黃 申，朱 波，張巧艷，林榴芬，尤金玲，蒙雄裕，張泉龍，秦路平

基于UPLC指紋圖譜和黃酮醇苷含量的不同來(lái)源銀杏葉的質(zhì)量比較

黃 申，朱 波，張巧艷，林榴芬，尤金玲，蒙雄裕，張泉龍，秦路平*

浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053

比較不同產(chǎn)地、性別、樹(shù)齡銀杏葉在同一采收期的質(zhì)量，為其資源評(píng)價(jià)提供依據(jù)。收集5個(gè)產(chǎn)地共36批的銀杏單株葉樣品，采用超高效液相色譜法測(cè)定蘆丁、槲皮素、異鼠李素和山柰素含量。用國(guó)家藥典委員會(huì)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件處理分析，建立銀杏葉藥材UPLC指紋圖譜。結(jié)合主成分分析及偏最小二乘判別分析探討不同性別銀杏葉的質(zhì)量差異。各組樣品相似度均大于0.85，雌株之間相似度低于雄株；產(chǎn)地、性別和樹(shù)齡對(duì)銀杏葉的化學(xué)成分組成和比例有一定的影響，成熟植株指紋圖譜相似度變化幅度大于苗期植株；HM居群與其它居群樣品的物候期不同。不同產(chǎn)地雌雄株銀杏葉的性狀特征存在差異。LT居群銀杏葉質(zhì)量較佳且更穩(wěn)定；苗期植株穩(wěn)定性高于成熟植株；不同性別銀杏葉質(zhì)量差異標(biāo)志物有所差異。為控制銀杏葉內(nèi)在質(zhì)量建立了UPLC指紋圖譜快速檢測(cè)方法，并進(jìn)行指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)，結(jié)合主成分分析及偏最小二乘判別分析方法用于分析不同性別銀杏葉的質(zhì)量，為銀杏葉的質(zhì)量比較和資源評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

銀杏葉；UPLC指紋圖譜；黃酮醇苷；質(zhì)量差異；蘆丁；槲皮素；異鼠李素；山柰素

銀杏葉為銀杏科植物銀杏L.的干燥葉，具的化濁降脂、活血化瘀、斂肺平喘、通絡(luò)止痛等功效，主治中風(fēng)偏癱、胸痹心痛、瘀血阻絡(luò)、肺虛咳喘、高脂血癥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，銀杏葉提取物具有抗腦缺血、抗炎等作用，能夠改善心腦血管循環(huán)、保護(hù)肝臟、舒張動(dòng)脈、抗炎、抗過(guò)敏[2-3]。銀杏葉主要活性成分包括黃酮類、萜類內(nèi)酯等。其中銀杏黃酮具有擴(kuò)張血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、調(diào)血脂等藥理作用，可用于治療心腦血管疾病、腎病綜合征、糖尿病、血管性癡呆等，對(duì)心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，應(yīng)用前景廣闊[4-7]。銀杏葉中黃酮類成分復(fù)雜，各成分含有量和極性差異大，故其質(zhì)量控制具有一定困難。目前，針對(duì)黃酮類成分的分析方法，通常是針對(duì)水解后形成的苷元，間接地反映原型苷。《中國(guó)藥典》該藥材的含量測(cè)定項(xiàng)下對(duì)總黃酮醇的規(guī)定，亦是通過(guò)水解后苷元槲皮素、異鼠李素和山柰素的含量為指標(biāo)，通過(guò)轉(zhuǎn)換系數(shù)計(jì)算得出。而實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)法有效監(jiān)控指標(biāo)成分實(shí)際情況[8-9]。指紋圖譜分析可以使中藥所含多種化學(xué)成分整體可視化，在藥品質(zhì)量定性監(jiān)控中具有優(yōu)勢(shì)[10]。由于栽培方式和采收年限不同，銀杏葉中主要化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)類型和含量存在差異，其藥理作用的特點(diǎn)和質(zhì)量一致性也存在明顯的不同[11-13]。銀杏葉藥材價(jià)格在市場(chǎng)上差異很大，如何通過(guò)性狀特征和質(zhì)量差異進(jìn)行快速準(zhǔn)確區(qū)分，對(duì)于藥材的準(zhǔn)確鑒定、合理應(yīng)用和流通銷售具有重要的意義。研究雌雄異株植物藥材質(zhì)量差異，分析不同性別樣品質(zhì)量差異標(biāo)志物，深入探索性別差異及調(diào)控機(jī)制對(duì)提升雌雄異株藥用植物的藥效價(jià)值及實(shí)現(xiàn)性別調(diào)控和轉(zhuǎn)變具有一定的意義。目前對(duì)銀杏葉中黃酮苷含量測(cè)定分析主要采用HPLC技術(shù)，利用外標(biāo)法測(cè)定槲皮素、異鼠李素、山柰素含量的一種或多種，通過(guò)轉(zhuǎn)化因子，計(jì)算出黃酮苷的含量[14]。

