陳 明，莊星星，苗仁華，倪受東

（安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院，安徽 合肥 238000）

細辛為馬兜鈴科植物北細辛Asarum heterotropoidesFr. Schmidt var. Mandshuricum（Maxim.）Kitag.，漢城細辛Asarum sieboldiiMiq.var.seoulense或華細辛Asarum SieboldiiMiq. 的干燥根和根莖，首見于《神農本草經》，具有解表散寒止痛、通鼻竅、溫肺化飲功效［1］。細辛中化學成分豐富，其中木脂素類、黃酮類、甾體類、多糖類、揮發(fā)油（萜類、芳香族類、脂肪族類）等為其主要活性成分。現(xiàn)代藥理學研究表明，細辛除了鎮(zhèn)痛、抗炎、止咳、平喘等藥理學活性外，還有抗病原微生物、鎮(zhèn)靜、抗氧化等作用［2］。干姜為姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根莖，性熱、味辛，具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲功效。干姜中化學成分主要包括揮發(fā)油和姜酚類成分（姜酚和姜酮）兩大類［3］，具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、改善心血管功能等藥理學作用［4］。細辛和干姜均具有溫肺化飲功效，兩藥配伍多用于治療肺寒之諸喘證。細辛-干姜藥對臨床主治病癥多，其中以咳喘、痰飲、風寒感冒等呼吸系統(tǒng)疾病最多見［5-6］?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，細辛、干姜兩藥配伍可顯著降低寒飲蘊肺證模型鼠血清中炎性因子（腫瘤壞死因子- α 和白細胞介素8）水平，減輕氣道炎癥，改善肺功能，延緩慢性阻塞性肺疾病發(fā)展，其藥效優(yōu)于單味中藥［7］。網(wǎng)絡藥理學研究表明，細辛、干姜兩藥配伍具有協(xié)同作用及發(fā)揮作用的潛在靶點［8］。本課題組參考文獻［9 - 10］，根據(jù)傳統(tǒng)方劑最常見的細辛、干姜的1∶1（m/m）配伍比例［11］，利用信息熵賦權法結合正交試驗，以干姜中的重要活性成分6-姜酚和6-姜烯酚，細辛中的重要活性成分芝麻脂素和細辛脂素的含量，以及干浸膏得率為指標［12-13］，優(yōu)選該藥對的最佳水提取工藝?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260 Ⅱ型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），配有四元泵、二極管陣列檢測器、OpenLAB 工作站；BT25S 型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為十萬分之一）；KMD-500型調溫電熱套（金壇市鴻科儀器廠）；RE - 52 型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA1204B型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司，精度為萬分之一）；TGL16E 型高速離心機（長沙英泰儀器有限公司）；JK100B 型超聲波清洗器（合肥金尼克機械制造有限公司，功率為100 W，頻率為40 kHz）；DZF6020 型真空干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）。

1.2 試藥

細辛脂素對照品（批號為DC - 19080704，純度99.70%），芝麻脂素對照品（批號為DC - 19111607，純度99.75%），6 - 姜酚對照品（批號為DC - 19040810，純度99.69%），6 - 姜烯酚對照品（批號為DC -19061204，純度99.70%），均購自南京滴純生物科技有限公司，規(guī)格均為每支20 mg；甲醇（批號為20180302），乙腈（批號為20171210），均為色譜純，購自天津基準化學試劑有限公司；超純水（安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院藥劑科）；細辛中藥飲片（產地遼寧，批號為17840301），干姜中藥飲片（產地貴州，批號為1802038），購自亳州市華鑫中藥飲片科技有限公司，經安徽醫(yī)科大學附屬巢湖醫(yī)院倪受東主任中藥師鑒定均為正品。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Agilent EC-C18柱（150 mm×4.6 mm，4 μm）；流動相：甲醇（A）- 水（B），梯度洗脫（0～15 min 時25%A，15～30 min 時25%A～50%A，30～55 min 時50%A，55～56 min 時50%A～25%A，56～60 min 時25%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：205 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：40 μL。

