劉衍芬 ， 瞿健萍

(遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院畜牧獸醫(yī)學院 ， 遼寧 營口 115009)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是以嘔吐、腹瀉為主的仔豬疾病，其傳播迅速，死亡率高，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[1-3]。目前防制該病尚無有效的疫苗，治療方法主要包括返飼、卵黃抗體及中草藥治療等。Liu等[4]采用慢病毒系統(tǒng)將豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus， PEDV)編碼的纖突蛋白主要抗原區(qū)(S1)在PK-15細胞中穩(wěn)定表達，免疫雞后制備PEDV卵黃抗體(IgY)用于預(yù)防和治療PEDV感染，療效顯著，但制備工藝復(fù)雜，成本高。在實際臨床中，規(guī)模化豬場于PED發(fā)病期間采取發(fā)病仔豬小腸組織返飼給母豬的方法對該病進行防控，雖然能夠顯著降低出生仔豬的腹瀉率和死亡率，但這一方法容易成為引發(fā)豬場其他疫病的高風險因素[5]。

目前，很多研究表明中草藥制劑對治療豬流行性腹瀉有顯著效果[6-7]。其中，穿心蓮具有清熱解毒、抗菌消炎、保肝利膽等作用[8]，并可通過影響細胞中Toll樣受體3(Toll-like receptor 3，TLR3)的表達，調(diào)節(jié)其干擾素-β(Interferon-β，IFN-β)的產(chǎn)生，從而提高機體的抗病毒天然免疫功能[9]。而PEDV感染細胞后主要通過抑制干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferon regulatory factor 3，IRF3)的產(chǎn)生，干擾TLR3/IFN-β信號通路，導致IFN-β無法產(chǎn)生[10]，造成細胞的抗病毒天然免疫功能受損。穿心蓮的功效正與PEDV致病機制形成對抗，推測穿心蓮可通過干擾TLR3/IFN-β信號通路轉(zhuǎn)導來發(fā)揮抵抗PEDV感染的作用。本試驗以穿心蓮為主藥，配合具有健胃解毒功能的無花果、澀腸止痢功能的大青葉和馬齒莧，制備中藥復(fù)方水煎液，評價其對人工感染PEDV仔豬的治療效果，旨在探討穿心蓮中藥復(fù)方(Andrographispaniculatacompound, APC)抗PEDV感染的分子機制，以期為有效防治PEDV感染提供新思路與參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗藥物 以穿心蓮為主藥，配合無花果、大青葉、馬齒莧等，配制中藥復(fù)方水煎液，經(jīng)仔豬急性毒性試驗證明無毒性作用，經(jīng)臨床治療試驗確定其使用劑量為2 mL/(kg·bw)[11]。楊樹花口服液(批號：160602，主要成分楊樹花)，購自芮城綠滿生物藥業(yè)有限公司

1.2 試驗毒株 PEDV病毒液(CV777株)，由北京偉嘉集團惠贈。

1.3 主要儀器及試劑 生化分析儀，型號為邁瑞B(yǎng)S-120，由邁瑞公司生產(chǎn)；熒光定量PCR儀，型號為BIO-RAD miniQ，由BIO-RAD公司生產(chǎn)。豬流行性腹瀉病毒實時定量PCR檢測試劑盒(Real PCRTMPEDV RNA Test)，由IDEXX公司生產(chǎn)；DNA Master SYBR Green I熒光定量PCR染料，由Roche公司生產(chǎn)；Advantage?RT-for-PCR 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，由寶生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)；豬Tank 結(jié)合激酶1 ELISA試劑盒(Procine TBK-1 ELISA Kit)和豬干擾素-β ELISA試劑盒(Procine IFN-β ELISA Kit)，均由上海酶聯(lián)生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.4 實驗動物 經(jīng)試劑盒檢測無PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染的健康母豬所產(chǎn)3 日齡體重相同的健康杜洛克×(約克夏×長白)三元雜交仔豬40頭，由遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院種豬場提供，采用代乳粉飼喂，受試期間飼養(yǎng)管理條件一致。

