張曉靜，董啟迪，王霞，張曉娜，周建，3

（1.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.長垣市林業(yè)局，河南 長垣 453400；3.河南省園藝植物資源利用與種質(zhì)創(chuàng)新工程研究中心，河南 新鄉(xiāng) 453003）

胰蛋白酶抑制劑（trypsin inhibitor，TI），即抗胰蛋白酶因子（antitrypsin），屬于蛋白酶抑制劑四大分類中的絲氨酸蛋白酶抑制劑［1］。TI在動植物及微生物中均有發(fā)現(xiàn)，最早提取于牛胰腺［2］，后來又在大豆中分離出Kunitz型胰蛋白酶抑制劑（Kunitz trypsin inhibitor，KTI）［3］。對植物TI的研究主要集中于豆科，但在茄科、禾本科以及十字花科中也有發(fā)現(xiàn)［4，5］。

目前，對KTI的研究較為深入［6－8］，分子量在21 kDa左右，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑，在植物抗性研究中的作用極其重要，主要涉及對生物逆境與非生物逆境的響應(yīng)，如鹽脅迫、抗蟲能力等［9］。高越峰等［10］得到的轉(zhuǎn)基因（大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因，SKTI）煙草植株具有明顯的抗棉鈴蟲能力。謝可方等［11］發(fā)現(xiàn)大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因（SBTi－A2）對棉鈴蟲幼蟲生長有一定的抑制作用；大豆根系的胰蛋白酶抑制劑（STI）能阻礙大豆胞囊線蟲的發(fā)育［12］。Srinivasan等［13］克隆了煙草胰蛋白酶抑制劑基因（NtPI），發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草相比野生型煙草對NaCl的耐受性更強；在pH值為4～8之間可正常生長；對斜紋夜蛾和棉鈴蟲有一定的抗性，表明煙草NtPI基因具有多重抗脅迫性。向緬［14］將克隆得到的決明Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因2（COTI2）轉(zhuǎn)入擬南芥并進行鹽脅迫及干旱脅迫處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥抗鹽及抗旱能力均優(yōu)于野生型。

TI的作用廣泛，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以極大地提高轉(zhuǎn)基因植株對逆境脅迫的抗性響應(yīng)。但目前在刺槐中的研究并不多，尤其是有關(guān)非生物逆境脅迫響應(yīng)的相關(guān)研究報道較少。

刺槐為豆科刺槐屬落葉喬木，是重要的生態(tài)保護木本植物，有很強的抗旱、耐瘠薄、耐鹽堿、耐鉛鎘能力，對土壤改良有重要意義［15，16］。由于其根蘗及枝條萌發(fā)能力強，因此多與其他樹種組成混交林用于保土固沙，成為防護造林、生態(tài)修復(fù)必不可少的物種之一。我國土壤質(zhì)量差，污染問題越來越嚴峻，尤其是重金屬污染，嚴重危害人類健康［17］。因此，對重金屬污染的修復(fù)極其重要。本試驗在鉛鎘脅迫下提取并克隆得到刺槐Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因（RpKTI），并對其進行生物信息學(xué)分析及表達分析，為后期RpKTI基因的功能驗證、應(yīng)用及其種質(zhì)資源創(chuàng)新等方面的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用植物材料為刺槐（Robinia pseudoacacia L.）；大腸桿菌（Escherichia coli））感受態(tài)細胞DH5α；載體為pMD18－T（Takara）。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取 采用改良CTAB法［18］提取刺槐葉片的總RNA，利用NanoDrop 2000C分光光度計檢測濃度，并采用PrimeScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 刺槐KTI基因的克隆 刺槐KTI基因的克隆采用SMARTer RACE 5′／3′Kit（Takara，Code No.634858）試劑盒進行。核心目的片段由本課題組前期對刺槐的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析獲得。根據(jù)核心片段分別設(shè)計內(nèi)外引物（表1）進行3′端和5′端的擴增，擴增體系如表2。按照試劑盒說明書合成RACE Ready cDNA作為第一輪擴增模板，擴增引物為外引物，第二輪擴增體系的模板為稀釋后的第一輪擴增體系產(chǎn)物，擴增引物為內(nèi)引物。擴增程序均為95℃1 min；95℃30 s，55℃30 s，68℃30 s，35個循環(huán)；68℃3 min。將獲得的PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目的條帶切膠回收純化后連接到載體pMD18－T，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，挑取單菌落搖菌后進行PCR檢測，選擇陽性克隆菌落送至上海生工生物工程股份有限公司測序。將3′端和5′端擴增序列片段通過DNAMAN 6.0進行拼接，設(shè)計CDS區(qū)擴增引物，并克隆全長，擴增體系如表3，擴增程序同上。

