范迎賽 ， 宮新城 ， 楊 倩 ， 張 迪 ， 趙興華 ， 王曉丹 ， 史萬玉

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)學(xué)院 ， 河北 保定 071000)

骨流失類疾病是畜禽常見病，可導(dǎo)致動物生產(chǎn)性能下降、骨骼變形、癱瘓甚至死亡，嚴(yán)重危害動物健康及養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。研究表明，氧化應(yīng)激是骨流失類疾病發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)，活性氧對骨功能性細(xì)胞(成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等)中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)具有直接或間接的影響[1]。

正常情況下，機體骨量處于動態(tài)平衡中，由成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收2個過程進(jìn)行維持，受多條細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響[2]。其中，Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)/核因子κB受體活化因子(RANK)分別是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的關(guān)鍵通路[3]。氧化應(yīng)激條件下，成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin通路受到抑制，使成骨細(xì)胞生存活性、分化活性和成骨活性均隨之下降 ； 此外，氧化應(yīng)激還會降低成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL/骨保護(hù)素(OPG)的比值，間接促進(jìn)破骨細(xì)胞的骨吸收活動[4-5]。

中獸醫(yī)理論認(rèn)為“腎主骨”，臨床中可通過補腎而抑制機體骨流失。中藥制何首烏具有補肝腎、強筋骨的功效，其主要活性成分為2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，常簡稱為二苯乙烯苷(THSG)[6]。有研究報道，THSG在體內(nèi)外試驗中均表現(xiàn)出促成骨活性，且具有較好的抗氧化能力，能夠有效減少過氧化氫(H2O2)導(dǎo)致的成骨細(xì)胞內(nèi)活性氧和丙二醛等的生成[7-8]。但是，其在氧化應(yīng)激條件下促進(jìn)成骨的作用機制尚待深入探索。本試驗使用H2O2和THSG共同作用成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1，通過檢測成骨細(xì)胞生存活力、對破骨細(xì)胞的調(diào)控功能及Wnt/β-catenin通路活化水平等，探索THSG對成骨細(xì)胞抗氧化損傷的保護(hù)作用機制，為其藥理研究及臨床開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥物及主要試劑 THSG標(biāo)準(zhǔn)品，購自國家食品藥品檢定研究院；α-MEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶，均購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)，購自以色列BI公司；細(xì)胞總RNA提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑，均購自北京全式金公司；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒，均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔源OPG抗體，購自美國Abcam公司；兔源GAPDH抗體、兔源β-tubulin抗體和HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗，均購自武漢Abclonal公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.2 細(xì)胞株 小鼠成骨樣MC3T3-E1細(xì)胞，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組及處理 MC3T3-E1細(xì)胞鋪板24 h后，細(xì)胞密度為80%～90%時，進(jìn)行試驗分組及加藥處理：(1)對照組(使用細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng))；(2)H2O2組(細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)1 h，使用含0.3 mmol/L H2O2的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng))；(3)不同濃度THSG保護(hù)組(10-3～10-5mg/mL THSG預(yù)處理1 h，使用含0.3 mmol/L H2O2及不同濃度THSG的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng))。

1.2.2 細(xì)胞生存活性檢測 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于96孔板中，THSG和0.3 mmol/L H2O2共同培養(yǎng)細(xì)胞3 d后，吸棄培養(yǎng)上清，各孔加入100 μL含1 mg/mL MTT的α-MEM培養(yǎng)基，37 ℃避光培養(yǎng)4 h。然后吸棄上清，各孔加入100 μL DMSO，避光輕柔振蕩15 min，于酶標(biāo)儀570 nm處檢測OD值。以對照組為100%，計算各組細(xì)胞相對生存活性。

