黃柏文，朱宇敏，胡 珀，祝 穎，李 萍

（1. 江蘇省南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸科，江蘇 南京 210014； 2. 南通大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇 南通 226000）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）的主要特征為持續(xù)的呼吸道癥狀及不完全可逆的氣流受限［1］，其患病率隨年齡的增長(zhǎng)而升高［2］。西藥對(duì)癥治療COPD 起效較快，但停藥后易復(fù)發(fā)，且副作用大，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量。中醫(yī)辨證施治可提高患者的免疫力，改善肺通氣，并可輔助西藥治療，達(dá)到減毒增效目的［3-4］。平喘止咳方由桑葉、黃芩、百部等中藥組方，具有清肺平喘、止咳化痰功效。在常規(guī)西藥治療基礎(chǔ)上應(yīng)用平喘止咳方，可有效改善患者的膈肌功能，緩解呼吸肌疲勞，進(jìn)而提高COPD 的療效［5］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有多成分、多靶點(diǎn)及多通路的特點(diǎn)，與中醫(yī)藥整體觀(guān)、辨證論治的原則相符［6］。本研究中基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)分析并預(yù)測(cè)平喘止咳方治療COPD 的活性成分、作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路，探討藥物與機(jī)體的相互作用，揭示其潛在作用機(jī)制，為平喘止咳方的臨床研究提供理論基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 資料

本研究中所用數(shù)據(jù)庫(kù)信息見(jiàn)表1。

表1 數(shù)據(jù)庫(kù)信息Tab.1 Information of databases

1.2 方法

平喘止咳方的相關(guān)成分及靶點(diǎn)獲?。和ㄟ^(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，以口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18［7］為篩選條件，檢索平喘止咳方中桑葉、黃芩、百部、北沙參、陳皮、紫菀、款冬花、麻黃、桔梗、半夏、苦杏仁、木香、甘草的活性成分及作用靶點(diǎn)，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)作用靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

COPD 靶點(diǎn)篩選：以“Chronic obstructive pulmonary disease”為關(guān)鍵詞，在GeneCards，OMIM，DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索COPD 的潛在靶點(diǎn)，合并各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)，并刪除重復(fù)項(xiàng)，即得疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

平喘止咳方治療COPD 靶點(diǎn)篩選：將上述COPD靶點(diǎn)及平喘止咳方靶點(diǎn)導(dǎo)入Venn 2.0.2數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行匹配映射，獲取平喘止咳方和COPD 的共有靶點(diǎn)，即平喘止咳方治療COPD的靶點(diǎn)。

活性成分- 共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：將上述平喘止咳方的活性成分與共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件中，構(gòu)建平喘止咳方活性成分-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，最后通過(guò)度值篩選核心成分。度值越大，該成分在治療COPD過(guò)程中越關(guān)鍵。

治療COPD 核心靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析：將平喘止咳方活性成分與COPD 的共有靶點(diǎn)輸入String 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為“智人”種，最小交互分值設(shè)為0.7，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI），再將結(jié)果以“TSV”格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，度值排名靠前的共有靶點(diǎn)即為核心靶點(diǎn)［8］。

共有靶點(diǎn)GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析：將平喘止咳方活性成分與COPD 的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為“智人”種，選擇GO 功能富集分析項(xiàng)下的生物過(guò)程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）三部分及KEGG 通路部分進(jìn)行富集分析。設(shè)定P＜0.05為富集分析結(jié)果顯著，采用R 語(yǔ)言選擇排序靠前的結(jié)果作圖分析。

分子對(duì)接驗(yàn)證：采用Autodock Vina 軟件對(duì)核心成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，借助Pymol 軟件作圖。以最低結(jié)合能評(píng)價(jià)結(jié)合分子對(duì)接的好壞，結(jié)合能越低，表明對(duì)接結(jié)果越好。本研究中以結(jié)合能≤-5 kJ/mol 為相互作用較好［9］。

2 結(jié)果

2.1 平喘止咳方的活性成分靶點(diǎn)

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中，共篩選OB ≥30%和DL ≥0.18的活性成分253個(gè)，其中甘草92個(gè)，黃芩36個(gè)，桔梗7 個(gè)，苦杏仁19 個(gè)，款冬花22 個(gè)，麻黃23 個(gè)，木香6 個(gè)，桑葉29 個(gè)，紫菀19 個(gè)，刪除重復(fù)項(xiàng)后得到216 個(gè)活性成分。得到相關(guān)成分靶點(diǎn)5 895 個(gè)，借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行校正，刪除重復(fù)項(xiàng)后得到286個(gè)活性成分靶點(diǎn)。

