema3A水平顯著降低(P<0.01)。

Fig 6 Mouse serum levels of Sema3A determined 1:Control;2:SSc model;3:Low dose;4:Medium dose;5:High dose;6:EGCG.△△P<0.01 vs Control; *P<0.05,**P<0.01 vs SSc model

3 討論

信號素家族蛋白Sema3A及其受體Nrp1在免疫調(diào)節(jié)、細胞凋亡、細胞遷移和血管生成等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，以Sema3A/Nrp1為靶點的針對自身免疫性疾病的治療已成為當(dāng)今研究的熱點[8]。Sema3A是分泌性的糖蛋白，其發(fā)揮功能必須與受體Nrp1結(jié)合才能協(xié)同胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Nrp1在脊椎動物中結(jié)構(gòu)高度保守，其主要表達于動脈內(nèi)皮細胞，Nrp1的胞外段不同結(jié)構(gòu)域可分別與Sema3A或VEGFA結(jié)合介導(dǎo)信號傳導(dǎo)[9]。

Sema3A及其受體Nrp1相互作用通路的改變，參與了SSc患者血管系統(tǒng)的重塑。研究發(fā)現(xiàn)SSc患者血清Sema3A水平較正常人高表達，可能參與新生血管生成機制的調(diào)節(jié)導(dǎo)致SSc血管生成的紊亂[10]。同時，研究發(fā)現(xiàn)SSc患者血清和皮膚Nrp1的表達水平顯著降低，并且較低水平的循環(huán)Nrp1與NVC異常的嚴重程度和指(趾)端潰瘍的存在有關(guān)，而血管內(nèi)皮細胞沉默Nrp1基因及用SSc患者血清處理的血管內(nèi)皮細胞都能夠?qū)е卵苌墒軗p，結(jié)果表明Nrp1缺陷在SSc血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[11]。本研究通過建立SSc小鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型小鼠皮膚組織Sema3A蛋白上調(diào)表達，Nrp1蛋白下調(diào)表達，提示Sema3A/Nrp1信號軸可能參與了SSc疾病進程，這與上述研究結(jié)果相一致；給與溫陽化濁通絡(luò)方治療后，Sema3A蛋白下調(diào)表達，Nrp1蛋白上調(diào)表達，提示溫陽化濁通絡(luò)方可能通過調(diào)節(jié)Sema3A/ Nrp1改善SSc血管生成紊亂。然而也有研究顯示Sema3A在SSc患者血清中表達較正常人低，此外，血清Sema3A低表達水平與疾病持續(xù)時間及SCL-70抗體陽性負相關(guān)[12]。這與前述文獻結(jié)果不一致，Sema3A水平在SSc患者中差異表達，可能與分析的患者數(shù)量少或患者處于不同的疾病分期等原因有關(guān)，與本文結(jié)果不一致，可能是因為SSc小鼠模型與SSc患者之間的差異造成的，Sema3A在SSc中的表達及作用機制還需大量臨床病例數(shù)據(jù)及實驗去進一步證實。

VEGF是調(diào)節(jié)血管生成的一個重要因子，其通過參與血管新生及血管形成、維護血管正常狀態(tài)及完整性等生物過程在SSc進程中發(fā)揮作用[13]。研究表明,SSc患者真皮和表皮中VEGFA的表達水平顯著增加，不同疾病階段的血清中VEGF也顯著上調(diào)表達，但病史時間長的患者體內(nèi)血管數(shù)量卻是減少的，尤其是小血管的數(shù)目，高水平VEGFA的持續(xù)刺激可引起血管生成異常及炎癥反應(yīng)的發(fā)生[14]。而VEGFA需要通過與Sema3A受體Nrp1和酪氨酸激酶受體VEGFR-1、VEGFR-2結(jié)合才能夠發(fā)揮其生物學(xué)功能，但這兩者在SSc患者皮膚的內(nèi)皮細胞中均上調(diào)表達[15]。同時，Sema3A與VEGF165之間存在競爭性結(jié)合Nrp1，高濃度的Sema3A可競爭性結(jié)合Nrp1，在內(nèi)皮細胞中減少Nrp1與VEGF165的結(jié)合，從而抑制血管內(nèi)皮細胞的黏附，進而抑制血管增生[16]。本研究免疫組化及WB結(jié)果顯示，VEGFA在SSc模型小鼠皮膚組織及微血管內(nèi)上調(diào)表達，溫陽化濁通絡(luò)方治療后，VEGFA下調(diào)表達，提示溫陽化濁通絡(luò)方可能通過下調(diào)VEGFA的表達調(diào)節(jié)SSc血管生成異常。

綜上所述，VEGFA及Sema3A/Nrp1途徑的異常調(diào)節(jié)與SSc血管病變過程密切相關(guān)，溫陽化濁通絡(luò)方可通過下調(diào)Sema3A、VEGFA表達，上調(diào)Nrp1表達改善SSc血管病變。但血管生成調(diào)節(jié)過程異常復(fù)雜，溫陽化濁通絡(luò)方通過Sema3A/Nrp1調(diào)節(jié)SSc血管生成的詳細機制及其是否還通過調(diào)節(jié)其它信號通路發(fā)揮治療SSc的作用是本課題組有待深入研究的方向。