1.5 引物 根據(jù)NCBI提供序列設(shè)計引物，通過實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法擴增豬IRF3、IFN-β和β-actin基因。引物由寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)合成，引物序列信息見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.6 試驗分組與試驗設(shè)計 將40頭3日齡仔豬隨機分成4個組，每組10頭，分別為穿心蓮中藥復(fù)方治療組、對照藥物治療組、感染不治療組和空白對照組。前3組均為PEDV感染組，仔豬均在3日齡時灌服PEDV細胞培養(yǎng)液2.5 mL (106.5TCID50)，空白對照組與其隔離飼養(yǎng)。記錄各組出現(xiàn)嘔吐或腹瀉癥狀的時間，癥狀出現(xiàn)后，采樣進行PEDV的qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示陽性即開始使用藥物治療。穿心蓮中藥復(fù)方治療組在仔豬發(fā)病后經(jīng)口灌服中藥組方水溶液，按2 mL/(kg·bw)，2次/d，連用3 d。對照藥物治療組在仔豬發(fā)病后經(jīng)口灌服楊樹花口服液，按照說明書每頭口服2.5 mL，1次/d，連用3 d。感染不治療組不采取任何藥物治療，按2 mL/(kg·bw)灌服生理鹽水，2次/d，連用3 d。觀察仔豬人工感染PEDV后的臨床表現(xiàn)，判定療效。用藥3 d后每組隨機選擇5頭存活仔豬，前腔靜脈采集全血10 mL，然后放血致死，無菌采集空腸組織，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 PEDV的qRT-PCR檢測 當穿心蓮中藥復(fù)方治療組、對照藥物治療組、感染不治療組仔豬被灌服PEDV病毒液12 h后，采集各組仔豬直腸糞便樣本，使用試劑盒進行PEDV檢測，結(jié)果判定：當Ct值<38判定為陽性；當Ct值>38判定為陰性。

1.8 療效判定 治愈：仔豬嘔吐、腹瀉停止，食欲恢復(fù)至空白對照組，精神狀態(tài)和糞便恢復(fù)正常，血液指標正常。有效：除完全治愈者外，用藥后仔豬嘔吐、腹瀉程度減輕，食欲增強但未達到空白對照組食量。無效或死亡：試驗期間經(jīng)治療仍無好轉(zhuǎn)或死亡，剖檢病變明顯且qRT-PCR結(jié)果呈陽性。有效率為治療有效的仔豬頭數(shù)占所有仔豬頭數(shù)的百分比。治愈率為治療痊愈的仔豬頭數(shù)占所有仔豬頭數(shù)的百分比。

1.9 生化指標的檢測 將采集仔豬全血于3 000 g 離心 5 min后取血清，用生化分析儀測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、肌酸激酶(CK)活性，總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、總膽紅素(T-BIL)、血液尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)、葡萄糖(GLU)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、磷(PHOS)含量。

1.10 TLR3/IFN-β信號通路關(guān)鍵因子表達水平的檢測

1.10.1 樣品總RNA提取 按照試劑盒說明書提取空腸組織中的總RNA。

1.10.2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 將提取的RNA定量為10 μg(20 μL)，置于PCR反應(yīng)管中，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將空腸組織內(nèi)總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.10.3IRF3和INF-β的基因表達水平的檢測 采用qRT-PCR法檢測，擴增體系(20 μL)：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.2 μL，DNA Master SYBR Green I 10 μL，上、下游引物各0.6 μL，ddH2O 7.6 μL。擴增條件：50 ℃ 5 min； 95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.10.4 qRT-PCR結(jié)果數(shù)據(jù)分析 利用Light-Cycler?96 SW 1.1軟件，以β-actin基因為內(nèi)參基因，進行目的基因 mRNA 表達水平相對定量分析，最后采用 2-ΔΔCt法進行計算，其中：△△Ct=(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)穿心蓮中藥復(fù)方治療組/對照藥物治療組/感染不治療組-(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)空白對照組。

1.10.5 IRF3的蛋白表達水平的檢測 采用Western blot法檢測，根據(jù) IP 裂解液操作說明書提取仔豬空腸組織中的蛋白，稱取1 g組織樣品，剪碎，加入含1 mmol/L PMSF的裂解液5 mL，勻漿至充分裂解。12 000 g 離心 5 min，上清液即為組織蛋白樣品。將組織蛋白樣品與2×SDS 上樣緩沖液1∶1 混合后，煮沸 10 min，冰上放置2 min，1 000 r/min 離心5 min，提取樣品后用12% SDS-PAGE進行蛋白分離，之后轉(zhuǎn)印到 NC 膜上，進行 Western blot 分析。NC膜用5%的牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉1 h后加一抗4 ℃孵育過夜。次日，用 TBST 緩沖液洗滌 3次， 加入二抗，室溫孵育1 h，TBST 緩沖液洗滌3次后，ECL 化學發(fā)光法檢測蛋白的表達。