2.1.2 溶液制備

稱取細辛、干姜藥材各12.0 g，參考文獻［14- 15］方法提取藥材，所得提取液減壓濃縮，定容至50.0 mL容量瓶中；精密吸取濃縮液10.0 mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣加75%甲醇溶解，0.22 μm 微孔濾膜濾過，轉移至10.0 mL 容量瓶中，超聲（功率為100 W，頻率為40 kHz）30 min，冷卻后定容，即得供試品溶液（編號為1 - 9 號）。取6 - 姜酚、芝麻脂素、細辛脂素和6 - 姜烯酚對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，分別制成質量濃度為1.0 mg/mL 的6-姜酚、芝麻脂素、細辛脂素和6-姜烯酚對照品溶液。精密吸取細辛脂素對照品溶液200 μL、芝麻脂素對照品溶液100 μL、6 - 姜酚對照品溶液200 μL 和6 - 姜烯酚對照品溶液200 μL，置同一100 mL 容量瓶中，加甲醇定容，制成細辛脂素、芝麻脂素、6-姜酚和6-姜烯酚質量濃度分別為2.00，1.00，2.00，2.00 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2.1.2項下供試品溶液和混合對照品溶液各適量，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，結果供試品溶液和混合對照品溶液中6- 姜酚、芝麻脂素、細辛脂素、6 - 姜烯酚分別在保留時間25.10，29.89，31.03，32.45 min 附近有色譜峰出現(xiàn)。供試品溶液色譜中有與混合對照品溶液色譜對應的色譜峰出現(xiàn)。色譜圖見圖1。

線性關系考察：取2.1.2 項下混合對照品溶液適量，加甲醇稀釋0，2，4，8，16，32 倍，制成系列混合對照品溶液，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，以質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、色譜峰峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表1。

表1 線性關系考察結果（n=6）Tab.1 Results of the linear ralation test（n=6）

1.6-姜酚 2. 芝麻脂素 3. 細辛脂素 4.6-姜烯酚A. 混合對照品溶液 B. 供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.6-Gingerol 2.Sesamin 3.Asarinin 4.6-Shogaol A.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

精密度試驗：取8 號供試品溶液，按2.1.1 項下色譜條件連續(xù)進樣測定6 次，記錄峰面積，并按外標法計算含量。結果6-姜酚、芝麻脂素、細辛脂素和6-姜烯酚含量的RSD分別為0.18%，0.39%，0.09%，0.27%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取細辛、干姜藥材各12.0 g，按2.1.2項下方法平行制備供試品溶液6 份，按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標法計算含量。結果6 - 姜酚、芝麻脂素、細辛脂素和6 - 姜烯酚含量的RSD分別為1.54%，1.86%，1.37%，1.93%（n=6），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：取8 號供試品溶液，分別于0，1，2，4，8，16，24 h 時按2.1.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并按外標法計算含量。結果6- 姜酚、芝麻脂素、細辛脂素和6 - 姜烯酚含量的RSD分別為1.54%，1.64%，1.37%，1.75%（n= 7），表明供試品溶液放置24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2 干浸膏得率測定

取正交試驗后的濃縮液（編號為1-9 號），分別精密量取1 - 9 號濃縮液各25 mL，置對應干燥至恒定質量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘箱中干燥3 h，至干燥器中冷卻，迅速精密稱定質量，計算干浸膏得率。

2.3 水提取工藝優(yōu)選

采用信息熵賦權法結合正交試驗優(yōu)選水提取工藝。以浸泡時間（因素A）、加水量（因素B）、提取時間（因素C）、提取次數(shù)（因素D）為考察因素，以6-姜酚、芝麻脂素、細辛脂素、6 - 姜烯酚含量及干浸膏得率為評價指標［14-15］。正交試驗因素與水平見表2，L9（34）正交試驗設計與結果見表3，方差分析結果見表4。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and levels

