祖木熱提汗·買買提 ， 陳 卓 ， 馬義誠 ， 加依娜古麗·吐爾遜拜 ， 張曉紅 ， 趙紅瓊 ， 郝智慧 ， 姚 剛

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 新疆 烏魯木齊 830052 ； 2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

運(yùn)動性疲勞(Exercise fatigue or exercise-induced fatigue)是由運(yùn)動引起的肌肉最大收縮或者最大輸出功率暫時性下降以及機(jī)體多方面生理功能的復(fù)雜變化過程[1]。采用動物模型研究運(yùn)動性疲勞能夠更加客觀反映出機(jī)體的生理生化變化機(jī)理，有利于評價機(jī)體的損傷變化[2]。Bedford等[3]1979年設(shè)計了一種基于耗氧量變化的大鼠10階段有氧跑臺運(yùn)動狀況測定程序和相應(yīng)的測定裝置。運(yùn)動過程中心率(Heart rate,HR)、血壓(Blood pressure,BP)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,UREA)、血糖(Blood glucose,GLU)、乳酸(Lactose,LAC)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、肝糖原(Hepatic glycogen,HG)和肌糖原(Muscle glycogen,MG)等指標(biāo)的變化常作為運(yùn)動性疲勞產(chǎn)生的生物醫(yī)學(xué)指征[4-6]。朱浩[7]采用大鼠跑臺運(yùn)動方法建立運(yùn)動性疲勞模型，發(fā)現(xiàn)力竭大鼠CK、LAC和UREA顯著上升，LDH、MG和HG含量顯著下降。殷娟娟[8]研究證明，小鼠力竭運(yùn)動后骨骼肌Bcl-2/Bax的蛋白比值顯著降低。管花肉蓯蓉[Cistanchetubulosa(Schenk) Wight,CtW]屬列當(dāng)科(Orobanchaceae)肉蓯蓉屬(Cistanche)多年寄生性草本植物，又名蓯蓉、大蕓等。主要分布于我國內(nèi)蒙古、青海、陜西、甘肅、寧夏、新疆南部地區(qū)以及國外一些地區(qū)[9-10]。管花肉蓯蓉化學(xué)成分主要包括苷類、萜類、生物堿類、糖類、微量元素和氨基酸等[11]，其中苯乙醇苷類具有抗氧化、抗病毒、增強(qiáng)免疫力、改善記憶力、抗衰老等多種藥理作用[12]。丁瓊[13]采用游泳運(yùn)動小鼠模型測定了景天三七提取物灌胃后小鼠抗疲勞作用，發(fā)現(xiàn)景天三七提取物可發(fā)揮顯著抗疲勞作用。管花肉蓯蓉與景天三七具有相似的化學(xué)組成，但管花肉蓯蓉提取物是否也具有抗運(yùn)動性疲勞效果尚未見報道。因此，本試驗(yàn)擬采用小鼠跑臺運(yùn)動方法制備運(yùn)動性疲勞小鼠模型，進(jìn)行管花肉蓯蓉醇提物抗小鼠運(yùn)動性疲勞的研究，以期為管花肉蓯蓉抗疲勞制劑的研發(fā)奠定試驗(yàn)動物藥效學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 管花肉蓯蓉，購自新疆和田地區(qū)于田縣中醫(yī)藥店；大孔樹脂，購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇，購自天津永晟精細(xì)化工有限公司；肝糖原、肌糖原測定試劑盒，均購自南京建成生物研究所；乳酸(LAC)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、尿素氮(UREA)、血糖(GLU)生化試劑片，均購自美國愛德士有限公司。

1.2 儀器 中藥粉粹機(jī)，浙江省溫嶺市大鵬機(jī)械有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)皿，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；動物跑步機(jī)，城都泰盟軟件有限公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)品；血液生化分析儀，北京益仁恒業(yè)科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物 4～5周齡雄性健康昆明小鼠60只，體重為18～22 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心 [生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2018—0001，使用許可證號：SYXK(新)2018—0003]。小鼠每天飼喂商品顆粒飼料(購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)1次，自由采食和飲水(凈化水)。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)環(huán)境安靜、清潔，光照、通風(fēng)良好，無異味。墊料定期更換，保持干燥。飼養(yǎng)環(huán)境及動物試驗(yàn)已經(jīng)通過新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理委員會審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號為2019015)。