1.2.3 mRNA水平檢測 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中，THSG和0.3 mmol/L H2O2共同培養(yǎng)細(xì)胞3 d后，按照說明書提取各孔細(xì)胞總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用ABI StepOnePlus儀器檢測mRNA水平，反應(yīng)體系：2 × qPCR Mix 5 μL，Rox 0.2 μL，上游引物0.2 μL，下游引物0.2 μL，cDNA 0.3 μL，滅菌雙蒸水4.1 μL，總反應(yīng)體積10 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共45個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，計算各組中目的基因的mRNA表達(dá)水平。目的基因引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 蛋白水平檢測 MC3T3-E1細(xì)胞培養(yǎng)于φ100 mm培養(yǎng)皿中，使用THSG和0.3 mmol/L H2O2共培養(yǎng)細(xì)胞1 d后，使用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，調(diào)整濃度一致后加入適量5×Loading buffer并煮沸。將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜，室溫振蕩封閉2 h后，加入相應(yīng)一抗，在4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜后洗膜。然后使用二抗室溫孵育1 h，洗膜，使用ECL法對蛋白條帶進(jìn)行顯色，使用Tanon 5200儀器采集圖像，Image J軟件分析灰度值。以GAPDH為內(nèi)參，計算蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用IBM SPSS Statistics 21軟件分析數(shù)據(jù)，在滿足方差齊和正態(tài)分布的前提下，進(jìn)行單因素方差分析和Turkey多重比較，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P< 0.05表示組間差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 THSG對H2O2作用下MC3T3-E1細(xì)胞生存活力的影響 結(jié)果如圖1所示，與對照組相比，H2O2組細(xì)胞生存活力顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，10-3～10-5mg/mL THSG保護(hù)組細(xì)胞生存活力顯著升高(P<0.05)。

圖1 THSG和H2O2對MC3T3-E1細(xì)胞生存活力的影響(n=4)

2.2 THSG對H2O2作用下MC3T3-E1細(xì)胞BadmRNA表達(dá)水平的影響 結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，H2O2組細(xì)胞BadmRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與H2O2組相比，10-4mg/mL THSG保護(hù)組細(xì)胞BadmRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，10-3mg/mL THSG保護(hù)組BadmRNA表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05)。

圖2 THSG和H2O2對MC3T3-E1細(xì)胞Bad mRNA表達(dá)水平的影響(n=3)

2.3 THSG對H2O2作用下MC3T3-E1細(xì)胞OPG和RANKL表達(dá)水平的影響OPGmRNA表達(dá)水平結(jié)果如圖3A所示，與對照組相比，H2O2組細(xì)胞OPGmRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，10-4mg/mL THSG保護(hù)組細(xì)胞OPGmRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，10-3mg/mL THSG保護(hù)組細(xì)胞OPGmRNA表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05)。OPG蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖3B所示，與對照組相比，H2O2組細(xì)胞OPG蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，10-3mg/mL和10-4mg/mL THSG保護(hù)組細(xì)胞OPG蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

圖3 THSG和H2O2對MC3T3-E1細(xì)胞OPG mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)水平的影響(n=3)

RANKLmRNA表達(dá)水平結(jié)果如圖4A所示，與對照組相比，H2O2組細(xì)胞RANKLmRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與H2O2組相比，10-3mg/mL和10-4mg/mL THSG保護(hù)組細(xì)胞RANKLmRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。OPG/RANKLmRNA比值結(jié)果如圖4B所示，與對照組相比，H2O2組細(xì)胞OPG/RANKLmRNA比顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，10-3mg/mL和10-4mg/mL THSG保護(hù)組細(xì)胞OPG/RANKLmRNA比顯著升高(P<0.05)。

圖4 THSG和H2O2對MC3T3-E1細(xì)胞RANKL mRNA表達(dá)水平(A)和OPG/RANKL mRNA比(B)的影響(n=3)

2.4 THSG對H2O2作用下MC3T3-E1細(xì)胞β-catenin表達(dá)水平的影響β-cateninmRNA表達(dá)水平結(jié)果如圖5A所示，與對照組相比，H2O2組細(xì)胞β-cateninmRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，10-3mg/mL和10-4mg/mL THSG保護(hù)組細(xì)胞β-cateninmRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。β-catenin蛋白表達(dá)水平結(jié)果如圖5B所示，與對照組相比，H2O2組細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與H2O2組相比，10-3mg/mL和10-4mg/mL THSG保護(hù)組細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。

圖5 THSG和H2O2對MC3T3-E1細(xì)胞β-catenin mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)水平的影響(n=3)

3 討論

THSG具有促成骨、抗炎、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗腫瘤、改善學(xué)習(xí)和記憶能力等多種功效[9]，具有開發(fā)成為獸藥及飼料添加劑的潛力。已有研究報道THSG可通過抗氧化作用保護(hù)成骨細(xì)胞生存及功能活性[8-10]。本試驗主要通過檢測成骨細(xì)胞OPG/RANKLmRNA表達(dá)比和Wnt/β-catenin通路活化水平等，對THSG保護(hù)成骨細(xì)胞抗氧化損傷的作用機制進(jìn)行探索。

