盧凱，齊軍山，祁凱，馬立國，張悅麗，張博，馬國蘋，李長松

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南，250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/山東省植物病毒學(xué)重點實驗室，山東 濟南，250100）

大豆根腐?。⊿oybean root rot）作為世界性土傳病害，給大豆生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。該病最早于1917 年由Crommell 等人在美國報道[1]，1991 年沈崇堯等報道我國東北地區(qū)發(fā)現(xiàn)大豆根腐病[2]。大豆根腐病的病原種類復(fù)雜，報道過的有鐮孢菌Fusɑriumspp.、絲核菌Rhizoctoniɑ solɑni、腐霉菌Pythiumspp.和疫霉菌Phytophthorɑ sojɑe等[3,4]，其中以絲核菌和鐮孢菌為主，腐霉菌在低洼地塊和多雨炎熱時會有發(fā)生，但報道較少。腐霉菌侵染大豆的根系和莖基部分，造成豆苗出土前根部腐爛，出土后豆苗猝倒，導(dǎo)致植株生長緩慢，甚至死亡，因此腐霉菌的危害非常嚴(yán)重。

我國大豆種植地域廣泛，氣候差異較大，大豆根腐病的病原也有所不同。黃淮地區(qū)和新疆以茄腐鐮孢菌F. solɑni為主，黑龍江省以尖鐮孢菌F.oxysporum和立枯絲核菌R. solɑni為主[5]，山東省以茄腐鐮孢菌F. solɑni為主，木賊鐮孢菌F. equiseti次之[6]，江蘇和安徽等南方省份的大豆根腐病致病菌中層生鐮孢菌F. ɑcuminɑtum的分離頻率較高。據(jù)報道，2017 年之前，我國導(dǎo)致大豆根腐病的鐮孢菌至少有24 種[7]，黃淮海地區(qū)可以導(dǎo)致大豆根腐病的腐霉菌有12 種，其中9 種腐霉菌為強致病菌[8]。與鐮孢菌相比，腐霉菌報道較少，而且強致病菌占比較高，需要更加關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 病樣的采集和分離

2019-2020 年的6-8 月份，在山東省濟寧、泰安、菏澤等地市的27 個鄉(xiāng)鎮(zhèn)的86 個采樣點采集大豆根腐病樣品432份，帶回實驗室4℃保存。應(yīng)用的培養(yǎng)基為玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）[8]和含有多菌靈、青霉素及利福平的玉米粒瓊脂培養(yǎng)基（CPR）[9]。自來水沖洗掉樣品表面泥土，在病健交界處取2 mm×2 mm的組織，用75%酒精表面消毒30 s，無菌水沖洗3 次，滅菌濾紙吸干，置于CPR 平板上，并將其放在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，挑取單菌絲置于CPR 平板中純化一次，再挑取單菌絲于CMA 平板擴大培養(yǎng)[10]。

1.2 致病性測定

依據(jù)形態(tài)和培養(yǎng)性狀，將明顯不同的菌株歸為3 類，依次命名為SD-1、SD-2 和SD-3。應(yīng)用土壤接種法[11]進(jìn)行致病性測定。大豆品種為齊黃34。土壤滅菌后裝盆。接菌量為土壤重量的3%[11]，對照盆接種滅菌玉米粒。3 次重復(fù)。將接菌后的大豆植株置于密閉保濕桶中，24 h后取出，溫室培養(yǎng)。定期觀測記錄發(fā)病情況，3 天后從發(fā)病的植株上再次分離病原菌，驗證與接種菌是否一致。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將純化的3 種腐霉菌接種到CMA 上，切取菌落邊緣的菌餅接種到Petris 培養(yǎng)液[8]中，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每天觀察菌落形態(tài)，在顯微鏡下觀察菌絲、菌絲膨大體、藏卵器、雄器和卵孢子的大小、形態(tài)以及著生位置。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