1.3.2 管花肉蓯蓉醇提物的制備 采用中藥粉碎機(jī)(轉(zhuǎn)速2 800次/min)將管花肉蓯蓉粉碎呈粉狀。參照任璐等[14]的提取方法，精確稱取500 g管花肉蓯蓉粉，加入75%的乙醇溶液5 L(1∶10)浸泡24 h。12層紗布過濾棄藥渣，利用大孔樹脂過濾。濾液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至500 mL得到液體狀醇提物(每毫升含生藥1 g)。

1.3.3 小鼠適應(yīng)性運(yùn)動訓(xùn)練與試驗(yàn)分組 采用動物跑步機(jī)參照劉曉莉等[15]的方法設(shè)計訓(xùn)練計劃(表1)，坡度為0°，轉(zhuǎn)速為10 m/min和 14 m/min，運(yùn)動訓(xùn)練時間為15 min，每天1次，經(jīng)3 d適應(yīng)性訓(xùn)練，隨機(jī)分為5個組：不運(yùn)動組(Non exercise control,NE)、運(yùn)動組(Exercise control,EC)，每組10只；管花肉蓯蓉醇提物低劑量組(E+CtW-L)、中劑量組(E+CtW-I)和高劑量組(E+CtW-H)，每組12只。具體處理方法如表2所示。

表1 小鼠跑步機(jī)適應(yīng)性訓(xùn)練計劃

表2 管花肉蓯蓉醇提物灌胃小鼠劑量分組與處理

1.3.4 小鼠運(yùn)動跑臺運(yùn)動性疲勞模型的建立 經(jīng)過適應(yīng)性訓(xùn)練的小鼠，參照Bedford等[3]方法采用小鼠跑步機(jī)設(shè)計10階段運(yùn)動性疲勞訓(xùn)練計劃(表3)，制備小鼠運(yùn)動性疲勞模型。主要觀測運(yùn)動時后肢蹬地力量、腹部與跑道的接觸程度、維持運(yùn)動強(qiáng)度能力、對刺激的應(yīng)答反應(yīng)能力和力竭狀態(tài)的出現(xiàn)等。

表3 10階段運(yùn)動訓(xùn)練參數(shù)

1.3.5 指標(biāo)測定 (1)體重測定：每天小鼠灌胃之前使用電子天平測量小鼠體重并記錄。(2)器官相對重量測定：試驗(yàn)結(jié)束處死小鼠，采集心、肝、脾、肺、腎、胃和腸等器官測定濕重，按公式：器官相對重量/%=器官濕重/小鼠體重×100%，計算器官相對重量。(3)運(yùn)動性疲勞相關(guān)指標(biāo)測定：采用愛德士全自動生化分析儀測定血清GLU、LAC、UREA、 LDH、CK含量，MG、HG含量按試劑盒說明書操作測定。(4)肺組織顯微結(jié)構(gòu)觀察：采集運(yùn)動前和運(yùn)動后小鼠肺臟，用10%甲醛固定，H.E.染色，制作石蠟組織切片于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.6 管花肉蓯蓉醇提物抗小鼠運(yùn)動性疲勞效果測定 (1)給藥方式：管花肉蓯蓉醇提物根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)、中藥藥理學(xué)教材[16-17]藥物4倍稀釋法，計算低、中、高劑量的濃度。灌胃劑量為0.2 mL/(10 g·bw)，每天早晨10:30對CtW各劑量組小鼠灌胃1次，連續(xù)灌胃14 d。 EC組灌胃等體積的生理鹽水。灌胃結(jié)束后開始補(bǔ)飼料，試驗(yàn)期間各組小鼠的飼養(yǎng)條件一致。具體分組和試驗(yàn)處理見表2。(2)運(yùn)動方式：同表3。以實(shí)驗(yàn)動物疲勞模型所獲的疲勞階段為依據(jù)，CtW低、中、高劑量組的50%動物終止運(yùn)動，其余的50%動物繼續(xù)運(yùn)動至力竭狀態(tài)后再進(jìn)行上述指標(biāo)測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 各項(xiàng)運(yùn)動相關(guān)指標(biāo)和血清生理生化測定數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示，器官相對重量以百分比表示。利用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。NE組與EC組之間進(jìn)行非配對t檢驗(yàn)，管花肉蓯蓉醇提物各劑量組與EC組之間進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOWA)。P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 小鼠運(yùn)動性疲勞模型建立

2.1.1 小鼠運(yùn)動性疲勞體征變化 當(dāng)小鼠運(yùn)動至第9階段，坡度為10°，跑臺轉(zhuǎn)速為20 m/min時，小鼠出現(xiàn)拒絕跑步，腹部和跑臺密切接觸，電刺激數(shù)增加到2.8 c/phase，小鼠反應(yīng)遲鈍，仍滯留在電磁感應(yīng)區(qū)，此階段初步視為出現(xiàn)疲勞癥狀(圖1)。