銀杏作為裸子植物門(mén)銀杏綱唯一現(xiàn)存物種，為多年生落葉大喬木，是世界著名的“活化石”植物，原產(chǎn)自中國(guó)[15]。天目山是地球上銀杏的幸存地，將其作為典型的自然銀杏居群（TMP），與周邊村落移栽銀杏居群（TMV）及高校園區(qū)內(nèi)銀杏居群（ZAFUD）共同作為研究對(duì)象。此外，中國(guó)有六處“銀杏之鄉(xiāng)”最具盛名，它們分別是江蘇省邳州市、廣東省南雄市、江蘇省泰興市、湖北省安陸市、山東省郯城縣、浙江省湖州市長(zhǎng)興縣宋店。其中江蘇邳州是國(guó)內(nèi)最大的銀杏資源地，邳州與郯城銀杏基地相連，土地相同、種苗互發(fā)；安陸、貴州等地銀杏種苗大部分由江蘇邳州引入。2010年“邳州銀杏”獲批國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品[16]。因此選取江蘇邳州2個(gè)典型葉用銀杏栽培基地（LT、HM）作為研究對(duì)象。

本研究通過(guò)收集比較不同產(chǎn)地雌雄株銀杏葉的性狀特征，建立UPLC指紋圖譜快速檢測(cè)技術(shù)，其色譜峰的保留時(shí)間全部在18 min內(nèi)，極大地提高了分析效率。測(cè)定分析總黃酮醇苷含量差異，并以樣品生成的共有模式作為對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)，結(jié)合主成分分析及偏最小二乘判別分析，綜合比較不同供試樣品質(zhì)量差異，以期為不同產(chǎn)地雌雄株銀杏葉的鑒別及應(yīng)用提供參考資料。

1 材料和試劑

1.1 材料

GPS定位儀，卷尺，Waters ACQUITY H-Class 超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），配置四元高壓泵、PDA檢測(cè)器；KQ-500B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；FA22C4B電子天平（上海天關(guān)天平儀器有限公司）；MILLI-Q型超純水儀（法國(guó)密理博公司），高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）。

1.2 試劑

乙腈為色譜純（華東醫(yī)藥股份有限公司器材化劑分公司，德國(guó)Merck公司）；甲酸為色譜純（杭州悅耳科技有限公司，美國(guó)，aladdin公司）；對(duì)照品槲皮素（批號(hào)C01J10Y91727）、異鼠李素（批號(hào)P14O11L124051）、山柰素（批號(hào)Y14M11H109733）、蘆?。ㄅ?hào)Y24F11Y17051），均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。

1.3 樣品的采集

選擇銀杏葉主要栽培地區(qū)共計(jì)5個(gè)居群，每個(gè)居群采集雌雄單株各5株及以上（不足5株則按最大量采集），居群間隔大于50 km，植株間距20 m。胸徑大于20 cm的大樹(shù)認(rèn)為成年個(gè)體，成年個(gè)體具有性別分化特征，否則認(rèn)定為苗期植株，無(wú)兩性特征。樣品來(lái)源信息見(jiàn)表1，均于2020年9月采收，采集后統(tǒng)一洗凈，低溫烘干。所有樣品均經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院秦路平教授鑒定為銀杏科植物銀杏L.的完整葉。

2 方法

2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEHC18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱和ACQUITYBEHC18（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）MVANGUARD預(yù)柱[沃特世科技（上海）有限公司]。流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～6 min，15%～23% A；6～11.0 min，23%～35% A；11～11.1 min，35%～41% A；11.1～14 min，41% A；14～14.1 min，41%～51% A；14.1～18 min，51% A）；柱溫25 ℃；檢測(cè)器：PDA；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；體積流量0.25 mL/min；進(jìn)樣體積3 μL，平衡時(shí)間30 min。

