秦書華，彭 俊，高創(chuàng)創(chuàng)，桂浩鑫，邵鈺婷，郝倩，向 誠，徐天瑞，劉 瑩

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.云南省第一人民醫(yī)院 胸外科，云南 昆明 650034；3.錦州醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)研究院，遼寧 錦州 121001)

0 引 言

肺癌是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，居同期惡性腫瘤死亡原因之首[1].目前肺癌的治療包括手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、分子靶向治療以及免疫治療等，雖然目前部分市售的肺癌治療藥物療效很明顯，但易產(chǎn)生耐藥性.因此,急需對肺癌的發(fā)病機制進行系統(tǒng)研究，開發(fā)新的治療靶點.

c-Met(Hepatocyte Growth Factor Receptor，HGFR，肝細(xì)胞生長因子受體)屬于受體酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinases,RTKs)超家族[2-3].c-Met在肺癌組織、肺癌細(xì)胞中被異常激活，并能夠促進肺癌細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和血管生成[4].研究表明，c-Met 的異?；罨糠质潜晦D(zhuǎn)錄激活所致，在 c-Met 基因大約 2.6 kb 的啟動子上存在多個順式作用元件，可以與多種轉(zhuǎn)錄因子作用.

Sp1(Specificity protein 1)是一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄活性域和連接域等[5-6].Sp1特異地與基因啟動子區(qū)的順式作用元件GC盒(GGGGCGGGG)以及GT盒(GGTGTGGG)結(jié)合后參與了許多生物過程，如細(xì)胞增殖、分化以及腫瘤轉(zhuǎn)化等[7-9].Sp1調(diào)控數(shù)以千計的編碼基因，如編碼細(xì)胞周期蛋白A2、p21cip1/waf1、E-鈣粘蛋白和Sp1本身的編碼基因[10].這些基因參與多種生理過程，如細(xì)胞周期進程和細(xì)胞遷移等.Sp1還調(diào)節(jié)非編碼基因(如lncC01234、lnc00657等)的表達(dá)，促進肺癌細(xì)胞的增殖[11-12].研究表明，Sp1能夠與c-Met啟動子結(jié)合，但尚不明確Sp1轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met在腫瘤生長、浸潤、轉(zhuǎn)移及腫瘤血管生成等過程中的作用[13].

作者通過查閱大量文獻并對c-Met啟動子核心序列(-297→+22)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點進行分析，發(fā)現(xiàn)c-Met啟動子核心序列包含3個Sp1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點.本研究利用肺腺癌A549細(xì)胞，構(gòu)建Sp1基因的過表達(dá)和沉默表達(dá)細(xì)胞模型，系統(tǒng)研究Sp1轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met在A549細(xì)胞增殖、凋亡、EMT轉(zhuǎn)化、侵襲和血管生成中的作用機制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞

人胚腎293T細(xì)胞、人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系和人非小細(xì)胞肺癌H1299細(xì)胞系均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，凍存于液氮中.

1.1.2 臨床樣本

選取云南省第一人民醫(yī)院胸外科確診的12例ⅡA期肺癌，患者年齡40～65歲，并行外科手術(shù)治療，將肺癌組織及其癌旁組織 (距離癌組織 5 cm) 離體后立刻置于液氮中，并迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃ 保存.所有標(biāo)本均取得患者及其家屬同意以及倫理委員會批準(zhǔn).

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

293T細(xì)胞、A549細(xì)胞或H1299細(xì)胞按照1×105/mL濃度鋪于六孔板，細(xì)胞生長至70%左右，按照 lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染過表達(dá)Sp1和shSp1質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后將各組細(xì)胞于 37 ℃ 培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng) 24 h.

1.2.2 Western blotting和實時熒光定量PCR

參照Western blotting檢測蛋白表達(dá)情況的操作方法[14].

根據(jù)Trizol (Invitrogen)試劑說明書的方法操作.取 1 μL cDNA作為模板，以 18 s 作為內(nèi)參.反應(yīng)條件：預(yù)變性，95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、10 s，40個循環(huán)，每個循環(huán)后進行熔解曲線分析.

1.2.3 雙熒光素酶報告基因檢測

按照Promega雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作.