用E. Z. N. A. Fungal DNA 提取試劑盒提取DNA，-20℃冰箱保存。以ITS、CoxII 和β-tubulin 基因序列為目標(biāo)序列，分別利用通用引物ITS1 和ITS4[12]、FM66 和FM58[13]、BT5 和BT6[13]擴 增ITS、CoxII 和β-tubulin，引物序列如表1 所示。使用50μL PCR 反應(yīng)體系：DNA 模板2μL，上下游引物各1μL，2x PCR Mix 25μL，ddH2O 21μL。PCR 擴增程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)，72℃延伸7 min。經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。在每次反應(yīng)中設(shè)陰性對照（不含模板DNA）。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒純化回收后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果在GenBank 上與已發(fā)表的基因序列進(jìn)行同源性比對。根據(jù)ITS 序列分析結(jié)果，應(yīng)用MAGE6.0 完成最大似然法（Maximum Likelihood，ML）運算，用Bootstrap 重復(fù)抽樣5000 次來評估各分支點的可信度（自舉值），建立系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。依據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)結(jié)果確定大豆根腐病的病原菌種類。

表1 ITS、CoxII、β-tubulin引物序列Table 1 ITS,CoxII,β-tubulin primer sequences

1.5 病原菌再次分離

對人工接菌后發(fā)病的植株進(jìn)行病原菌的分離鑒定，驗證與接種菌株是否一致。一致的話，則確定該菌株為致病菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離

從432 份病樣中分離出279 株真菌，其中52 株菌株類似腐霉菌。通過形態(tài)特征和分子生物學(xué)鑒定，SD-1為瓜果腐霉P. ɑphɑnidermɑtum，SD-2為終極腐霉P. ultimum，SD-3 為林棲腐霉P. sylvɑticum。其中，瓜果腐霉P. ɑphɑnidermɑtum分離頻率最高，林棲腐霉P. sylvɑticum分離頻率最低，詳見表2。

表2 大豆根腐病病原菌分離結(jié)果Table 2 Isolation results of soybean root rot pathogens

2.2 致病性測定

回接發(fā)現(xiàn)，SD-1、SD-2、SD-3 均可造成典型的根腐病病癥：葉片青枯，莖基部縊縮呈褐色，根部變褐呈水漬狀。高溫高濕時發(fā)病很快，3 天便發(fā)病死亡。如圖1所示。

圖1 人工接菌SD-1、SD-2、SD-3 3天后大豆幼苗癥狀Fig.1 Symptoms of soybean seedlings after artificial inoculation with SD-1,SD-2 and SD-3 for 3 days

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

SD-1、SD-2、SD-3 接種在CMA 培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)，SD-1、SD-2 經(jīng)2 d 便可長滿直徑90 mm平皿，SD-3 需要3 d 才可長滿。培養(yǎng)4 d 后，SD-1 在培養(yǎng)基表面向上生長，SD-2、SD-3 菌絲開始沿培養(yǎng)皿壁生長。SD-1、SD-2、SD-3 菌落在CMA 上呈放射狀，氣生菌絲棉絮狀，菌絲發(fā)達(dá)分支茂盛。

SD-1 孢子囊成簇狀，有間生及頂生，藏卵器近球型，表面平滑，平均直徑22.8μm。玉米粒狀的雄器可與藏卵器結(jié)合，形成卵孢子。卵孢子內(nèi)含貯球物，不滿器，平均直徑19.5μm（圖2）。

圖2 SD-1菌落和顯微結(jié)構(gòu)Fig.2 colony and microstructure of SD-1

SD-2菌絲膨大體近球形，有間生、頂生，平均直徑21.3μm，雄器可與藏卵器結(jié)合，形成卵孢子。卵孢子平均直徑為21.1μm，內(nèi)含貯球物一個，不滿器，平均直徑為20.8μm（圖3）。