圖1 小鼠運(yùn)動至疲勞狀態(tài)電刺激次數(shù)變化

2.1.2 運(yùn)動性疲勞對小鼠體重和器官相對重量的影響 結(jié)果如圖2所示，EC組小鼠體重[(29.15±0.64)g]與NE組小鼠體重[(32.39±1.39)g]相比顯著下降(P<0.05)。EC組肝臟相對重量(4.63%±0.09%)和腎臟相對重量(1.11%±0.18%)均比NE 組(5.28%±0.23%和1.59%±0.62%)顯著降低(P<0.05)。而其他所測定的器官相對重量變化差異不顯著(P>0.05)。

圖2 不運(yùn)動組和運(yùn)動組小鼠體重、器官相對重量比較

2.1.3 運(yùn)動性疲勞對小鼠血清生化指標(biāo)及肌糖原和肝糖原含量的影響 結(jié)果如圖3所示，第9階段EC組小鼠GLU [(2.80±0.47)mmol/L]、LDH[(1 373 ±85.83)U/L]、MG[(1.80±0.11)mg/g]和HG[(6.92±0.21) mg/g]含量均極顯著低于NE組[GLU：(8.73±1.07) mmol/L，LDH：(2 709±87.51)U/L，MG：(4.05±0.24) mg/g, HG：(24.65±2.42) mg/g](P<0.01)。而EC組的UREA[(15.71±1.69) mmol/L]和CK[(739.3±2.31)U/L]含量均極顯著高于NE組[(6.70±0.54)mmol/L和(337.8±0.41)U/L](P<0.01)。EC組小鼠LAC含量與NE組相比也呈升高趨勢(P=0.099)。

圖3 運(yùn)動性疲勞對小鼠血清生化指標(biāo)及MG、HG含量的影響

2.1.4 運(yùn)動性疲勞對肺組織形態(tài)學(xué)影響 與NE組小鼠相比，EC組小鼠局部肺泡擴(kuò)張，肺泡壁斷裂，肺泡相互融合(圖4B 1)，肺泡間質(zhì)增寬(圖4B 2)，肺間質(zhì)內(nèi)可見淋巴細(xì)胞浸潤(圖4B 3)，但肺泡內(nèi)未有炎性滲出。

圖4 肺臟組織切片圖(H.E.染色，40×)

2.2 管花肉蓯蓉抗小鼠運(yùn)動性疲勞的效果

2.2.1 管花肉蓯蓉對第9階段運(yùn)動小鼠器官相對重量的影響 結(jié)果如表4所示，各CtW組與EC組相比，體重?zé)o差異(P>0.05)。與運(yùn)動組相比，E+CtW-I組小鼠肺臟和腎臟器官相對重量均顯著增加(P<0.05)，其他臟器無顯著變化(P>0.05)。

表4 第9階段管花肉蓯蓉對小鼠臟器器官相對重量的影響

2.2.2 管花肉蓯蓉對第9階段運(yùn)動小鼠運(yùn)動參數(shù)及運(yùn)動性疲勞相關(guān)指標(biāo)的影響 由封三圖5可知，各CtW組與EC組相比，運(yùn)動時間、運(yùn)動歷程和刺激次數(shù)等參數(shù)無顯著差異(P>0.05)。由封三圖6可知，與NE組相比，EC組小鼠的GLU、MG和HG含量極顯著降低(P<0.001)，LDH含量也呈現(xiàn)顯著下降趨勢(P=0.054)，而UREA含量極顯著升高(P<0.001)，CK含量也呈顯著上升趨勢(P=0.068)，LAC含量無差異(P>0.05)。整體顯示，第9階段EC組大鼠出現(xiàn)疲勞狀態(tài)。而各CtW組與EC組相比，E+CtW-L組GLU含量極顯著高于EC組(P<0.001)，UREA含量顯著低于EC組(P<0.05)，CK含量也呈顯著下降趨勢(P=0.052)。 各CtW組的LDH均極顯著高于EC組(P<0.01)，E+CtW-I組和E+CtW-H組的MG含量極顯著高于EC組(P<0.001)，而E+CtW-L組和E+CtW-I組的HG含量也顯著高于EC組(P<0.05)。結(jié)果表明各CtW組小鼠尚未出現(xiàn)運(yùn)動性疲勞狀態(tài)。