1.2.4 染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)

按照Millpore染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)試劑盒說明書操作.

1.2.5 細(xì)胞侵襲、遷移實驗和統(tǒng)計學(xué)分析

Transwell小室實驗分別收集4組A549細(xì)胞，以無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液(3×104個/mL),取 500 μL 加入上室中，下室加入 750 μL 含10%胎牛血清的1 640培養(yǎng)基.20 h 后固定、染色，顯微鏡下隨機選取6個視野，計數(shù)基底膜上的細(xì)胞并取均數(shù).實驗重復(fù)3次.

細(xì)胞劃痕實驗A549細(xì)胞按照1.5× 105個/mL，鋪于6孔板，貼壁生長至約90%，棄舊培養(yǎng)液，用 200 μL 滅菌槍頭在貼壁細(xì)胞中央劃痕，洗去脫落細(xì)胞，倒置顯微鏡下拍照，用Image J測量并記錄劃痕面積，48 h 后再次拍照并測量細(xì)胞劃痕面積，計算劃痕愈合率.

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄因子Sp1能夠與c-Met基因啟動子結(jié)合

首先，選取12對人源肺癌及癌旁組織樣本，提取總蛋白，Western-blotting檢測Sp1和c-Met蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明，與癌旁正常組織相比，Sp1和c-Met在肺癌組織樣本均呈現(xiàn)高表達(dá)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見圖1a).

進一步地，采用雙熒光素酶報告基因檢測法，將過表達(dá)Sp1的雙熒光素酶報告基因載體與c-Met啟動子核心區(qū)域的載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，觀察熒光素酶活性的改變.結(jié)果顯示，與單獨轉(zhuǎn)染c-Met promoter-pGL3組相比，共轉(zhuǎn)染pCMV-myc-Sp1和c-Met promoter-pGL3組熒光活性顯著增加(>1.5倍)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，表明Sp1對c-Met基因有直接調(diào)控作用(見圖1b).

收集A549細(xì)胞，按照Millipore ChIP 試劑盒操作程序進行實驗.Input做為陽性對照，陰性對照組為不加抗體組.結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，Sp1能夠結(jié)合在c-Met啟動子的核心區(qū)域(-350→+60)(見圖1c).

圖1 轉(zhuǎn)錄因子Sp1能夠與c-Met基因的啟動子結(jié)合Fig.1 The transcription factor Sp1 can bind to the promoter of the c-Met gene:(a)Western blot detection of Sp1 and c-Met expression in lung cancer and paraneoplastic tissues;(b)Dual luciferase reporter gene assay shows that Sp1 can bind to the c-Met gene promoter;(c)ChIP experiments show that Sp1 can bind to the c-Met gene promoter

2.2 轉(zhuǎn)錄因子Sp1能夠正向調(diào)控c-Met基因的表達(dá)

為了進一步檢測Sp1和c-Met之間的調(diào)控關(guān)系，分別在A549細(xì)胞和H1299細(xì)胞中考察過表達(dá)和沉默表達(dá)Sp1對c-Met基因表達(dá)的影響.結(jié)果表明，在A549(見圖2a-b)和H1299細(xì)胞(見圖2c-d)中，過表達(dá)Sp1促進c-Met的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)，而沉默表達(dá)Sp1抑制c-Met的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá).以上結(jié)果表明Sp1是c-Met的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子.

圖2 Sp1能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)c-Met的表達(dá)Fig.2 Sp1 can transcriptionally regulate the expression of c-Met expression：(a)Sp1 regulates protein expression of c-Met in A549 cells;(b) Sp1 regulates mRNA expression of c-Met in A549 cells;(c)Sp1 regulates protein expression of c-Met in H1299 cells;(d) Sp1 regulates mRNA expression of c-Met in H1299 cells

2.3 Sp1轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met能夠促進A549細(xì)胞增殖和抑制A549細(xì)胞凋亡

當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時，細(xì)胞會皺縮、變圓，并形成凋亡小體.倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Sp1抑制，沉默表達(dá)Sp1促進細(xì)胞發(fā)生凋亡(見圖3a).進一步用Hochest33342染色，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Sp1抑制，沉默表達(dá)Sp1促進細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)固縮，DNA發(fā)生降解和斷裂，并呈現(xiàn)出致密的染色質(zhì)濃染(見圖3a).