圖3 SD-2菌落和顯微結(jié)構(gòu)Fig.3 Colony and microstructure of SD-2

SD-3 可長出菌絲膨大體，有頂生、間生，如圖4中的C、D、E、F所示，平均直徑26.8μm（圖4）。

圖4 SD-3菌落和顯微結(jié)構(gòu)Fig.4 Colony and microstructure of SD-3

參 照van der Plaats-Niterink[15]、余 永 年[16]、Kageyama[17]和Ueta 和Tojo[18]等人的方法對3 種菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。結(jié)果SD-1 為瓜果腐霉P.ɑphɑnidermɑtum，SD-2 為終極腐霉P. ultimum，SD-3為林棲腐霉P. sylvɑticum。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)ITS、CoxII、β-tubulin 測定的序列在NCBI上進(jìn)行比對的結(jié)果，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（表3、圖5、圖6）。根據(jù)ITS、CoxII、β-tubulin 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹可以確定SD-1 為瓜果腐霉P. ɑphɑnidermɑtum，SD-2 為終極腐霉P. ultimum，SD-3 為林棲腐霉P.sylvɑticum。

表3 ITS、β-tubulin和CoxII blast結(jié)果Table 3 ITS,β-tubulin and CoxII BLAST results

圖5 SD-1、SD-2、SD-3基于ITS序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic trees of SD-1,SD-2 and SD-3 based on ITS sequence

圖6 SD-1、SD-2、SD-3基于β-tubulin序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic trees of SD-1,SD-2 and SD-3 based on β-tubulin sequence

2.5 病原菌再次分離結(jié)果

分離純化的菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。經(jīng)ITS 序列鑒定，SD-1 與序列號MN744684.1 相似性為99.73%，為瓜果腐霉P.ɑphɑnidermɑtum；SD-2 與序列號KU209757.1 的相似性為100%，為終極腐霉P. ultimum；SD-3 與序列號MN541113.1 的相似性為99.78%，為林棲腐霉P. sylvɑticum。確定瓜果腐霉P. ɑphɑnidermɑtum、終極腐霉P. ultimum和林棲腐霉P. sylvɑticum為大豆根腐病的致病菌。

3 討論

大豆根腐病病原組成復(fù)雜，多是幾種菌復(fù)合侵染，其中鐮孢菌最多，報道的常見鐮孢菌有尖孢鐮孢菌和茄腐鐮孢菌，此外還有立枯絲核菌，而腐霉菌報道較少。在山東，二十世紀(jì)八九十年代大豆根腐病的病原以鐮孢菌為主[6]，也有疫霉菌的報道[19]。之后20 多年，關(guān)于山東大豆根腐病的病原報道不多。而本次鑒定發(fā)現(xiàn)，腐霉菌已經(jīng)成為山東省大豆根腐病的重要病原菌。在其他省份，大豆腐霉菌根腐病也有報道，如福建省的瓜果腐霉P. ɑphɑnidermɑtum[20]，湖南省的刺腐霉P. spinosum[21]和終極腐霉P. ultimum[22]。加拿大的終極腐霉P. ultimum、異宗配合腐霉P. heterothɑllicum、林棲腐霉P. sylvɑticum等也可以導(dǎo)致大豆根腐病[23]。張瑞萍等從大豆土壤中[24]分離到林棲腐霉，接種后可導(dǎo)致種子腐爛及苗期莖折、樓兵干等[25]從大豆猝倒苗中也分離到了林棲腐霉。本研究與張瑞萍和樓兵干的分離材料不同，林棲腐霉P. sylvɑticum導(dǎo)致大豆成株期根腐病在國內(nèi)為首次報道。

本研究結(jié)果豐富了大豆根腐病的病原組成，為大豆根腐病抗性品種的選育及制定切實有效的防控措施提供了重要的理論依據(jù)。本課題組20 余年的研究發(fā)現(xiàn)，作物根腐類病害的病原菌已經(jīng)由鐮孢菌為主轉(zhuǎn)為鐮孢菌與腐霉菌并重，腐霉菌可以導(dǎo)致小麥、生姜、草莓、花生等多種作物的根腐病。在許多作物上，腐霉菌根腐病的發(fā)生頻率及危害程度已經(jīng)超過鐮孢菌根腐病。在炎熱多雨季節(jié)時，腐霉菌病程短、發(fā)病重、損失大。在制定根腐病防治策略和抗病育種目標(biāo)時必須把腐霉菌作為重要的目標(biāo)來對待。