表1 刺槐KTI基因克隆的引物序列

表2 3′／5′－RACE PCR擴增體系

表3 刺槐KTI基因全長PCR擴增體系

1.2.3 刺槐KTI基因的生物信息學(xué)分析 利用ORF finder分析RpKTI基因的開放閱讀框；Prot-Param及ProtScale在線程序?qū)ζ浠纠砘再|(zhì)及親／疏水性進行預(yù)測；通過TMHMM 2.0（Tiedmixture Hidden Markov Models）分析RpKTI基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域；SignalP－4.1分析其信號肽位點；在線工具NetPhos 3.1及NetNGlyc 1.0分析RpKTI基因編碼蛋白的磷酸化及糖基化位點；SOPMA在線分析預(yù)測該蛋白的二級結(jié)構(gòu)；建模軟件SWISS－MODEL對RpKTI基因編碼蛋白的氨基酸序列同源建模得到蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型；通過NCBI Conserved Domain Search分析RpKTI基因的保守結(jié)構(gòu)域；利用DNAMAN 6.0及MEGAX軟件分析刺槐及其他豆科植物的KTI基因編碼蛋白的同源性，從而構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（表4）。

表4 生物信息學(xué)分析工具及其網(wǎng)址

1.2.4 刺槐KTI基因的組織表達分析 將刺槐幼苗于鉛（2 000 mg／kg）、鎘（80 mg／kg）脅迫下分別處理3 d及45 d，以不作處理的植株為空白對照（0 d）。取刺槐幼苗葉片迅速放入－80℃液氮中凍存，并進行RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試驗。

根據(jù)KTI基因的全長序列，以刺槐Actin基因為內(nèi)參，使用NCBI中的Primer designing tool設(shè)計實時熒光定量PCR（qRT－PCR）引物（F：5′－TTTCCCAAGAGAATGGGTGGG－3′，R：5′－GGTGGAGCAGTGATTGTGGG－3′），擴增大小為135 bp。擴增體系（10μL）：TB Green Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）5μL，引物各0.5μL，cDNA 0.5μL，ddH2O 3.5μL。擴增程序為：95℃30 s；95℃5 s，50℃30 s，共40個循環(huán)；95℃5 s，65℃5 s，95℃5 s。采用2－ΔΔCt算法計算KTI基因的表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 刺槐KTI基因全長的克隆及ORF預(yù)測

通過對刺槐KTI基因3′端和5′端進行PCR擴增，得到3′端序列長度約500 bp，5′端序列長度約為400 bp（圖1a）。測序結(jié)果顯示KTI基因長度為633 bp（圖1b），經(jīng)過拼接得到刺槐KTI基因序列全長為745 bp（圖2），將此基因命名為RpKTI。通過開放閱讀框ORF預(yù)測（圖3），RpKTI基因共編碼210個氨基酸，起始密碼子為ATG，該序列的最后一個密碼子為GTT，終止密碼子為TGA。編碼區(qū)兩側(cè)為11 bp（735～745 bp）的5′端非翻譯區(qū)和101 bp（1～101 bp）的3′段非翻譯區(qū)。

圖1 刺槐KTI基因的PCR擴增

圖2 刺槐KTI基因拼接序列全長

圖3 刺槐KTI基因的開放閱讀框（a）及氨基酸序列（b）分析

2.2 RpKTI基因的基本理化性質(zhì)

RpKTI基因共編碼210個氨基酸，其中含有不帶電荷的極性親水氨基酸（Y、S、T、C、N、Q）50個，占比23.8%；非極性疏水氨基酸（A、G、V、L、I、P、F、M、W）119個，占比56.7%；酸性氨基酸（D、E）25個，占比11.9%；堿性氨基酸（K、H、R）16個，占比7.6%。甘氨酸（Gly）數(shù)量最多，占全部氨基酸的11.4%（表5）。理論等電點PI為4.51，相對分子質(zhì)量為22 763.87 Da，原子總數(shù)3 195，分子式為C1039H1586N258O307S5。不穩(wěn)定系數(shù)（instability index）為38.81（<40），脂肪系數(shù)為89.05，總平均親水性（GRAVY）值為0.072。因此，預(yù)測此蛋白是一個穩(wěn)定的酸性疏水蛋白。