由于c-Met在腫瘤特別是肺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，c-Met介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生過程主要介導(dǎo)下游RAF/MEK/ERK 通路，因此，本文檢測了過表達(dá)和沉默表達(dá)Sp1對ERK 激活的影響.結(jié)果表明，過表達(dá)Sp1促進ERK激活，而沉默表達(dá)Sp1抑制ERK激活(見圖3b).此外，過表達(dá)Sp1促進，而沉默表達(dá)Sp1抑制c-Met的表達(dá)和激活，以及增殖相關(guān)蛋白Ki67的表達(dá)；并且過表達(dá)Sp1抑制，而沉默表達(dá)Sp1促進凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的剪切.以上結(jié)果表明Sp1轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met，促進下游RAF/MEK/ERK通路的激活，促進A549細(xì)胞增殖和抑制A549細(xì)胞凋亡，進而促進腫瘤的發(fā)生.

圖3 Sp1對c-Met的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能夠促進A549細(xì)胞增殖，抑制A549細(xì)胞凋亡Fig.3 Sp1 transcriptional regulation of c-Met can promote A549 cell proliferation and inhibit A549 cell apoptosis：(a)Effect of Sp1 overexpression or silent expression on apoptosis in A549 cells by phase contrast microscopy or fluorescence microscopy;(b) Effect of Sp1 overexpression or silent expression onthe expression of proliferation-associated proteins and apoptosis-associated proteins in A549 cells

2.4 Sp1轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met能夠促進A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

推測轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met能夠影響腫瘤的發(fā)生過程.上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞獲得遷移能力的方式之一.首先，檢測過表達(dá)和沉默表達(dá)Sp1轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met在EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)轉(zhuǎn)化中的作用.

采用倒置熒光顯微鏡觀察Sp1對A549細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化的影響.形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，過表達(dá)Sp1顯著促進而沉默表達(dá)Sp1顯著抑制A549細(xì)胞由多角形的上皮細(xì)胞向纖維狀間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化(見圖4a).

進一步采用Western-blot和熒光定量PCR(Q-PCR)法檢測EMT過程中相關(guān)因子的蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)情況.結(jié)果顯示，過表達(dá)Sp1促進而沉默表達(dá)Sp1抑制EMT轉(zhuǎn)化過程中特異性標(biāo)志物波形蛋白(vimentin)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)的蛋白表達(dá)(見圖4b)和mRNA表達(dá)(見圖4c).此外，過表達(dá)Sp1抑制而沉默表達(dá)Sp1促進EMT轉(zhuǎn)化過程中E-鈣粘蛋白(E-cadherin)的蛋白表達(dá)(見圖4b)和mRNA表達(dá)(見圖4c).以上結(jié)果表明，Sp1轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met能夠促進A549細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)化.

圖4 Sp1對c-Met的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能夠促進A549細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)化Fig.4 Sp1 transcriptional regulation of c-Met can promote A549 cell EMT transformation:(a)Morphological changes induced by Sp1 overexpression or silent expression during EMT transformation of A549 cells;(b)Protein expression;(c)mRNA expression

2.5 Sp1轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met能夠促進A549細(xì)胞侵襲和血管生成

48 h 細(xì)胞劃痕實驗中，過表達(dá)Sp1組愈合率(78.21±7.06)顯著高于空載體組(40.31±7.7).同時沉默表達(dá)Sp1組愈合率(17.76±4.91)顯著低于空載體組(46.08±5.37)(見圖5a-b).Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)Sp1組侵襲力為(127.67±19.43)個，顯著高于空載體組(62.33±4.73)個；同時沉默表達(dá)Sp1組侵襲力為(37.67±19.43)個，顯著低于空載體組(68.67±4.16)個(見圖5c-d).

采用Q-PCR法檢測侵襲、遷移相關(guān)基因的表達(dá).結(jié)果顯示，過表達(dá)Sp1促進而沉默表達(dá)Sp1抑制侵襲、遷移相關(guān)因子β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、粘著斑激酶(FAK)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的mRNA表達(dá)(見圖5e).