表1 銀杏葉樣品采集信息

Table 1 Collection information of G. biloba leavescollected from Zhejiang and Jiangsu provinces

編號(hào)采集號(hào)性別經(jīng)度（E）緯度（N）海拔/m編號(hào)采集號(hào)性別經(jīng)度（E）緯度（N）海拔/m S1LT-M1M117°99′34°63′ 24S19HM-F3F118°05′34°44′ 18 S2LT-M2M117°99′34°63′ 24S20HM-F4F118°05′34°44′ 18 S3LT-M3M117°99′34°63′ 24S21TMP-F1F119°25′30°02′1176 S4HM-M1M118°05′34°44′ 18S22TMP-F2F119°25′30°02′1176 S5HM-M2M118°05′34°44′ 18S23TMP-F3F119°25′30°02′1176 S6HM-M3M118°05′34°44′ 18S24TMP-F4F119°25′30°02′1176 S7TMP-M1M119°25′30°02′1176S25TMV-F1F119°27′30°17′ 340 S8TMV-M1M119°27′30°17′ 340S26TMV-F2F119°27′30°17′ 340 S9TMV-M2M119°27′30°17′ 340S27ZAFUD-F1F119°73′30°25′ 31 S10TMV-M3M119°27′30°17′ 340S28ZAFUD-F2F119°73′30°25′ 31 S11TMV-M4M119°27′30°17′ 340S29ZAFUD-F3F119°73′30°25′ 31 S12LT-F1F117°99′34°63′ 24S30ZAFUD-F4F119°73′30°25′ 31 S13LT-F2F117°99′34°63′ 24S31ZAFUD-F5F119°73′30°25′ 31 S14LT-F3F117°99′34°63′ 24S32LT-S1NA117°99′34°63′ 24 S15LT-F4F117°99′34°63′ 24S33LT-S2NA117°99′34°63′ 24 S16LT-F5F117°99′34°63′ 24S34LT-S3NA117°99′34°63′ 24 S17HM-F1F118°05′34°44′ 18S35ZAFUD-S1NA119°73′30°25′ 31 S18HM-F2F118°05′34°44′ 18S36ZAFUD-S2NA119°73′30°25′ 31

M-雄株 F-雌株 NA-無(wú)兩性特征

M-male F-female NA-no gender characteristics

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定對(duì)照品適量，加甲醇制成含槲皮素、山柰素、異鼠李素、蘆丁均為0.1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，4 ℃保存，備用。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱定銀杏葉干燥粉末1 g，加入甲醇10 mL，超聲溶解，冷卻至室溫，用甲醇定容到10 mL，濾過(guò)，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品（S1）溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄指紋圖譜。用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版軟件進(jìn)行相似度分析，以蘆丁峰為參照，多點(diǎn)校正后全峰匹配，結(jié)果表明，6個(gè)供試品色譜圖與其共有模式的相似度分別為0.957、0.994、0.993、0.996、0.995、0.995，說(shuō)明該方法精密度較好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品（S1）溶液，分別在0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，按上述色譜條件記錄指紋圖譜。用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版軟件進(jìn)行相似度分析，以蘆丁峰為參照，多點(diǎn)校正后全峰匹配，計(jì)算結(jié)果表明，6個(gè)供試品色譜圖與其共有模式的相似度分別為0.992、0.989、0.992、0.994、0.992、0.993，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一供試品，照“2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，記錄指紋圖譜。用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版軟件進(jìn)行相似度分析，以蘆丁峰為參照，多點(diǎn)校正后全峰匹配，計(jì)算結(jié)果表明，6個(gè)供試品色譜圖與其共有模式的相似度分別為0.998、0.999、0.999、0.999、0.998、0.993，說(shuō)明該方法重復(fù)性較好。

2.5 樣品測(cè)定

將供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版軟件，多點(diǎn)校正后全峰匹配，計(jì)算相似度。依《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定方法分別測(cè)定槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量，并按下式換算成總黃酮醇苷的含量。

總黃酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+異鼠李素含量)×2.51

2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Office 2020軟件和SPSS（26.0）對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行整理匯總和方差分析，中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版軟件進(jìn)行相似度分析，SIMCA-P 13.0軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），GraphPad Prism 7.00軟件進(jìn)行圖表繪制。