1.10.6 Tank結(jié)合激酶1(Tank binding kinase-1，TBK-1)和INF-β含量的測定 取空腸組織樣品5 g研磨后4 ℃ 3 000g離心10 min，取上清，ELISA法測定其中TBK-1和IFN-β的含量，操作按照試劑盒說明書進行。

1.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 所得數(shù)據(jù)使用軟件SPSS 22.0分析，數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示，采用單因素方差分析比較各組的差異。P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 治療效果

2.1.1 仔豬人工感染PEDV后的臨床表現(xiàn) 穿心蓮中藥復(fù)方治療組、對照藥物治療組和感染不治療組仔豬均在灌服PEDV病毒液12 h后出現(xiàn)嘔吐、黃白色水樣腹瀉等癥狀，精神沉郁，食欲下降。感染不治療組在發(fā)病3 d后共出現(xiàn)4頭仔豬死亡。空白對照組食欲、精神狀態(tài)正常，無嘔吐、腹瀉癥狀。

2.1.2 PEDV的qRT-PCR檢測 穿心蓮中藥復(fù)方治療組、對照藥物治療組和感染不治療組仔豬在灌服PEDV病毒液12 h后，采集各組仔豬直腸糞便樣本，使用豬流行性腹瀉病毒實時定量PCR檢測試劑盒對樣本進行檢測，其結(jié)果均為陽性，空白對照組結(jié)果為陰性。

2.1.3 穿心蓮中藥復(fù)方治療PEDV感染的效果 結(jié)果如表2所示，穿心蓮中藥復(fù)方治療組仔豬嘔吐、腹瀉癥狀均有明顯緩解，食欲上升，有效率達100%；對照藥物治療組有效率為40%；感染不治療組在人工感染72 h死亡4頭仔豬，其他豬只表現(xiàn)出PEDV感染特征癥狀。經(jīng)藥物治療后穿心蓮中藥復(fù)方治療組仔豬PEDV的qRT-PCR檢測結(jié)果均為陰性；對照藥物治療組仔豬PEDV的qRT-PCR檢測結(jié)果顯示60%為陽性；感染不治療組仔豬PEDV的qRT-PCR檢測結(jié)果均為陽性；空白對照組均為陰性。

表2 穿心蓮中藥復(fù)方水煎液治療效果

2.1.4 穿心蓮中藥復(fù)方治療PEDV感染仔豬血液生化指標變化 結(jié)果如表3所示，穿心蓮中藥復(fù)方治療組仔豬血清中ALT、AST、ALP含量極顯著低于對照藥物治療組、感染不治療組和空白對照組(P<0.01)，對照藥物治療組TP含量顯著低于其他3個組(P<0.05)，感染不治療組仔豬血清中ALB、GLU含量極顯著低于其他3個組(P<0.01)。感染不治療組血清中T-BIL、CREA、BUN、CK含量極顯著高于其他3個組(P<0.01)。穿心蓮中藥復(fù)方治療組仔豬血清中Ca、PHOS含量與空白對照組差異不顯著(P>0.05)，Mg含量極顯著高于其他3個組(P<0.01)。

表3 穿心蓮中藥復(fù)方水煎液治療PEDV感染仔豬血液生化指標變化

2.2 TLR3/IFN-β信號通路相關(guān)因子表達水平檢測

2.2.1IRF3和INF-β的mRNA表達水平 結(jié)果如圖1、圖2所示，穿心蓮中藥復(fù)方治療組仔豬空腸組織中IRF3和IFN-β的mRNA表達顯著高于對照藥物治療組和感染不治療組(P<0.01)。感染不治療組空腸組織中IRF3的mRNA表達顯著低于其他3個組(P<0.01)。

