郭藝偉 ， 劉依山 ， 包永占 ， 潘興亮 ， 王玉田 ， 鄭瑞峰

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 河北 保定 071000 ； 2. 北京市畜牧總站 ， 北京 朝陽 100107)

抗生素治療動物疾病的高效性使其在養(yǎng)殖過程中占著舉足輕重的地位。近年來，抗生素濫用[1]導(dǎo)致耐藥菌株出現(xiàn)，破壞生態(tài)系統(tǒng)，影響畜禽產(chǎn)品品質(zhì)，人類作為動物源性食品的終端消費者，身體健康受到損害，因此迫切需要尋找替抗物質(zhì)。益生菌是近年來的研究熱點之一，其主要通過提高飼料營養(yǎng)的利用率、免疫調(diào)節(jié)能力及調(diào)節(jié)腸道環(huán)境等為宿主動物機體健康發(fā)揮益生作用[2-3]。芽孢桿菌作為飼用益生菌[4]，具有增殖快、抗逆性強、抗菌譜廣、生物安全性高，在惡劣環(huán)境中產(chǎn)生孢子，能分泌豐富的酶類及產(chǎn)生抗菌活性很強的次級代謝產(chǎn)物等優(yōu)勢，有促生長、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡、抗菌、提高抵抗力的作用。貝萊斯芽孢桿菌是2005年被西班牙學(xué)者發(fā)現(xiàn)的一種新型生防菌[5]，目前被廣泛用于生防[6]、化工、醫(yī)療、洗滌等領(lǐng)域[7-8]，尤其在植物健康[9]與病蟲害防控方面研究較廣，但應(yīng)用于畜禽的研究很少[10]。本試驗通過對貝萊斯芽孢桿菌的益生特性研究，分析其成為潛在的益生菌應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 指示菌：大腸埃希菌，ATCC25922-G2；金黃色葡萄球菌，ATCC6538-G2。蚯蚓，采自北京市奧林匹克公園；SPF級KM小鼠，購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器 生化培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器，均購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；酶標(biāo)儀，購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；PCR儀，購自上海坤科儀器設(shè)備有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，購自普若森生物科技(上海)有限公司。

1.3 主要試劑 VETEC瓊脂粉、藥敏試紙片，均購自美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，均購自南京建成生物科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株分離純化及鏡檢 將蚯蚓置于75%酒精中做體表消毒，沿其體表剪開在LB培養(yǎng)基上涂布，培養(yǎng)12～24 h，將培養(yǎng)出的細(xì)菌純化2～3代，將單菌落接入LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12～18 h，將該分離菌命名為Y1，觀察Y1菌的顏色、形態(tài)等。對培養(yǎng)12 h的Y1菌進(jìn)行革蘭染色并在光學(xué)顯微鏡下鏡檢，利用成像系統(tǒng)拍照；使用掃描電鏡Hitachi SU8010進(jìn)行菌體形態(tài)觀察。

1.4.2 生理生化鑒定 根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(9版)對Y1菌的種屬進(jìn)行初步鑒定。

1.4.3 分子生物學(xué)鑒定 對Y1菌進(jìn)行16S rRNA基因序列測序，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4.4 繪制生長曲線 將Y1菌按1%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基，200 r/min培養(yǎng)30 h，每隔3 h取樣并檢測菌液OD600值，以時間t為橫坐標(biāo)、OD600值為縱坐標(biāo)繪制Y1菌的生長曲線。

1.4.5 胃腸液耐受試驗 人工胃液、人工腸液按照《中國藥典》2015年版第四部[11]配制。取菌懸液分別加到人工胃液和人工腸液中，180 r/min培養(yǎng)10 h，每隔2 h取樣進(jìn)行平板菌落計數(shù)，計算存活率。存活率(%)=Nt/N0×100%，其中Nt為結(jié)束時的活菌數(shù)，N0為起始時的活菌數(shù)。

1.4.6 膽鹽耐受試驗 將菌懸液按1%接種量接種到含有0.3%牛膽鹽的液體培養(yǎng)基中，以不含牛膽鹽的試管作為對照管，培養(yǎng)10 h，每隔1 h取樣，測定OD600值，繪制生長曲線。