表5 RpKTI基因編碼蛋白的氨基酸組成

2.3 RpKTI基因編碼蛋白的親／疏水性預(yù)測

通過在線ProtScale工具對RpKTI基因編碼蛋白的親／疏水性進行預(yù)測。由圖4可知，在氨基酸序列的第12位亮氨酸（Leu）具有最大值2.8，疏水性最強，肽鏈的第182位谷氨酸（Glu）具有最小值－3.2，親水性最強。整體看疏水氨基酸與親水氨基酸分布較為均勻。結(jié)合ProtParam預(yù)測結(jié)果，此蛋白為疏水蛋白。在第13位氨基酸位置出現(xiàn)一個較強的疏水區(qū)域（score＞1.5），推測此位置可能存在一個跨膜結(jié)構(gòu)。

圖4 RpKTI基因編碼蛋白的親／疏水性

2.4 RpKTI基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測及信號肽分析

通過TMHMM對RpKTI基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，結(jié)果（圖5a）表明，RpKTI基因編碼蛋白可能存在1個跨膜結(jié)構(gòu)域，此跨膜結(jié)構(gòu)位于氨基酸序列N－端的第3～23位氨基酸，由膜內(nèi)到膜外，且可能含有信號肽。經(jīng)過SignalP－4.1分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白中存在信號肽，信號肽切割位點位于第25位氨基酸（即C值最高點，圖5b）。1～24位氨基酸為此蛋白的信號肽區(qū)域，信號肽序列為MKPAFITLSFLLFAFITNLQLTFS。

圖5 RpKTI基因編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域（a）和信號肽位點（b）

2.5 RpKTI基因編碼蛋白的磷酸化位點及糖基化位點

蛋白質(zhì)翻譯后的磷酸化及糖基化分析結(jié)果表明RpKTI基因編碼蛋白有11個磷酸化位點（圖6a），其中有7個絲氨酸（Ser）位點、3個蘇氨酸（Thr）位點和1個酪氨酸（Tyr）位點。N－糖基化位點位于第65位氨基酸天冬酰胺（Asn，圖6b）。

圖6 RpKTI基因編碼蛋白的磷酸化位點（a）和糖基化位點（b）

2.6 RpKTI基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

SPOMA分析結(jié)果（圖7）表明，RpKTI基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)由31個氨基酸構(gòu)成α－螺旋（alpha helix；14.76%），32個氨基酸構(gòu)成β－轉(zhuǎn)角（beta turn；15.24%），68個氨基酸構(gòu)成延伸鏈（extended strand；32.38%），以及79個氨基酸構(gòu)成無規(guī)則卷曲（random coil；37.62%）。在此蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，以延伸鏈和無規(guī)則卷曲為主。

圖7 RpKTI基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)

2.7 RpKTI基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)同源建模

建模結(jié)果（圖8）表明，第27～203位氨基酸參與建模，以5xoz.1.A為模板，兩者一致性可達66.85%，GMQE值為0.77。從圖8a可知，此蛋白主要是由無規(guī)則卷曲及延伸鏈構(gòu)成，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。拉式圖（Ramachandran Plots）的Ramachandran Favoured值為92.57%，表明預(yù)測構(gòu)象合理可用（圖8b）。

圖8 RpKTI基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)（a）和拉式圖（b）

2.8 RpKTI基因編碼蛋白的系統(tǒng)進化樹

通過對RpKTI基因編碼蛋白進行Blastp比對（圖9），此蛋白氨基酸序列中具有STI［soybean trypsin inhibitor（Kunitz）family of protease inhibitors］結(jié)構(gòu)域，屬于STI超級家族。選取相思子（Abrus precatorius）、黧豆（Mucuna pruriens）、蔓花生（Arachis duranensis）、花生（Arachis hypogaea）、木豆（Cajanus cajan）、豌豆（Pisum sativum）6種與刺槐同源性較高的豆科植物KTI基因氨基酸序列，采用DNAMAN軟件進行多序列比對，同源性為72.64%，由圖10可知，KTI基因在豆科植物中相對保守。

