張來(lái)榮，萬(wàn)金娟，劉天驥，劉 匆，顧夕章，孟祥龍，唐建清*，孫龍生*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇南京 210000；3.新希望六和股份有限公司，四川成都 610011）

生物發(fā)酵飼料是使用農(nóng)業(yè)部飼料原料目錄和飼料添加劑品種目錄等國(guó)家相關(guān)法規(guī)允許使用的飼料原料和添加劑，通過(guò)生物發(fā)酵工程技術(shù)開(kāi)發(fā)的飼料產(chǎn)品（鄧雪娟等，2019）。飼料發(fā)酵過(guò)程中，飼料中的大分子蛋白被降解為動(dòng)物可直接消化吸收的小分子物質(zhì)，同時(shí)，飼料中微生物增殖代謝會(huì)產(chǎn)生菌體蛋白，使發(fā)酵飼料中的蛋白質(zhì)含量增加，而發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸會(huì)使發(fā)酵飼料具有酸香味，從而提高飼料誘食性和適口性。

有研究報(bào)道，飼料中添加乳酸菌可促進(jìn)克氏原螯蝦生長(zhǎng)（田立立等，2021）；飼料中添加解淀粉芽孢桿菌A23 可以提高克氏原螯蝦腸道消化酶活性和血清非特異性免疫相關(guān)酶活性（Xu 等，2021）；飼料中添加釀酒酵母YFI-SC2 對(duì)克氏原螯蝦的生長(zhǎng)性能和免疫應(yīng)答均有積極影響（Xu等，2021）。但在全價(jià)飼料中添加復(fù)合微生物菌劑經(jīng)發(fā)酵制成生物發(fā)酵飼料，對(duì)克氏原螯蝦的影響相關(guān)報(bào)道較少，其作用機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

本研究選擇市售克氏原螯蝦顆粒配合飼料并經(jīng)發(fā)酵處理制成兩組生物發(fā)酵飼料，通過(guò)60 d 的養(yǎng)殖試驗(yàn)，測(cè)定克氏原螯蝦的生長(zhǎng)性能、肌肉常規(guī)養(yǎng)分、肌肉氨基酸組成及腸道消化酶活性指標(biāo)，以期為生物發(fā)酵飼料在克氏原螯蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 生物發(fā)酵飼料的制作 本試驗(yàn)以市售克氏原螯蝦商品料為對(duì)照組飼料（Ⅰ組）；將微生物菌劑按1‰添加到對(duì)照組飼料中，先按微生物菌劑：葡萄糖：水=1 ：1 ：257 的比例（發(fā)酵料理論含水量為30%）活化菌種，攪拌均勻后封口，在37℃下靜置活化16 h，使用前充分搖勻，再加入到對(duì)照組飼料中混合均勻，裝發(fā)酵袋密封，30℃發(fā)酵5 d 制成生物發(fā)酵飼料（Ⅱ組）；將微生物菌劑和發(fā)酵增效劑按1 ：1 配套使用，按1‰添加，具體步驟同Ⅱ組，制成生物發(fā)酵飼料（Ⅲ組）；待飼料發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵袋抽真空，于-20℃冰箱保存。其中，對(duì)照組飼料由荊州新希望飼料有限公司提供，發(fā)酵所用微生物菌劑（芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌組合物）和發(fā)酵增效劑由國(guó)家生物工程中心提供。對(duì)照組飼料基礎(chǔ)配方（干物質(zhì)基礎(chǔ)）和各試驗(yàn)組飼料主要營(yíng)養(yǎng)參數(shù)（干物質(zhì)基礎(chǔ)）見(jiàn)表1 和表2。

表1 基礎(chǔ)飼料配方（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

表2 試驗(yàn)飼料營(yíng)養(yǎng)參數(shù)（干物質(zhì)基礎(chǔ)，%）

1.2 試驗(yàn)分組與飼養(yǎng)管理 養(yǎng)殖試驗(yàn)在江蘇省淡水水產(chǎn)研究所揚(yáng)中基地開(kāi)展，幼蝦取自揚(yáng)中基地同一塘口。試驗(yàn)蝦先暫養(yǎng)7 d，隨后挑選體質(zhì)健康、附肢完整的幼蝦360 只，隨機(jī)分為3 組（Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組），每組4 個(gè)重復(fù)，放入12 個(gè)室外水泥池（2 m×2 m×0.8 m，水深0.5 m）內(nèi)進(jìn)行養(yǎng)殖。試驗(yàn)每天于7 ：30 和18 ：30 定量投喂（投喂比例3 ：7），日投飼量為蝦體重的3% ～5%，根據(jù)攝食情況和天氣情況作調(diào)整，試驗(yàn)用水為過(guò)濾池塘水，試驗(yàn)期間水質(zhì)參數(shù)為pH 7.8 ～8.5，溶解氧＞7 mg/L，氨氮＜0.04 mg/L，亞硝酸鹽＜0.01 mg/L，正式養(yǎng)殖試驗(yàn)時(shí)間為60 d。