血管生成是c-Met介導(dǎo)腫瘤發(fā)生過程中一個重要的過程.血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)和環(huán)氧合酶-II(COX-2)是血管生成過程中重要的調(diào)控因子，因此，本文采用Westen-blot和Q-PCR法檢測Sp1轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met對血管生成的影響.結(jié)果顯示，過表達(dá)Sp1促進而沉默表達(dá)Sp1抑制血管生成關(guān)鍵因子COX-2的蛋白表達(dá)(見圖5f)和mRNA表達(dá)(見圖5g).此外，Q-PCR檢測結(jié)果表明，過表達(dá)Sp1促進而沉默表達(dá)Sp1抑制VEGF和CTGF的mRNA表達(dá)(見圖5g).以上結(jié)果表明，Sp1轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met促進腫瘤的發(fā)生主要通過促進c-Met誘導(dǎo)的A549細(xì)胞侵襲、遷移和血管生成過程.

圖5 Sp1對c-Met的轉(zhuǎn)錄調(diào)控能夠促進A549細(xì)胞的侵襲和血管生成Fig.5 Sp1 transcriptional regulation of c-Met can promote migration,invasion,and angiogenesis in A549 cells：(a)Scratch assay to detect the effect of Sp1 overexpression or silent expression on the invasion and migration of A549 cells;(b)Scratch test bar chart;(c)Transwell assay to detect the effect of Sp1 overexpression or silent expression on the invasion and migration of A549 cells;(d)Transwell bar chart;(e)Effect of overexpression or silencing of Sp1 expression on invasion and migration-related gene expression by fluorescent quantitative PCR;(f)Western blotting for COX-2 expression;(g) Detection of angiogenesis-related genes COX-2,VEGF and CTGF by fluorescent quantitative PCR

3 討 論

c-Met處于HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的核心位置，其上游調(diào)控因子通過抑制c-Met的表達(dá)或激活特異性抑制腫瘤細(xì)胞中c-Met的異常激活.在 c-Met 基因啟動子核心序列存在3個Sp1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點.Sp1在多種組織中表達(dá)，同時調(diào)控細(xì)胞生長進程[15].例如Sp1刺激lnc00657通過靶向miR-26b-5p/COMMD8軸促進非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)生發(fā)展[12]，Sp1亦可通過lnc01234調(diào)節(jié)miR-140來調(diào)節(jié)OTUB1表達(dá)，從而促進肺癌細(xì)胞的進程.

HGF/c-Met信號轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激癌細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生，通過EMT獲得這些侵襲的表型[16].抑制COX-2能夠抑制Akt/c-Met驅(qū)動的COX-2/Akt/FASN級聯(lián)反應(yīng)，推遲了癌癥的發(fā)生，c-Met還能夠通過c-Met-NF-κB-COX-2增加癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，通過c-Met-Bcl-2-caspase-3通路，增強下游效應(yīng)并拮抗冬凌草甲素誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡[8,17-19].

本研究著眼于Sp1轉(zhuǎn)錄因子在c-Met通路中的調(diào)控作用.Sp1和c-Met在肺癌組織中均呈現(xiàn)出高表達(dá)，而正常組織中較少，并且c-Met與Sp1表達(dá)在蛋白水平和mRNA水平呈正相關(guān).雙熒光素酶報告基因法檢測和染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)法研究發(fā)現(xiàn)Sp1對c-Met基因有直接調(diào)控作用.本文的研究證明，對于Sp1能夠促進癌細(xì)胞的增殖、間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管生成，可能是通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met的表達(dá)和激活實現(xiàn)的.

4 結(jié) 論

綜上所述，Sp1和c-Met在肺癌組織中均呈現(xiàn)出高表達(dá)，而正常組織中較少.在肺癌A549細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子Sp1能夠與c-Met基因啟動子核心序列區(qū)結(jié)合，促進c-Met的蛋白表達(dá)和mRNA的表達(dá).在A549細(xì)胞中，Sp1轉(zhuǎn)錄調(diào)控c-Met能夠促進細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲以及血管生成，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生.