郭許情 ， 王黎霞 ， 張榕珍 ， 張 健 ， 張?zhí)煊?， 石夢(mèng)云 ， 王詩琪 ， 趙小涵 ， 張建軍 ， 安 健

(1. 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 北京 昌平 102206 ； 2. 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系 ， 北京 房山 102442)

雞球蟲病是由一種或多種頂復(fù)門艾美爾球蟲寄生于雞腸道上皮細(xì)胞導(dǎo)致的寄生性原蟲病，對(duì)我國的禽養(yǎng)殖業(yè)造成了大量直接或間接的經(jīng)濟(jì)損失[1]。在公認(rèn)的幾種球蟲中，柔嫩艾美爾球蟲(Eimeriatenella)在雞球蟲病中最常見，致病性也最強(qiáng)，且基于柔嫩艾美爾球蟲的研究也較為廣泛。

頂復(fù)門原生寄生蟲依賴宿主細(xì)胞而存活，它們?cè)谌肭诌^程中通過改變細(xì)胞的生命活動(dòng)促使其能在細(xì)胞內(nèi)存活并發(fā)育[2]。而雞球蟲在入侵過程中分泌的相關(guān)蛋白成為了阻斷雞球蟲發(fā)育的研究重點(diǎn)，通過各種技術(shù)干預(yù)這些蛋白的分泌可達(dá)到預(yù)防雞球蟲病的效果。柔嫩艾美爾球蟲假定蛋白(Eimeriatenellahypothetical protein，EtHP)是一種分泌性蛋白，本課題組推測(cè)其在柔嫩艾美爾球蟲入侵過程中存在重要作用[3]，但具體功能尚未深入研究。本試驗(yàn)構(gòu)建了真核熒光重組表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-EtHP，篩選出高效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并檢驗(yàn)其在不同種細(xì)胞中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探索EtHP蛋白在柔嫩艾美爾球蟲入侵寄生過程中對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)的影響提供有效的試驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1 材料 柔嫩艾美爾球蟲第2代裂殖子cDNA，真核熒光表達(dá)載體pEGFP-N1，Vero、DF-1、BHK、HD-11細(xì)胞，均由北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存提供；DNA Marker，購自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶SacI/SacII、T4連接酶，均購自美國NEB公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒，購自北京索萊寶生物技術(shù)公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent，購自美國賽默飛科技公司；本試驗(yàn)所使用的抗體，均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1EtHP基因的克隆 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增EtHP基因(JN987269.1)CDS區(qū)，長度為450 bp。EtHP-F序列為：5′-cgagctcatggcggatcagcttaccgag-3′，含有SacI酶切位點(diǎn)；EtHP-R序列為：5′-tccccgcggcttcgcaagcatcattcccacgaactcctca-3′，含有SacII酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并膠回收。

1.2.2 真核重組熒光質(zhì)粒pEGFP-N1-EtHP的構(gòu)建 同時(shí)用SacI和SacII對(duì)空質(zhì)粒與膠回收產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，回收的pEGFP-N1和EtHP基因酶切片段按比例混合后加入T4連接酶，16 ℃放置過夜后轉(zhuǎn)化Trans-T1感受態(tài)細(xì)胞。選取4個(gè)單菌落進(jìn)行PCR鑒定，提取其中鑒定為陽性的質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒提取pEGFP-N1-EtHP和pEGFP-N1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的Vero細(xì)胞、DF-1細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HD-11細(xì)胞復(fù)蘇，分別用含5%、15%、10%、15% FBS和均含有1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。傳2～3代，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 pEGFP-N1-EtHP的轉(zhuǎn)染 選取上述4種生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行鋪板。24孔板中加入每種對(duì)應(yīng)的完全培養(yǎng)液500 μL/孔，再以細(xì)胞密度1×105個(gè)/孔鋪被24孔板，每種細(xì)胞鋪27個(gè)孔。確保24孔板內(nèi)的細(xì)胞均勻分布后輕放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至密度達(dá)80%～90%且狀態(tài)良好，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行梯度轉(zhuǎn)染。每種細(xì)胞為1個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)，分為3個(gè)組：空白組、空質(zhì)粒組和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組，空質(zhì)粒組和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組分別設(shè)定4個(gè)濃度梯度，DNA(μg)∶Lipofectamine 2000(μL)分別為1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5和1∶2.0。每個(gè)單獨(dú)的試驗(yàn)設(shè)定3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 熒光蛋白表達(dá)情況的檢測(cè)及轉(zhuǎn)染效率的評(píng)價(jià) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后觀察并拍攝24孔板中的各組細(xì)胞在熒光顯微鏡100倍視野下的圖像；轉(zhuǎn)換為200倍視野，記錄每孔隨機(jī)5個(gè)視野中細(xì)胞總數(shù)和帶有綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，參照文獻(xiàn)[4]計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染效率/%=(帶有綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.6 Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá) 收取4種細(xì)胞空質(zhì)粒組和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中以DNA(μg)∶Lipofectamine 2000(μL)為1∶2.0的比例轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞蛋白，以4∶1的比例加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃金屬浴煮10 min，冰浴冷卻后，進(jìn)行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)膜。以抗GFP的鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)為一抗，以HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的方式表示。采用GraphPad Prism 7軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 真核重組熒光質(zhì)粒pEGFP-N1-EtHP的構(gòu)建 以E.tenella第2代裂殖子cDNA為模板，用含有SacI和SacⅡ酶切位點(diǎn)的特異性引物擴(kuò)增后經(jīng)凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)有與預(yù)期大小一致的目的條帶，約為450 bp(圖1A)。菌液PCR鑒定結(jié)果顯示，選取的4個(gè)單菌落均為陽性(圖1B)。測(cè)序結(jié)果分析顯示，EtHP基因插入到pEGFP-N1中，無移碼和突變。