圖9 RpKTI基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域

圖10 RpKTI基因的氨基酸序列與其他植物KTI的同源比對

通過MEGA－X軟件的鄰位歸并法（Neighborjoining，NJ）對豆科植物Kuntiz型胰蛋白酶抑制劑基因（KTI）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖11），發(fā)現(xiàn)刺槐與蒺藜苜蓿位于同一分支，親緣關(guān)系較近，而與鷹嘴豆（Cicer arietinum）、蔓花生（Arachis duranensis）及花生（Arachis hypogaea）的親緣關(guān)系較遠。

圖11 豆科植物KTI基因的系統(tǒng)進化樹

2.9 RpKTI基因的相對表達量

如圖12所示，在鉛鎘混合脅迫時，隨處理時間的增加，RpKTI基因的表達量先增加后下降，在混合脅迫處理3 d時基因的相對表達量達到最高，約為對照（0 d）的3倍，而在混合脅迫45 d時又明顯下降。

圖12 鉛鎘混合脅迫下RpKTI基因的相對表達量

3 討論與結(jié)論

Kunitz型胰蛋白酶抑制劑廣泛存在，在豆科植物中的含量最多，目前已在多種植物中進行了分離及深入研究，如大豆、楊樹、煙草等［19－21］。研究表明，KTI基因參與多種生物脅迫及非生物脅迫的響應(yīng)，如抗蟲、耐鹽堿等。

實驗室前期的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，RpKTI基因的表達量在刺槐應(yīng)答鉛鎘脅迫過程中出現(xiàn)明顯的上調(diào)，表明RpKTI基因可能參與了刺槐對鉛鎘的脅迫應(yīng)答過程。本研究成功從刺槐中克隆得到RpKTI基因全長序列，其開放閱讀框ORF長度為633 bp，共編碼210個氨基酸，相對分子量為22 763.87 Da，與決明（26.68548 kDa）、鷹嘴豆（25.7 kDa）、黑豆（23.9 kDa）、蒙古沙冬青（21.5 kDa）等豆科植物的KTI基因分子量大小相近［22－25］，屬于STI家族。RpKTI基因編碼蛋白的信號肽序列位于整個氨基酸序列的第1～24位；具有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，屬于分泌蛋白；磷酸化主要集中在Ser、Thr、Tyr氨基酸位點。糖基化根據(jù)被修飾的類型可分為4類，以N－糖基化類型最多見，一般在Asn－X－Ser／Thr模式序列上出現(xiàn)［26］。RpKTI基因編碼蛋白含有磷酸化位點11個，其中Ser位點最多，可能參與蛋白質(zhì)的磷酸化調(diào)控；N－糖基化位點1個，位于第65位Asn氨基酸位點；RpKTI基因編碼蛋白的二、三級結(jié)構(gòu)主要以延伸鏈（32.38%）和無規(guī)則卷曲（37.62%）為主，而無規(guī)則卷曲影響著蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象及其功能［27］。RpKTI基因的氨基酸序列與其他豆科植物的同源性為72.64%，可能KTI基因在豆科植物中是一個較為保守的基因。系統(tǒng)進化樹發(fā)現(xiàn)其與蒺藜苜蓿的親緣關(guān)系更近。

為了進一步了解RpKTI基因的表達水平，通過qRT－PCR分析了RpKTI基因在鉛鎘脅迫下的表達量，在鉛鎘混合處理3 d時，葉中的表達量最高，隨著脅迫時間的延長，對脅迫的響應(yīng)呈下降趨勢，可能在此狀態(tài)下，植株已經(jīng)對鉛鎘的吸收達到飽和狀態(tài)，并對鉛鎘脅迫產(chǎn)生耐性［28］，其具體功能表達還需進一步試驗分析。

通過對RpKTI基因的克隆、生物信息學(xué)分析及表達分析，為后期RpKTI基因的功能驗證、解析其與刺槐鉛鎘耐受性及其作用機理提供了理論依據(jù)。