李偉嶺 ， 范小平 ， 楊 芳 ， 劉 波 ， 岳永波 ， 吳鵬飛 ， 羅 妍 ， 趙 盼 ， 王金陽(yáng)

(1.保定冀中藥業(yè)有限公司 ， 河北 保定 071500 ； 2.石家莊冀中藥業(yè)有限公司 ， 河北 石家莊 050066 ；3.海南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 海南 ?？?571100)

加米霉素(Gamithromycin)是新一代半合成、十五元氮雜大環(huán)內(nèi)酯類動(dòng)物專用抗菌藥，由法國(guó)梅里亞(Merial)開發(fā)成獸用注射液(商品名Zactran?)，用于防治溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌和睡眠嗜組織菌引起的牛呼吸系統(tǒng)疾病，由胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌和豬嗜血桿菌引起的豬呼吸系統(tǒng)疾病，以及由惡性節(jié)瘤偶蹄形菌和壞死梭桿菌引起的綿羊腐蹄病[1-5]。加米霉素具有抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣、吸收迅速、生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)，在獸醫(yī)臨床具有廣泛的應(yīng)用前景[6-15]。為了保障動(dòng)物源性食品安全與維護(hù)人體健康，獸藥殘留問(wèn)題已成為關(guān)注的焦點(diǎn)。動(dòng)物源性食品中獸藥殘留檢測(cè)方法有高效液相色譜法(HLPC)、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)等[16-17]。本試驗(yàn)建立了一種可靠、靈敏的檢測(cè)豬可食性組織中加米霉素殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters Quattro Premier)；BSA224S-CW型電子天平(Sartorius公司)；5424R型高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)；VORTEX2-渦旋混合器(IKA公司)；CM-12型水浴氮吹儀(北京成萌偉業(yè)科技有限公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Oasis MCX 3CC固相萃取柱(Waters公司)。

1.2 試劑 加米霉素(TRC公司，含量98.7%)；甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純(Merk公司)；甲酸為質(zhì)譜純(Sigma公司)；乙酸、乙酸銨、氨水均為國(guó)產(chǎn)分析純；水為Miili-Q級(jí)。

1.3 溶液配制 乙腈-甲醇混合溶液(70∶30，V/V)：準(zhǔn)確量取350 mL乙腈和150 mL甲醇于500 mL試劑瓶中，混勻，備用。5%氨化乙腈-甲醇混合溶液(70∶30，V/V)：移取5 mL氨水于95 mL乙腈-甲醇混合溶液(70∶30，V/V)中，混勻。0.1 mol/L乙酸銨溶液：稱取7.7 g乙酸銨，用1 L水溶解，乙酸調(diào)節(jié)pH至4.5。10 mmol/L乙酸銨溶液：準(zhǔn)確稱取0.77 g乙酸銨溶于1 L水中，乙酸調(diào)節(jié)pH至3.6。乙腈飽和正己烷：將乙腈和正己烷按1∶1比例混合即可。加米霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL)：精密稱取加米霉素標(biāo)準(zhǔn)品10.2 mg于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，置于-20 ℃冰箱中保存。加米霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 μg/mL)：精密量取0.1 mL加米霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，置于4 ℃保存。

1.4 試料的制備與保存 取適量新鮮或解凍的空白或供試組織均質(zhì)；取均質(zhì)的供試樣品作為供試試料，取均質(zhì)的空白樣品作為空白試料；取均質(zhì)的空白樣品，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，作為空白添加試料。試料均于-20 ℃保存。

1.5 樣品提取 準(zhǔn)確稱取(2.0±0.02) g試料于50 mL離心管中，加入乙腈6 mL，渦旋混合器渦旋5 min，超聲提取10 min，12 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，殘?jiān)尤? mL乙腈重復(fù)上述操作1次，合并上清液，加入5 mL乙腈飽和正己烷去脂，渦旋混合器渦旋3 min，12 000 r/min離心5 min，除去上層有機(jī)層，下層為備用液，待凈化。

1.6 樣品凈化 Oasis MCX 3CC固相萃取柱依次用3 mL甲醇和3 mL 0.1 mol/L乙酸銨(pH=4.5)活化后，將備用液全部過(guò)柱，待備用液全部流出后，依次用6 mL 0.1 mol/L乙酸銨(pH=4.5)、6 mL乙腈-甲醇(70∶30)混合溶液淋洗，抽干，用5 mL 5%氨化乙腈-甲醇混合溶液洗脫，抽干，洗脫液用氮?dú)獯蹈?。殘余物? mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，12 000 r/min離心5 min，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.7 色譜條件 色譜柱：Kinetex C18(50 mm×2.1 mm，2.6 μm，100 ?，Phenomenex)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速：0.4 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL。

表1 梯度洗脫條件

1.8 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；離子源溫度：140 ℃；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；霧化溫度：350 ℃；霧化氣流速：900 L/h；定性、定量離子對(duì)及錐孔電壓、碰撞能量見表2。