2.2.3 管花肉蓯蓉對第10階段運(yùn)動小鼠臟器相對重量的影響 由表5可知，在第10階段各CtW組與EC組相比，器官相對重量無顯著變化(P>0.05)。

表5 第10階段管花肉蓯蓉對小鼠臟器器官相對重量的影響

2.2.4 管花肉蓯蓉對第10階段運(yùn)動小鼠運(yùn)動參數(shù)及運(yùn)動性疲勞相關(guān)指標(biāo)的影響 由封三圖7可知，與EC組相比，E+CtW-L組的運(yùn)動時間和距離顯著延長(P<0.05)，而E+CtW-I組和E+CtW-H組的運(yùn)動時間和距離極顯著延長(P<0.01)。各CtW組電刺激次數(shù)與EC組相比，差異不顯著(P>0.05)。由圖8可知，各CtW組的GLU含量與EC組相比無顯著差異，但均極顯著低于NE組(P<0.01)。E+CtW-H組的UREA含量與EC組比較無顯著差異(P>0.05)，但E+CtW-L組和E+CtW-I組的UREA含量顯著低于EC組(P<0.05)。E+CtW-H組的LAC含量顯著低于EC組(P<0.05)。各CtW組的LDH含量均顯著高于EC組(P<0.01)，各CtW組的CK含量均顯著低于EC組(P<0.05)，E+CtW-I組的MG和HG含量也極顯著高于EC組(P<0.01)。

圖8 第10階段小鼠運(yùn)動性疲勞相關(guān)指標(biāo)

3 討論

3.1 小鼠運(yùn)動性疲勞模型的建立 運(yùn)動性疲勞模型大多以大鼠或小鼠作為試驗(yàn)對象，采用跑臺上運(yùn)動、游泳運(yùn)動建立[18]。本試驗(yàn)采用Bedford等[3]建立的經(jīng)典10階段運(yùn)動方案。參照楊堤[19]研究的UREA、 LAC、CK、LDH以及MG、HG等疲勞指標(biāo)進(jìn)行評價。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，EC組UREA和CK含量極顯著高于NE組，而GLU、LDH、MG和HG含量極顯著低于NE組，這些結(jié)果與Takeda等[20]的研究結(jié)果一致。觀察力竭小鼠肺泡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EC組出現(xiàn)局部肺組織肺泡擴(kuò)張、肺泡塌陷。與張童君[21]建立的疲勞模型中大鼠肺臟形態(tài)變化的研究結(jié)果一致。證明本試驗(yàn)的10階段運(yùn)動性疲勞模型建立成功。

3.2 管花肉蓯蓉抗運(yùn)動性疲勞效果 尋找更加安全有效的抗疲勞物質(zhì)己經(jīng)成為全球研究熱點(diǎn)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃管花肉蓯蓉醇提物14 d，各劑量小鼠日常生活行為無任何異常，但E+CtW-I組肺臟和腎臟器官相對重量顯著增加，其他臟器無顯著變化。這個現(xiàn)象可能提示管花肉蓯蓉醇提物對肺臟和腎臟沒有保護(hù)功能。覃茂鑫等[22]研究顯示，給小鼠注射大蒜素可極顯著提高游泳時間，降低CK、UREA和LAC水平。此研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致，說明管花肉蓯蓉醇提物可降低血清CK、UREA和LAC的含量，補(bǔ)充體內(nèi)所需要的營養(yǎng)和能源物質(zhì)，具有抗運(yùn)動性疲勞的作用。

3.3 管花肉蓯蓉延緩運(yùn)動性疲勞效果 運(yùn)動時間延長是抗運(yùn)動性疲勞的直觀外在體現(xiàn)，因此用力竭時間的長短作為本試驗(yàn)的一個指標(biāo)。鄭尚莉[23]研究給小鼠灌胃藍(lán)莓濃縮汁，發(fā)現(xiàn)其可顯著延長小鼠力竭游泳時間。張磊[24]研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠灌胃楓糖可延緩小鼠負(fù)重游泳時間，降低血清CK和UREA含量，顯著升高M(jìn)G、HG和LDH含量。本試驗(yàn)使用管花肉蓯蓉醇提物對小鼠灌胃，明顯延長了小鼠在一定運(yùn)動強(qiáng)度下持續(xù)運(yùn)動時間和運(yùn)動歷程，并降低了CK和UREA含量，增加了HG、MG和LDH含量，該結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致。綜上，管花肉蓯蓉醇提物能夠延緩小鼠運(yùn)動性疲勞的發(fā)生，具有抗小鼠運(yùn)動性疲勞、提高運(yùn)動耐力、延緩力竭狀態(tài)出現(xiàn)的作用。