圖1 穿心蓮中藥復(fù)方水煎液治療后仔豬空腸組織中IRF3的mRNA表達水平

圖2 穿心蓮中藥復(fù)方水煎液治療后仔豬空腸組織中IFN-β的mRNA表達水平

2.2.2 IRF3的蛋白表達水平 結(jié)果如圖3所示，穿心蓮中藥復(fù)方治療組仔豬體空腸組織中IRF-3的蛋白表達水平顯著高于對照藥物治療組和感染不治療組。

圖3 穿心蓮中藥復(fù)方水煎液治療后仔豬空腸組織中IFR3蛋白表達

2.2.3 TBK-1和INF-β的含量 TBK-1結(jié)果如圖4所示，穿心蓮中藥復(fù)方治療組仔豬空腸組織中TBK-1的含量明顯高于其他3個組，差異極顯著(P<0.01)。對照藥物治療組空腸組織中TBK-1含量高于感染不治療組，低于空白對照組，但差異不顯著(P>0.05)。感染不治療組空腸組織中TBK-1含量與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)。

圖4 穿心蓮中藥復(fù)方水煎液治療后仔豬空腸組織中TBK-1的含量

INF-β結(jié)果如圖5所示，穿心蓮中藥復(fù)方治療組仔豬空腸組織中IFN-β的含量明顯高于其他3個組，差異極顯著(P<0.01)。對照藥物治療組空腸組織中IFN-β含量低于感染不治療組，但差異不顯著(P>0.05)。感染不治療組空腸組織中IFN-β含量與空白對照組相比差異顯著(P<0.05)。

圖5 穿心蓮中藥復(fù)方水煎液治療后仔豬空腸組織中IFN-β的含量

3 討論

穿心蓮為爵床科植物，味苦、性寒，是一種良好的中藥藥材，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、解熱以及增強免疫等功效，有“中藥抗生素”之稱[12]。在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中，穿心蓮經(jīng)常被用于代替抗生素來治療疾病。無花果具有健胃消食、止瀉痢、治五痔等功效。大青葉、馬齒莧具有清熱解毒、澀腸止痢的功效。本試驗將以上中草藥組成復(fù)方以治療PEDV引起的仔豬腹瀉。王亞欣等[13]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合中草藥制劑對豬流行性腹瀉具有良好的治療效果并改善了仔豬生長性能。楊久春等[14]研究中藥復(fù)方制劑和西藥在治療人工感染PEDV仔豬中的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方對人工感染PEDV仔豬的治療效果顯著，且明顯優(yōu)于西藥。李林[6]研究表明中草藥復(fù)方藥劑能有效治療豬流行性腹瀉，提升仔豬存活率，降低死亡風險。在本試驗中，穿心蓮中草藥復(fù)方治療仔豬PED療效顯著，仔豬嘔吐、腹瀉癥狀均有明顯緩解，食欲上升，有效率達100%，高于對照藥物組，且無仔豬死亡，提示該中藥復(fù)方水煎液能抑制仔豬PEDV的感染。

血液生化指標可反映動物機體的代謝水平、健康狀況以及生產(chǎn)性能，大量研究證明，中藥復(fù)方可有效改善仔豬體內(nèi)物質(zhì)代謝水平，提高生產(chǎn)性能和健康狀況[15]。卓秀萍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，感染PEDV仔豬的心臟、肝臟和腎臟功能均受到損害，組織學檢查主要表現(xiàn)為心肌細胞水腫，腎小球腫脹，腎實質(zhì)細胞顆粒變性，腎小管上皮細胞腫脹，肝細胞顆粒變性等。當肝組織發(fā)生病變或受到損傷后，肝細胞內(nèi)的ALT和AST釋放到血漿中，引起ALT和AST水平升高。同時，肝細胞過度產(chǎn)生ALP，反流入血液引起ALP升高，T-BIL也會升高。ALB由肝臟產(chǎn)生，為血漿蛋白主要組成部分，其功能為維持血漿膠體滲透壓和體內(nèi)代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運，當肝臟功能受損時ALB分泌減少。血清中的ALT、AST和ALP常作為肝臟疾病的檢查指標。3種酶活性的升高，都代表肝臟受到損害。杜海江[17]研究表明自擬復(fù)方中草藥超微粉可改善仔豬血液生化指標，增強斷奶仔豬血液的抗氧化性，有效降低仔豬疾病的發(fā)生。鄧文瓊[18]研究了穿心蓮超微粉對三黃雞的保健作用及其機理，結(jié)果表明，與空白對照組相比，試驗第70天時穿心蓮超微粉組中的ALT、AST和ALP含量明顯降低。本試驗結(jié)果顯示，穿心蓮中藥復(fù)方治療組仔豬血清中ALT、AST和ALP含量低于對照藥物治療組、感染不治療組和空白對照組，提示穿心蓮中藥復(fù)方治療可減輕PEDV造成的肝臟損傷。感染不治療組仔豬血清中的ALB和GLU含量最低，T-BIL含量最高，這與PEDV感染對肝臟造成損傷的研究結(jié)果相符。TP含量高有利于提高代謝水平和免疫力，促進動物機體健康生長。李江北等[19]研究指出，穿心蓮內(nèi)酯干混懸劑顯著增加了人工感染大腸埃希菌雞體內(nèi)的TP含量。本試驗結(jié)果顯示，穿心蓮中藥復(fù)方治療組仔豬血清中TP含量最接近空白對照組，提示在治療PEDV感染的過程中穿心蓮中藥復(fù)方可能在保護肝臟、提高機體免疫機能方面發(fā)揮著重要作用。