表2 定性、定量離子對(duì)與錐孔電壓、碰撞能量

1.9 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 取6份空白樣品，經(jīng)提取、凈化后，精密量取適量加米霉素標(biāo)準(zhǔn)工作液，加入到空白基質(zhì)，制得5、10、50、100、500 ng/mL和1 000 ng/mL系列基質(zhì)添加濃度，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次。以加米霉素特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.10 檢測(cè)限與定量限 在4種空白組織(豬肌肉、肝臟、腎臟和脂肪)中分別添加系列不同濃度的加米霉素，分別制得1～10 μg/kg添加濃度的試料，經(jīng)提取、凈化后測(cè)定。加米霉素特征離子色譜峰的信噪比S/N≥10時(shí)的添加濃度為定量限(LOQ)，信噪比S/N≥3時(shí)的添加濃度為檢測(cè)限(LOD)。

1.11 準(zhǔn)確度與精密度 對(duì)豬肌肉、肝臟、腎臟和脂肪分別在LOQ、0.5最大殘留限量(MRL)、MRL和2MRL進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。歐洲藥品管理局規(guī)定豬肌肉、豬脂肪和豬肝臟的MRL為100 μg/kg，豬腎臟的MRL為300 μg/kg[3]。在空白組織中添加加米霉素，使豬肌肉、脂肪和肝臟的藥物濃度為5、50、100 μg/kg和200 μg/kg，豬腎臟中藥物濃度為5、150、300 μg/kg和600 μg/kg，每種組織每個(gè)濃度3個(gè)批次，每個(gè)批次同一濃度做5次平行試驗(yàn)，檢查方法的準(zhǔn)確度與精密度。

2 結(jié)果

2.1 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線 加米霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液在肌肉、肝臟、脂肪和腎臟的基質(zhì)匹配曲線的線性范圍為5～1 000 μg/kg，相關(guān)系數(shù)>0.99，4種組織的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線見表3。

表3 加米霉素基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 檢測(cè)限與定量限 加米霉素在豬肌肉、肝臟、腎臟和脂肪中的殘留檢測(cè)限均為3 μg/kg，其殘留定量限均為5 μg/kg。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度 各組織樣品的回收率試驗(yàn)結(jié)果見表4和表5，加米霉素在豬肌肉、肝臟、脂肪和腎臟可食性組織中的平均回收率為66.69%～90.75%；變異系數(shù)結(jié)果見表6和表7，批間變異系數(shù)≤11.94%，符合獸藥殘留檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求。

表4 豬肌肉和豬肝臟中加米霉素的回收率

表5 豬腎臟和豬脂肪中加米霉素的回收率

表6 豬肌肉和豬肝臟中加米霉素的變異系數(shù)

表7 豬腎臟和豬脂肪中加米霉素的變異系數(shù)

3 討論

本試驗(yàn)篩選了1%甲酸乙腈溶液[18]、90%乙腈水溶液[19]和乙腈3種提取溶劑，并對(duì)其提取效果進(jìn)行對(duì)比。1%甲酸乙腈溶液易將色素類雜質(zhì)提取出來(lái)致使提取液顏色較深及后續(xù)凈化難度增大；加米霉素為弱極性化合物，且在水中幾乎不溶，90%乙腈水溶液的提取效率不及乙腈。對(duì)比3種提取溶劑的提取結(jié)果，最終采用乙腈為提取溶劑。考察了不同色譜柱[Kinetex C18(50 mm×2.1 mm，2.6 μm，100 ?，Phenomenex)和Poroshell 120 EC-C18(100 mm×2.1 mm，2.7 μm，120 ?，Agilent)]、柱溫(25 ℃和30 ℃)、流速(0.2、0.3 mL/min和0.4 mL/min)和進(jìn)樣體積(2 μL和10 μL)的影響，結(jié)果表明本試驗(yàn)選用的色譜條件耐用性良好。通過(guò)優(yōu)化毛細(xì)管電壓(3.0 kV和5.0 kV)、霧化溫度(350 ℃和325 ℃)、碰撞能量(40 eV和47 eV)等質(zhì)譜參數(shù)，使用不同質(zhì)譜儀(Wsters Quattro Premier和Agilent Infinity Lab)優(yōu)選的定性離子對(duì)(m/z)、定量離子對(duì)(m/z)分別為777.6>158.2、777.6>619.3和777.4>157.8、777.4>619.4，可略有差異。本試驗(yàn)建立的測(cè)定豬肌肉、肝臟、脂肪和腎臟中加米霉素殘留量的HPLC-MS/MS方法，樣品處理簡(jiǎn)便、靈敏度高、線性范圍廣、準(zhǔn)確可靠，可推廣應(yīng)用于豬可食性組織中加米霉素殘留的檢測(cè)。