1.4.7 藥敏試驗 將含有定量抗生素的藥敏紙片(直徑為6 mm)，放在涂有菌液的培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

1.4.8 體外抑菌試驗 試驗方法參照牛津杯法[12]，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

1.5 動物安全性試驗 對照組與試驗組各5只小鼠，試驗組小鼠飼喂新鮮菌液，對照組常規(guī)飼養(yǎng)，觀察記錄小鼠的精神、行動、體重、食欲、排泄等變化。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離純化及鏡檢 如圖1所示，Y1菌在TSA培養(yǎng)基上的菌落呈黃色，圓形，表面濕潤，不透明，邊緣整齊，在液體培養(yǎng)基形成薄菌膜；鏡檢菌體為短桿狀，可產(chǎn)生芽孢。

圖1 Y1菌的菌落形態(tài)、革蘭染色鏡檢和掃描電鏡結(jié)果

2.2 生理生化鑒定 結(jié)果見表1，Y1菌能夠利用葡萄糖、甘露醇、D-棉子糖、果糖、麥芽糖、古老糖、D-海藻糖、D-核糖；能水解淀粉和七葉苷，產(chǎn)生明膠酶和過氧化氫酶，能在6.5%的氯化鈉中生長；不能產(chǎn)生硫化氫，不能利用L-鼠李糖、D-松三糖和D-半乳糖。

表1 Y1菌生理生化鑒定結(jié)果

2.3 分子生物學(xué)鑒定 Y1菌的16S rRNA基因序列目的條帶電泳結(jié)果如圖2所示，基因片段約為1 500 bp。 將Y1菌16S rRNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，Y1菌與多個芽孢桿菌基因序列匹配度較高(圖3)。將Y1菌GyrB基因序列進(jìn)行比對，又與其近種序列進(jìn)行相似性比較后發(fā)現(xiàn)，其與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)的同源性最高，相似率達(dá)99.93%(圖4)。

圖2 Y1菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

圖3 Y1菌16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 Y1菌GyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 生長曲線分析 對Y1菌生長進(jìn)行檢測，如圖5所示，Y1菌遲緩期很短，6～12 h為對數(shù)期，15～27 h處于穩(wěn)定期且時間較長，27 h后進(jìn)入衰退期。

圖5 Y1菌生長曲線

2.5 耐胃腸液分析 結(jié)果如表2所示，Y1菌在人工胃腸液中活菌數(shù)隨孵育時間延長呈逐漸遞減趨勢，孵育10 h的活菌數(shù)顯著降低(P<0.05)，Y1菌在人工胃液、腸液中培養(yǎng)10 h存活率分別達(dá)到60.40% 和61.60%，說明Y1菌對人工胃液和人工腸液有較好的耐受性，能夠抵御胃蛋白酶和胰蛋白酶的破壞。

表2 Y1菌耐人工胃、腸液結(jié)果

2.6 耐膽鹽分析 Y1菌在含有0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中生長呈遞增趨勢(圖6)，隨著孵育時間延長活菌數(shù)顯著增高(P<0.05)(表3)，表明Y1菌對0.3%膽鹽有較好的耐受性，而動物小腸中膽汁鹽含量波動范圍在0.03%～0.3%，說明Y1菌可以在腸道中存活。

表3 Y1菌耐膽鹽結(jié)果

圖6 Y1菌耐膽鹽結(jié)果

2.7 藥敏試驗分析 由表4可知，Y1菌對環(huán)丙沙星、頭孢羥氨芐、氟苯尼考、替米考星和慶大霉素高度敏感，尤其是頭孢羥氨芐，其抑菌直徑可達(dá)到40 mm；對氨芐西林、羥氨芐青霉素和青霉素G耐藥，說明Y1菌對大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類藥物都有抗性。

表4 Y1菌藥敏試驗結(jié)果

2.8 抑菌特性分析 Y1菌對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌都有顯著抑制效果(圖7)。對大腸埃希菌的抑菌圈直徑達(dá)到(21.33±1.53)mm(P<0.05)，對金黃色葡萄球菌可達(dá)(15.67±1.53)mm(P<0.05)，如表5所示。