1.3 樣品采集與處理 試驗(yàn)結(jié)束后禁食24 h，每個(gè)重復(fù)分別進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重，以計(jì)算存活率、增重率和特定生長(zhǎng)率。每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取3 只雌蝦，在無(wú)菌操作下先抽離出蝦的全腸，后立即剝離出蝦肌肉，分別用于消化酶活性、肌肉體組成及氨基酸組成分析。

1.4 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo) 分別計(jì)算增重率（WGR）、特定生長(zhǎng)率（SGR）、成活率（SR）、蛋白質(zhì)效率比（PER），具體公式如下。

式中，Wt為終末體質(zhì)量，g ；W0為初始體質(zhì)量，g ；t 為試驗(yàn)天數(shù)，d ；Nt為終末尾數(shù)；N0為初始尾數(shù)；Wf為飼料攝入量，g ；Wp為飼料蛋白質(zhì)含量，%。

1.4.2 肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量測(cè)定 肌肉中蛋白質(zhì)含量依據(jù)GB 5009.5-2016 凱氏定氮法，脂肪含量依據(jù)GB 5009.6-2016 中索氏抽提法，灰分含量依據(jù)GB 5009.4-2016 中550℃馬弗爐灼燒法，水分含量依據(jù)GB 5009.3-2010 中恒重法。

1.4.3 肌肉氨基酸組成及含量的測(cè)定 參照GB 5009.124-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測(cè)定》中的方法，使用LA8080 超高速全自動(dòng)氨基酸分析儀（日本HITACHI 公司）測(cè)定肌肉中氨基酸含量。

1.4.4 酶活測(cè)定 腸道消化酶測(cè)定指標(biāo)為胰蛋白酶、脂肪酶和α- 淀粉酶。以上指標(biāo)均采用南京建成生物研究所生產(chǎn)的試劑盒測(cè)定，具體測(cè)定方法參照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016 軟件進(jìn)行整理，并應(yīng)用SPSS Statistics 23.0 軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（One-WayANOVA），采用Duncan 法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P ＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能的影響 由表3 可知，生物發(fā)酵飼料組的蝦增重率和特定生長(zhǎng)率均高于Ⅰ組，但差異不顯著（P ＞0.05），各組間的終末體質(zhì)量、成活率及蛋白質(zhì)效率無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。

表3 不同飼料對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)性能的影響

2.2 生物發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦肌肉常規(guī)養(yǎng)分的影響 由表4 可知，Ⅱ組蝦肌肉中蛋白質(zhì)含量高于Ⅰ組，Ⅲ組低于Ⅰ組，但均無(wú)顯著差異（P ＞0.05）；Ⅲ組蝦肌肉中蛋白質(zhì)含量較Ⅱ組顯著降低6.0%（P ＜0.05），水分含量較Ⅰ組顯著提高1.6%（P ＜0.05）；各試驗(yàn)組肌肉中脂肪含量和灰分含量無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。

表4 不同飼料對(duì)克氏原螯蝦肌肉常規(guī)養(yǎng)分的影響（濕重基礎(chǔ)） g/100g

2.3 生物發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦肌肉氨基酸組成及含量的影響 由表5 可知，Ⅱ組的總氨基酸、總必需氨基酸、甜味氨基酸和鮮味氨基酸的含量均高于Ⅰ組，Ⅲ組均低于Ⅰ組，但無(wú)顯著差異（P＞0.05）；甘氨酸含量Ⅲ組較Ⅰ組和Ⅱ組顯著降低5.6%（P ＜0.05），其余氨基酸含量各組間均無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。

表5 不同飼料對(duì)克氏原螯蝦肌肉氨基酸組成及含量的影響（濕重基礎(chǔ)） g/100g

2.4 生物發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦腸道消化酶活性的影響 由表6 可知，兩組生物發(fā)酵飼料組蝦腸道脂肪酶活性較Ⅰ組分別顯著提高56.6%、84.2%（P ＜0.05）；胰蛋白酶活性Ⅱ組最高，Ⅲ組較Ⅰ組和Ⅱ組分別顯著降低33.0%、36.8%（P＜0.05）；α- 淀粉酶活性各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表6 不同飼料對(duì)克氏原螯蝦腸道消化酶活性的影響

3 討論

3.1 生物發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦生長(zhǎng)、肌肉組成及腸道消化酶活性的影響 飼料通過(guò)微生物發(fā)酵后可以改善飼料的適口性和誘食性，提高飼料利用率，促進(jìn)魚、蝦對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收（蔡興旺等，2003）。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，生物發(fā)酵飼料組克氏原螯蝦的增重率和特定生長(zhǎng)率均高于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異，表明生物發(fā)酵飼料可在一定程度上促進(jìn)克氏原螯蝦的生長(zhǎng)。Miao 等（2020）、Cortés等（2015）分別報(bào)道了克氏原螯蝦生長(zhǎng)的最適蛋白質(zhì)需求量為31%，而本試驗(yàn)3 組飼料實(shí)測(cè)蛋白質(zhì)含量均高于最適需求量，且生物發(fā)酵飼料組蛋白質(zhì)效率均略低于對(duì)照組，因此可能致使3 組試驗(yàn)蝦生長(zhǎng)性能上差異不顯著。