2.2 平喘止咳方治療COPD 的靶點(diǎn)

從GeneCards，OMIM，DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中分別得到COPD靶點(diǎn)478個(gè)、147個(gè)、23個(gè)，刪除重復(fù)項(xiàng)后得到586個(gè)COPD靶點(diǎn)。與2.1項(xiàng)下活性成分靶點(diǎn)取交集，得到89個(gè)共有靶點(diǎn)，即為平喘止咳方治療COPD 的靶點(diǎn)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 平喘止咳方活性成分靶點(diǎn)與COPD靶點(diǎn)的維恩圖Fig.1 Venn diagram of the targets of active components in Pingchuan Zhike Decoction and targets of COPD

2.3 平喘止咳方的活性成分-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將得到的216 個(gè)活性成分與89 個(gè)共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，構(gòu)建平喘止咳方活性成分- 共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，詳見(jiàn)圖2。網(wǎng)絡(luò)中有284 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 039 條邊。根據(jù)度值篩選得到槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-胡蘿卜素、漢黃芩素、黃芩素等核心成分。

圖2 平喘止咳方活性成分-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of active components - common targets

2.4 治療COPD 核心靶點(diǎn)的PPI

將平喘止咳方與COPD 的共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得PPI，詳見(jiàn)圖3。并采用Cytoscape 3.8.0 軟件進(jìn)行分析，根據(jù)度值進(jìn)行篩選，得到絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、水孔蛋白5（AQP5）、解整合素金屬蛋白酶8（ADAM8）、黏蛋白5AC（MUC5AC）等核心靶點(diǎn)。

圖3 治療COPD核心靶點(diǎn)的PPIFig.3 PPI of core targets in the treatment of COPD

2.5 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析

GO 功能富集分析結(jié)果顯示，得到生物過(guò)程2 132條，主要涉及對(duì)脂多糖、對(duì)細(xì)菌來(lái)源分子的反應(yīng)，以及細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等；得到細(xì)胞組成84條，包括膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等；得到分子功能143 條，包括內(nèi)肽酶活性、蛋白磷酸酶結(jié)合、絲氨酸型肽酶活性等。根據(jù)P值分別選取GO 功能富集分析條目排名前10 的結(jié)果繪制條形圖，詳見(jiàn)圖4。KEGG 通路富集分析得到155 條信號(hào)通路，主要涉及磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/AKT、腫瘤壞死因子（TNF）、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、白細(xì)胞介素17（IL-17）、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）等，根據(jù)P值選取排名前20的結(jié)果繪制氣泡圖，詳見(jiàn)圖5。

圖4 GO功能富集分析條形圖Fig.4 Bar chart of GO function enrichment analysis

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

采用Autoduck Vina 軟件進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果核心成分和核心靶點(diǎn)對(duì)接能量全部＜-5 kJ/mol，對(duì)接結(jié)果良好，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性（圖6 A）。對(duì)接結(jié)果顯示，STAT3 和quercetin、AQP5 和kaempferol 的對(duì)接能量最小，其結(jié)合模式見(jiàn)圖6 B和圖6 C。

3 討論

COPD 屬中醫(yī)“肺脹”“喘證”范疇，本虛標(biāo)實(shí)是其主要病理機(jī)制，以肺、腎、心、脾臟氣虧虛為本，痰濁、水飲、血瘀互結(jié)為標(biāo)，治宜扶正與祛邪兼顧［10］。平喘止咳方由桑葉、黃芩、百部等中藥組方，具有化痰、理氣、通氣功效。臨床研究表明，該方治療COPD 急性加重期92例，有效率為93.48%，可提高COPD 患者的肺功能及血?dú)庵笜?biāo)水平［5］。但中藥成分的復(fù)雜性，其治療COPD 的分子機(jī)制尚不明確。