表3 L9（34）正交試驗設計與結果Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析結果Tab.4 Results of ANOVA

采用信息熵賦權法對6 - 姜酚、芝麻脂素、細辛脂素、6 - 姜烯酚含量及干浸膏得率進行處理與分析，計算各指標的權重系數(shù)，得到綜合評分計算公式。

可見，6 - 姜酚、芝麻脂素、細辛脂素、6 - 姜烯酚、干浸膏得率指標的權重系數(shù)分別為0.153 7，0.156 2，0.166 2，0.254 4，0.269 5。將概率矩陣數(shù)據(jù)進行加權處理，計算綜合評分（M），M=Xi6-姜酚含量/Xmax6-姜酚含量×0.153 7 +Xi芝麻脂素含量/Xmax芝麻脂素含量× 0.156 2 +Xi細辛脂素含量/Xmax細辛脂素含量× 0.166 2 +Xi6-姜烯酚含量/Xmax6-姜烯酚含量×0.254 4+Xi干浸膏得率/Xmax干浸膏得率×0.269 5。以此進行方差分析，以確定最優(yōu)試驗方案。結果見表3。

由極差分析結果可知，各因素對綜合指標的影響主次順序為D ＞C ＞A ＞B，即提取次數(shù)＞提取時間＞浸泡時間＞加水量。由方差分析結果可知，因素A、因素C、因素D 對提取結果有顯著影響，因素B 影響不顯著。綜合考慮，確定最優(yōu)提取工藝為A3B1C3D3，即加6 倍量水，浸泡1.0 h，提取3次，每次2.0 h。

2.4 驗證試驗

稱取細辛、干姜各12.0 g，按2.3 項下優(yōu)選的最佳水提取工藝進行驗證試驗。測定各指標，并計算綜合評分。由表5可知，該水提取工藝穩(wěn)定、可行。

表5 驗證試驗結果Tab.5 Results of the validation test

3 討論

多指標評價權重系數(shù)的確定是中藥提取工藝優(yōu)化過程中的關鍵，直接影響試驗結果。目前，研究者根據(jù)實際經驗主觀確定權重系數(shù)的主觀賦權法仍是主流，但缺乏科學依據(jù)。利用信息熵原理對評價指標進行客觀賦權，權重數(shù)據(jù)完全來自對試驗數(shù)據(jù)的數(shù)理分析，可清晰地反映指標成分在不同提取條件下變化的客觀規(guī)律，避免確定權重系數(shù)的主觀和局限。本研究中采用信息熵賦權法計算各評價指標的權重系數(shù)，所有數(shù)據(jù)均根據(jù)統(tǒng)計學、數(shù)學原理通過統(tǒng)一公式計算得到，減少了研究者主觀因素對結果的影響［18-19］，提高了試驗結果的科學性。確定6 - 姜酚、芝麻脂素、細辛脂素、6- 姜烯酚含量及干浸膏得率指標的權重系數(shù)分別為0.153 7，0.156 2，0.166 2，0.254 4，0.269 5，權重系數(shù)根據(jù)各考察指標在9組正交試驗中的變化差異而定，綜合考慮各指標對9組數(shù)據(jù)的貢獻率，試驗結果更加科學、可信。

分別參考2020年版《中國藥典（一部）》中細辛和干姜2 味中藥材含量測定中的色譜條件，但該色譜條件中的流動相和檢測波長在試驗條件下無法最大限度地將藥對中的成分進行分離，通過全波段掃描確定了于205 nm 波長下有最大紫外吸收；在對比不同流動相比例下目標成分的分離度后，最終確定了2.1.1項下的流動相梯度洗脫程序［20］。

綜上所述，信息熵賦權法結合正交試驗優(yōu)選出細辛- 干姜藥對的最佳水提取工藝為加6 倍量水，浸泡1.0 h，提取3 次，每次2.0 h，該工藝穩(wěn)定、可行，可為該藥對的后續(xù)研究提供試驗基礎。