氧化損傷可通過抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等途徑降低細(xì)胞生存活性。根據(jù)本試驗細(xì)胞活性檢測結(jié)果，10-3～10-5mg/mL THSG均能保護(hù)H2O2作用下成骨細(xì)胞的生存活力，本試驗選取10-3mg/mL和10-4mg/mL濃度THSG進(jìn)行后續(xù)試驗。在內(nèi)源性凋亡途徑中，Bax和Bad是重要的促凋亡蛋白，Bcl-2是最具代表性的抑凋亡蛋白。其中，Bax通過增加線粒體膜通透性，釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入胞質(zhì)誘發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；Bcl-2可與Bax形成異源二聚體，抑制Bax介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；而Bad能夠結(jié)合Bcl-2，釋放Bax/Bcl-2異源二聚體中的Bax，間接促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11]。本試驗對BadmRNA表達(dá)水平的檢測結(jié)果顯示，10-4mg/mL THSG能夠顯著抑制H2O2對BadmRNA表達(dá)水平的上調(diào)作用，說明適宜濃度的THSG可抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的Bad轉(zhuǎn)錄。張金康等[10]研究證明，THSG可抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，降低H2O2作用下成骨細(xì)胞Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平，提高Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)合本試驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，在氧化應(yīng)激條件下，THSG可能通過下調(diào)Bad和Bax基因表達(dá)水平，上調(diào)Bcl-2基因表達(dá)水平，從而抑制成骨細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞生存活性。

成骨細(xì)胞不僅能夠形成骨，還通過表達(dá)OPG和RANKL等蛋白對破骨細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。其中，RANKL與破骨細(xì)胞前體表面的RANK結(jié)合后，能夠使破骨細(xì)胞前體融合為成熟的多核破骨細(xì)胞，發(fā)揮骨吸收活性；OPG能夠競爭性結(jié)合RANKL，抑制RANKL與RANK結(jié)合，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞分化形成及骨吸收活性[12]。有研究報道氧化應(yīng)激能夠?qū)е翿ANKL表達(dá)量升高和OPG表達(dá)量下降[5]，與本試驗結(jié)果中H2O2對成骨細(xì)胞OPG/RANKLmRNA比的下調(diào)作用相符。此外，本試驗發(fā)現(xiàn)10-3mg/mL和10-4mg/mL濃度THSG可以抑制H2O2對OPG/RANKLmRNA比的調(diào)控作用。結(jié)合本試驗前期研究中THSG能上調(diào)成骨細(xì)胞生存活力和OPG/RANKL比的結(jié)果[13]，說明THSG對于正常狀態(tài)和氧化條件下成骨細(xì)胞OPG/RANKL比均具有正向調(diào)控功能，從而可能間接抑制破骨細(xì)胞的骨吸收活動。

Wnt/β-catenin通路是成骨細(xì)胞重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能夠調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞生存、功能活性及抗氧化能力等[3]。Wnt通路激活后，軸蛋白復(fù)合體與自身受體復(fù)合物結(jié)合，抑制糖原合酶激酶 3的活性，進(jìn)而抑制β-catenin降解，促進(jìn)β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積累并轉(zhuǎn)位入核，調(diào)控通路下游靶基因的表達(dá)[14]。因此，β-catenin蛋白水平是Wnt/β-catenin通路活化狀態(tài)的重要標(biāo)志。本試驗結(jié)果表明H2O2能夠下調(diào)成骨細(xì)胞β-catenin水平，而THSG可以上調(diào)成骨細(xì)胞β-catenin水平，說明THSG能夠拮抗氧化損傷對細(xì)胞Wnt/β-catenin通路的抑制作用。有研究證明THSG能夠激活骨質(zhì)疏松模型小鼠Wnt/β-catenin通路[15]，與本試驗中THSG對成骨細(xì)胞Wnt/β-catenin通路的激活作用相互印證。成骨細(xì)胞中β-catenin可正向調(diào)控細(xì)胞生存活力和OPG/RANKL比[16]，結(jié)合本試驗結(jié)果，推測THSG通過Wnt/β-catenin通路保護(hù)成骨細(xì)胞的生存活力及其對破骨細(xì)胞的抑制作用，抵抗H2O2導(dǎo)致的氧化損傷。

綜上，THSG能夠保護(hù)成骨細(xì)胞抗氧化損傷，作用機制與上調(diào)成骨細(xì)胞生存活力、OPG/RANKL比及Wnt/β-catenin通路活化水平等相關(guān)。