本研究中通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)平喘止咳方治療COPD 的作用機(jī)制進(jìn)行了較全面地分析?；钚猿煞?共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，槲皮素、山柰酚、木犀草素等為核心成分。魏萍等［11］研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF - β1）、α - 平滑肌肌動(dòng)蛋白（α - SMA）、TNF-α 等的表達(dá)水平，緩解大鼠的肺組織炎癥和纖維化損傷。山柰酚可降低炎性因子TNF - α 等的表達(dá)水平，減少炎性細(xì)胞聚集，抑制炎性反應(yīng)［12］。木犀草素具有抗纖維化、抑制炎性反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫等作用，可顯著降低COPD 患者體內(nèi)血清TNF-α 水平，使肺功能指標(biāo)如最大通氣量、呼氣峰流速等得到明顯改善［13］。

A. 核心成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接熱圖 B.STAT3和quercetin對(duì)接模式圖 C.AQP5和kaempferol對(duì)接模式圖圖6 分子對(duì)接圖A.Heat map of molecular docking of core components and core targets B.Docking mode diagram of STAT3 and quercetin C.Docking mode diagram of AQP5 and kaempferolFig.6 Diagrams of molecular docking

PPI 及KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)，AKT1，IL - 6，STAT3，AQP5，ADAM8，MUC5AC為核心靶點(diǎn)，主要調(diào)控PI3K/AKT，TNF，MAPK，IL - 17，HIF - 1 等信號(hào)通路，從而發(fā)揮治療COPD 的作用。AKT 可由活化的PI3K 募集而活化，進(jìn)而廣泛參與細(xì)胞自噬、增殖、凋亡等生物調(diào)控［14］。通過(guò)下調(diào)PI3K 和AKT1 基因表達(dá)、上調(diào)mTOR基因表達(dá)，減輕COPD 模型大鼠肺組織炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)及纖維組織增生，從而緩解肺組織損傷，起到抗COPD的 作 用［15］。PI3K/ AKT/ 哺 乳 動(dòng) 物 雷 帕 素 靶 蛋 白（mTOR）通路為細(xì)胞內(nèi)的基本信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，上調(diào)PI3K/ AKT/ mTOR 的表達(dá)可使呼吸道平滑肌細(xì)胞增殖、遷移及黏附，并使細(xì)胞外基質(zhì)成分積累，導(dǎo)致氣道壁增厚而發(fā)生COPD［16］。MAPK是細(xì)胞中的一組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要包括胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun 氨基端蛋白激酶（JNK）、p38。當(dāng)JNK 及p38 被激活時(shí)，可修復(fù)氣道上皮細(xì)胞及促進(jìn)黏蛋白MUC5AC 的表達(dá)［17］。STAT為JAK激酶（JAK）的下游基因，共同組成的JAK/ STAT 信號(hào)通路在細(xì)胞增殖及凋亡中至關(guān)重要。通過(guò)促進(jìn)JAK，STAT3 等磷酸化，進(jìn)而上調(diào)JAK/STAT 的表達(dá)，可引發(fā)炎性反應(yīng)，促進(jìn)COPD 肺血管重塑［18］。輔助性T 細(xì)胞17（Th17）及其特異性細(xì)胞因子參與介導(dǎo)COPD產(chǎn)生及進(jìn)展過(guò)程中的多個(gè)環(huán)節(jié)，尤以IL-6，IL-17A，TNF-α 等對(duì)肺局部的炎癥、自噬、纖維化等發(fā)揮重要作用，因IL - 6，IL - 17A，TNF - α 等各類(lèi)特異性細(xì)胞因子的異常高表達(dá)而推進(jìn)了COPD 的進(jìn)程［19］。HIF-1α 可上調(diào)一氧化氮合酶基因，參與肺血管的重塑，進(jìn)一步參與COPD 的發(fā)生與發(fā)展［20］。本研究結(jié)果表明，平喘止咳方可能通過(guò)槲皮素、山柰酚、木犀草素等主要活性成分作用于AKT1，IL- 6，STAT3 等相關(guān)靶點(diǎn)，從而調(diào)控PI3K/AKT，TNF，MAPK 等信號(hào)通路而發(fā)揮治療COPD的作用。

綜上所述，本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)初步揭示了平喘止咳方通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療COPD 的分子機(jī)制。但因數(shù)據(jù)庫(kù)更新不及時(shí)、收錄不全等原因，僅單純通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)及網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)，無(wú)法完全評(píng)價(jià)平喘止咳方在體內(nèi)的具體代謝過(guò)程，需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。