圖7 Y1菌對大腸埃希菌(A)和金黃色葡萄球菌(B)抑菌結(jié)果

表5 抑菌試驗結(jié)果

2.9 動物安全性試驗 試驗組小鼠均未出現(xiàn)死亡或患病情況，精神狀態(tài)和行為活動均正常，被毛良好不粗糙，采食、飲水、排泄均正常，證明分離菌株安全。

3 討論

本試驗從蚯蚓體內(nèi)篩選細(xì)菌時發(fā)現(xiàn)1株生長快、菌落大且周圍不長霉菌的芽孢桿菌，經(jīng)16S rRNA基因序列鑒定及生理生化試驗確定該菌為貝萊斯芽孢桿菌。動物胃腸道菌群隨著胃腸液的pH變化而變化，同時胃腸液內(nèi)又含有胃蛋白酶、胰蛋白酶、膽鹽等物質(zhì)，貝萊斯芽孢桿菌Y1若在胃腸道增殖，就要耐受胃腸道環(huán)境，保證有足夠的活菌數(shù)發(fā)揮作用。本試驗結(jié)果顯示，Y1菌6～12 h增殖較快，12～27 h生長穩(wěn)定，且對胃腸液和膽鹽的耐受效果較好，能抵御消化道胃蛋白酶、胰蛋白酶和膽汁的破壞，保證了Y1菌在腸道內(nèi)能夠迅速增殖，為其在畜禽腸道發(fā)揮作用提供時間基礎(chǔ)。相比劉韶娜等[13]研究的貝萊斯芽孢桿菌B13在16～24 h處于穩(wěn)定期，Y1菌的穩(wěn)定期更長；高艷俠等[14]研究表明貝萊斯芽孢桿菌LF01在不同鹽度下均于14～16 h達(dá)到穩(wěn)定期，Y1菌的穩(wěn)定期比其更長；表明Y1菌在腸道內(nèi)有足夠的時間增殖并產(chǎn)生酶類及次級代謝產(chǎn)物，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境的作用。

在畜禽養(yǎng)殖過程中，抗生素濫用造成了耐藥菌株的產(chǎn)生，益生菌是一種優(yōu)質(zhì)飼料添加劑，益生菌與抗生素若要聯(lián)合使用必須考慮兩者有無拮抗作用。本試驗結(jié)果顯示，貝萊斯芽孢桿菌Y1對環(huán)丙沙星、頭孢羥氨芐、氟苯尼考、替米考星和慶大霉素高度敏感，在飼喂畜禽益生菌添加劑時應(yīng)避免使用此類敏感藥物；對羥氨芐青霉素、青霉素G、氨芐西林不敏感，兩者可以配合使用。張小波等[15]分離的鴨源貝萊斯芽孢桿菌GZZY2019同樣對青霉素和氨芐西林耐藥。貝萊斯芽孢桿菌Y1是否攜帶對β-內(nèi)酰胺類抗生素的耐受基因還有待研究。

本試驗結(jié)果顯示，Y1菌能抑制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的生長繁殖。劉韶娜等[13]研究表明，貝萊斯芽孢桿菌B13不僅能抑制這2種細(xì)菌，還對鼠傷寒沙門菌有抑制效果，且能提高豬腸道內(nèi)乳桿菌屬等益生菌的相對豐度，顯著降低鏈球菌屬等條件致病菌的相對豐度[16]，相比之下Y1菌對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果要優(yōu)于B13菌。Nannan等[17]從雞糞中分離的貝萊斯芽孢桿菌CN026對大腸埃希菌、腸炎沙門菌、空腸彎曲桿菌和李斯特菌均有抑制作用。研究表明，貝萊斯芽孢桿菌發(fā)揮抑菌作用的物質(zhì)主要為脂肽類抗生素、抗菌肽、聚酮類化合物[18]，Y1菌的抑菌活性物質(zhì)還有待發(fā)掘。本試驗為貝萊斯芽孢桿菌Y1應(yīng)用于畜禽生產(chǎn)提供理論支持，其有望成為一種潛在的益生菌添加劑。