水產(chǎn)動(dòng)物的肌肉常規(guī)養(yǎng)分含量可以體現(xiàn)水產(chǎn)動(dòng)物將飼料營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化為自身營(yíng)養(yǎng)的情況，同時(shí)會(huì)造成水產(chǎn)品質(zhì)量上的差異。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，生物發(fā)酵飼料Ⅱ組蝦肌肉中蛋白質(zhì)含量略高于對(duì)照組，表明生物發(fā)酵飼料可能促進(jìn)了蝦的蛋白質(zhì)合成和營(yíng)養(yǎng)利用，從而在一定程度上提高了蝦肌肉中的蛋白質(zhì)含量。周興華（2015）報(bào)道，發(fā)酵豆粕添加比例過(guò)高會(huì)降低鯽魚肌肉粗蛋白質(zhì)比例、提高肌肉水分比例，本試驗(yàn)結(jié)果與其部分相似。有研究表明，飼料中蛋白質(zhì)含量的適量增加可以提高克氏原螯蝦肌肉中粗蛋白質(zhì)含量（夏思瑤等，2021）。微生物在代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些菌體蛋白，使生物發(fā)酵飼料在發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量高于對(duì)照組飼料，從而導(dǎo)致發(fā)酵飼料Ⅱ組蝦肌肉中蛋白質(zhì)含量高于對(duì)照組；而克氏原螯蝦腸道胰蛋白酶活性的下降會(huì)造成蝦消化吸收能力的下降，減少蛋白質(zhì)在肌肉中的沉積，從而致使兩發(fā)酵飼料組間蝦肌肉中蛋白質(zhì)含量存在顯著差異。

氨基酸的含量和組成是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的重要指標(biāo)之一（王繼隆，2019），對(duì)組成蛋白質(zhì)的氨基酸總量和必需氨基酸含量進(jìn)行分析，可以綜合評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)水平。氨基酸檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，生物發(fā)酵飼料Ⅱ組蝦肌肉中總氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸、甜味氨基酸和鮮味氨基酸含量有所提高；表明生物發(fā)酵飼料能提高克氏原螯蝦肌肉中氨基酸含量，但差異不顯著，且不同生物發(fā)酵飼料對(duì)蝦肌肉中氨基酸含量的影響不同。究其原因，兩組發(fā)酵飼料組間蝦肌肉中蛋白質(zhì)含量存在顯著差異，進(jìn)而導(dǎo)致兩發(fā)酵飼料組蝦肌肉中氨基酸含量存在差異。

消化功能的改善可以促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)（Hamza 等，2016），而消化酶在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化功能中發(fā)揮重要作用，其活性直接反映了水生動(dòng)物的消化能力、營(yíng)養(yǎng)狀況和生長(zhǎng)性能（URNE 等，2005）。因此，我們進(jìn)一步研究了生物發(fā)酵飼料對(duì)克氏原螯蝦全腸消化酶活性的影響。本試驗(yàn)消化酶活性測(cè)定結(jié)果顯示，兩組生物發(fā)酵飼料均可顯著提高克氏原螯蝦的腸道脂肪酶活力，但對(duì)腸道α- 淀粉酶的影響不大，生物發(fā)酵飼料Ⅱ組蝦腸道胰蛋白酶活性較對(duì)照組有一定提高。生物發(fā)酵飼料中富含的益生菌在自身代謝過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生部分酶類（Yang 等，2016），益生菌以飼料為載體進(jìn)入蝦腸道內(nèi)，不僅可以補(bǔ)充蝦腸道的內(nèi)源性酶類，而且可以提高腸道脂肪酶和胰蛋白酶活性，從而促進(jìn)腸道內(nèi)脂肪酸和氨基酸的消化吸收。但隨著腸道消化速度的加快，當(dāng)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)需求滿足后，機(jī)體會(huì)通過(guò)神經(jīng)調(diào)節(jié)減少腸道內(nèi)消化酶的合成（孫波等，2016）；同時(shí)，益生菌代謝過(guò)程中也會(huì)產(chǎn)生有機(jī)酸，有機(jī)酸的過(guò)量累積會(huì)提升生物發(fā)酵飼料的酸度，進(jìn)而導(dǎo)致蝦腸道內(nèi)酸度升高，胰蛋白酶活性降低，使克氏原螯蝦腸道消化能力下降，從而導(dǎo)致兩生物發(fā)酵飼料組間蝦胰蛋白酶活性存在差異。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，與未發(fā)酵顆粒飼料相對(duì)比，投喂經(jīng)生物發(fā)酵飼料可以提高克氏原螯蝦腸道中脂肪酶活性，促進(jìn)蝦的生長(zhǎng)，未明顯改變蝦肌肉中蛋白質(zhì)、氨基酸的組成和含量。