3 結(jié)果與分析

3.1 雌雄異株銀杏葉性狀特征的比較分析

在實(shí)際工作中一般應(yīng)用如下方法初步區(qū)分銀杏雌雄植株：雌株主枝在主干上著生角度大，向四面展開(kāi)，有時(shí)下垂；雄株主枝在主干上著生角度小、挺直向上。雌株葉裂較少、較淺，不達(dá)葉之中部；雄株葉裂較深、缺刻超過(guò)葉的中部[17]。現(xiàn)代銀杏有長(zhǎng)、短枝之分，短枝上的葉是短柄、簇生的；銀杏葉由枝端的幼葉開(kāi)始向下發(fā)育過(guò)程呈規(guī)律性變化。銀杏葉裂片由窄變寬，向著利于光合作用的方向發(fā)展[18]。見(jiàn)圖1。由于不同產(chǎn)地銀杏實(shí)生植株及葉片形態(tài)存在一定差異，為精準(zhǔn)鑒別植株性別，采集樣品前均與種植養(yǎng)護(hù)或?qū)I(yè)人員進(jìn)行性別確認(rèn)。

1、2-成熟雄株 3、4-成熟雌株 5、6-苗期植株

3.2 指紋圖譜分析及含量測(cè)定結(jié)果

在優(yōu)化的色譜條件下，對(duì)5個(gè)居群36份銀杏葉樣品進(jìn)行UPLC指紋圖譜分析。將采集的數(shù)據(jù)按植株性別分類，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版軟件，經(jīng)數(shù)據(jù)剪切、等長(zhǎng)處理、數(shù)據(jù)平移，計(jì)算生成對(duì)照指紋圖譜（RFP）。圖2為對(duì)照品色譜峰圖，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，5個(gè)居群11份雄株銀杏葉片樣品相似度在0.879～0.966；20份雌株銀杏葉片樣品相似度在0.865～0.930；5份苗期銀杏葉片樣品相似度在0.917～0.978。樣品指紋圖譜相似度變化范圍較大，與文獻(xiàn)一致[11]。各組樣品相似度均大于0.85，雌株之間相似度低于雄株，成熟植株相似度變化幅度大于苗期植株。性別和樹(shù)齡對(duì)銀杏葉的化學(xué)成分組成和比例有一定的影響；2～5年生銀杏葉的化學(xué)成分組成和比例較一致，質(zhì)量穩(wěn)定。

1-蘆丁 2-槲皮素 3-異鼠李素 4-山柰素

表2 銀杏葉樣品指紋圖譜相似度測(cè)定結(jié)果

Table 2 Fingerprint similarity in leaves

編號(hào)相似度編號(hào)相似度編號(hào)相似度 S10.900S130.905S250.891 S20.928S140.908S260.892 S30.957S150.927S270.907 S40.894S160.896S280.871 S50.931S170.895S290.887 S60.958S180.905S300.930 S70.908S190.915S310.922 S80.966S200.928S320.935 S90.942S210.917S330.917 S100.879S220.922S340.949 S110.879S230.921S350.976 S120.865S240.910S360.978

對(duì)各供試品中蘆丁、槲皮素、異鼠李素和山柰素含量進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算總黃酮醇苷含量，結(jié)果見(jiàn)表3。供試銀杏葉片樣品總黃酮醇苷含量變幅為0.11～1.86 mg/g，平均含量為0.43 mg/g。雄株銀杏葉片樣品總黃酮醇苷含量變幅為0.21～1.86 mg/g，平均含量為0.55 mg/g。雌株銀杏葉片樣品總黃酮醇苷含量變幅為0.11～0.93 mg/g，平均含量為0.39 mg/g。雄株銀杏葉片中黃酮苷含量高于雌株，與文獻(xiàn)結(jié)論一致[19]。

表3 銀杏葉樣品總黃酮醇苷含量()

Table 3 Determination of total flavonol glucoside ()