腎臟是維持體液平衡、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵器官。當腎臟功能受損時，在腎實質(zhì)受到嚴重損傷時CREA、BUN含量會急劇上升，體液中的離子將發(fā)生變化，可引發(fā)低血鈣癥，磷排泄障礙等問題。本試驗中感染不治療組仔豬的CREA、BUN含量均高于其他組，血液中Ca含量最低，說明其血鈣水平低，病情嚴重，且磷排泄水平降低，證明腎臟在感染PEDV發(fā)病的過程中受到損傷。相比較而言，中藥復(fù)方治療組Ca、PHOS含量與空白對照組差異不顯著，說明該復(fù)方對腎臟功能具有保護作用。

血清中的CK活性經(jīng)常被用來評估心肌損害程度。本試驗中與空白對照組相比，穿心蓮中藥復(fù)方治療組的CK活性更接近于正常值，說明該中藥復(fù)方可發(fā)揮保護心肌的作用，而感染不治療組心肌損傷最嚴重。本試驗中穿心蓮中藥復(fù)方在治療PEDV感染仔豬的過程中發(fā)揮了調(diào)節(jié)機體代謝功能，保護肝臟、腎臟和心臟的作用。

一些病毒能夠在感染初期通過干擾IFN-β的產(chǎn)生來逃避宿主的免疫應(yīng)答[20-21]，與PEDV同屬冠狀病毒科的TGEV感染后可誘導機體產(chǎn)生IFN-β[22]，而PEDV卻抑制IFN-β的產(chǎn)生[23]。原因為PEDV在復(fù)制過程中產(chǎn)生的dsRNA由TLR3識別并募集β-干擾素TRI結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)，但此時TBK-1含量和IRF3表達均受到抑制，從而導致IFN-β 表達減少，說明PEDV通過干擾IRF3的活性而阻止了IFN-β的產(chǎn)生，進而逃避宿主的天然免疫機制。楊云喬[24]研究表明中藥復(fù)方治療組仔豬空腸組織中IFN-β的mRNA表達水平顯著升高。在本試驗中，穿心蓮中藥復(fù)方治療組仔豬空腸組織中IRF3和IFN-β的mRNA表達水平最高，進一步分析穿心蓮中藥復(fù)方水煎液對人工感染PEDV仔豬空腸組織細胞內(nèi)的IRF-3蛋白表達，發(fā)現(xiàn)穿心蓮中藥復(fù)方水煎液能促進IRF-3的蛋白表達。同樣，穿心蓮中藥復(fù)方水煎液能促進仔豬空腸組織中TBK-1和IFN-β的分泌，發(fā)揮IFN-β的抗病毒天然免疫作用，從而提高穿心蓮中藥復(fù)方水煎液抗PEDV感染的效果。

綜上，穿心蓮中藥復(fù)方水煎液可通過調(diào)節(jié)仔豬機體物質(zhì)代謝水平、緩解肝臟、腎臟、心臟的損傷；可通過調(diào)控機體IRF3的表達來抵抗PEDV感染，削弱PEDV感染對IRF3、TBK-1和IFN-β的表達抑制作用，激發(fā)機體抗病毒的天然免疫應(yīng)答，發(fā)揮治療作用。本試驗使用的穿心蓮中藥復(fù)方水煎液為基于中獸醫(yī)理論指導的整體調(diào)理方案，其抗PEDV感染的分子機制的其他信號通路還有待進一步研究。