圖1 Et HP基因和菌液的PCR擴(kuò)增

2.2 熒光蛋白表達(dá)情況的檢測(cè) 去內(nèi)毒素提取的pEGFP-N1-EtHP轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞、Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞和HD-11細(xì)胞，其中質(zhì)粒與Lipofectamine 2000的比例分為4個(gè)梯度：1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5和1∶2.0。轉(zhuǎn)染48 h后在熒光顯微鏡下觀察到，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組均出現(xiàn)綠色熒光(圖2F～2I)，空白組未出現(xiàn)綠色熒光(圖2E),表明真核重組熒光質(zhì)粒均轉(zhuǎn)染至4種細(xì)胞內(nèi)并成功表達(dá)。

2.3 轉(zhuǎn)染率的評(píng)價(jià) 在同一種細(xì)胞中，隨著Lipofectamine 2000脂質(zhì)體濃度增加，綠色熒光明顯增多，即轉(zhuǎn)染效率升高(圖2，表1)。在DNA(μg)與Lipofectamine 2000(μL)比例相同的情況下，真核重組熒光質(zhì)粒在DF-1細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率均顯著高于其他3種細(xì)胞(P<0.05)；在 DNA(μg)與Lipofectamine 2000(μL)比例為1∶2.0時(shí)，真核重組質(zhì)粒在DF-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率最高(表1)。

2.4 Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá) 4種細(xì)胞蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組均在43.5 kDa處均有清晰的特異條帶，證明EtHP蛋白在4種細(xì)胞中均得到表達(dá)。

圖3 Western blot檢測(cè)

3 討論

本試驗(yàn)采用DNA重組技術(shù)將EtHP基因插入pEGFP-N1載體后在不同細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，通過直觀地觀察表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞數(shù)的多少來計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，簡易地篩選出目的基因高效表達(dá)的細(xì)胞。

pEGFP-N1作為表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn)即可以通過倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)量來計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，簡便、高效和可靠地檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效果和表達(dá)情況[5-6]。細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)作為分析基因產(chǎn)物或外源基因的功能的一個(gè)最重要工具[7]，被廣泛應(yīng)用。本試驗(yàn)采用目前常用的Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式，操作較為簡便。在轉(zhuǎn)染過程中，化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性往往可以影響轉(zhuǎn)染效率[8]。Dass[9]研究表明，試劑與質(zhì)粒的比例和細(xì)胞的類型不同均可產(chǎn)生不同的細(xì)胞毒性。因此，本試驗(yàn)不僅將DNA(μg)與Lipofectamine 2000(μL)的比例分為4個(gè)梯度：1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5和1∶2.0，而且選擇了4種不同的細(xì)胞：DF-1細(xì)胞、Vero細(xì)胞、BHK細(xì)胞和HD-11細(xì)胞。DF-1細(xì)胞[10-12]和HD-11細(xì)胞[13]是雞球蟲研究中最普遍使用的宿主細(xì)胞，BHK細(xì)胞[14]和Vero細(xì)胞[15]常被選為真核重組質(zhì)粒蛋白表達(dá)細(xì)胞。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定程度上，脂質(zhì)體濃度的增加可以提高轉(zhuǎn)染效率；脂質(zhì)體濃度較低時(shí)，細(xì)胞毒性雖然較小但轉(zhuǎn)染效率極低；BHK細(xì)胞和HD-11細(xì)胞即使增加脂質(zhì)體的濃度，轉(zhuǎn)染效率也未見很大幅度的提升，這與其他學(xué)者的研究結(jié)論不一致[16-17]，可能是由于細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)、質(zhì)粒的大小、培養(yǎng)基與血清的質(zhì)量以及轉(zhuǎn)染混合液與細(xì)胞的接觸時(shí)間長短不同，因此轉(zhuǎn)染效率也有所不同。無論DNA(μg)與Lipofectamine 2000(μL)的比例為多少，DF-1細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率都較其他細(xì)胞高，Vero細(xì)胞其次；當(dāng)DNA(μg)與Lipofectamine 2000(μL)的比例為1∶2.0時(shí)，DF-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率顯著升高(P<0.05，表1)。同時(shí)綠色熒光的多少也更直觀的反映了轉(zhuǎn)染效率的高低(圖2)。因此，DF-1細(xì)胞可作為真核熒光重組質(zhì)粒pEGFP-N1-EtHP的高效轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

圖2 轉(zhuǎn)染后48 h綠色熒光蛋白表達(dá)情況(100×，標(biāo)尺=10 μm)

表1 重組熒光質(zhì)粒在不同細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率

國內(nèi)有關(guān)同一外源基因轉(zhuǎn)入不同細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的研究報(bào)道尚少。本試驗(yàn)通過簡單的轉(zhuǎn)染效率評(píng)價(jià)，篩選出了pEGFP-N1-Et HP的高效轉(zhuǎn)染細(xì)胞即DF-1細(xì)胞，為下一步Et HP蛋白在柔嫩艾美爾球蟲入侵細(xì)胞過程中作用的研究提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。