編號(hào)總黃酮醇苷/(mg·g?1)編號(hào)總黃酮醇苷/(mg·g?1)編號(hào)總黃酮醇苷/(mg·g?1) S10.29±0.00S130.55±0.04S250.18±0.00 S20.23±0.01S140.57±0.00S260.38±0.01 S30.27±0.01S150.59±0.01S270.38±0.00 S41.86±0.01S160.46±0.02S280.31±0.02 S50.92±0.03S170.45±0.00S290.32±0.01 S60.63±0.02S180.63±0.02S300.18±0.01 S70.29±0.02S190.93±0.01S310.11±0.00 S80.54±0.03S200.38±0.00S320.56±0.04 S90.38±0.01S210.21±0.00S330.26±0.00 S100.21±0.01S220.18±0.01S340.61±0.01 S110.43±0.02S230.35±0.00S350.13±0.00 S120.33±0.02S240.34±0.02S360.23±0.01

3.3 PCA

PCA是從多個(gè)數(shù)值變量之間的相互關(guān)系入手，利用降維的思想，將多個(gè)變量化為少數(shù)幾個(gè)互不相關(guān)的綜合變量的統(tǒng)計(jì)方法。記分圖是帶有二維記分圖的觀察圖，顯示了數(shù)據(jù)中可能存在的異常值、組、相似性和其他模式。將36批次銀杏葉樣品測(cè)得黃酮醇苷類成分原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件，進(jìn)行PCA，確定不同樣品之間的差異，結(jié)果見(jiàn)圖3。

5個(gè)居群雌雄樣品不能明顯分開(kāi)，各組間差異較小，HM居群樣品S4與其他樣品差異顯著，與“3.2”項(xiàng)下結(jié)果一致。全部樣品采集在一周之內(nèi)完成，樣品采集時(shí)該居群植株已處于落葉階段，認(rèn)為該居群與其他居群的物候期存在差異。

圖3 PCA分析得分圖

3.4 PLS-DA

PLS-DA負(fù)荷權(quán)重散點(diǎn)圖顯示了變量和變量之間的關(guān)系VIP（variable importance for the projection）圖匯總了變量對(duì)解釋和與相關(guān)的重要性，通常選VIP＞1的變量為特征變量。為具體分析雌雄株銀杏黃酮苷含量差異性，本研究對(duì)雌株、雄株和未進(jìn)行性別分化的苗期銀杏葉樣品進(jìn)行PLS-DA比較分析（圖4～6），首先對(duì)雄株樣品進(jìn)行有監(jiān)督模式的識(shí)別分析，結(jié)果顯示雌雄株銀杏葉中總黃酮醇苷、槲皮素、異鼠李素VIP值均大于1；山柰素存在差異，雄株中山柰素可作為質(zhì)量差異標(biāo)志物，雌株中山柰素VIP值小于1，不能作為質(zhì)量差異標(biāo)志物。雄株樣品中LT居群樣品與TMP居群樣品差異較小；HM居群樣品存在異常離群。雌株樣品居群間差異較小，且存在異常離群值S19，為HM居群樣品。與主成分分析結(jié)果一致。苗期質(zhì)量差異標(biāo)志物包括山柰素和槲皮素；ZAFUD居群樣品組內(nèi)差異較小，苗期樣品均無(wú)異常離群。

4 討論

有研究表明，雌雄異株藥用植物在生理生化以及某些活性成分的含量上有顯著差異[20]。也有研究表明一些雌雄異株藥用植物某些次生代謝產(chǎn)物的含量與性別無(wú)明顯關(guān)系[21]。銀杏雌雄株葉片的生理差異較大。與雄株相比，雌株抗鹽脅迫能力強(qiáng)[22]。由本研究結(jié)果可知，不同地區(qū)栽培技術(shù)及采收時(shí)間對(duì)銀杏葉性狀特征有一定的影響。已有文獻(xiàn)中對(duì)銀杏葉植株性別的表觀性狀鑒別僅可作為參考依據(jù)，并不能完全保證鑒定結(jié)果的可靠性，還需結(jié)合資料記載和分子生物學(xué)手段進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖4 雄株樣品PLS-DA分析得分圖及VIP圖

圖5 雌株樣品PLS-DA分析得分圖及VIP圖

圖6 苗期樣品PLS-DA分析得分圖及VIP圖

本研究通過(guò)對(duì)銀杏葉道地產(chǎn)區(qū)進(jìn)行實(shí)地深入考察，以典型樣品為質(zhì)量評(píng)價(jià)對(duì)象，通過(guò)數(shù)據(jù)化分析進(jìn)一步明確了道地產(chǎn)區(qū)銀杏葉藥材和野生銀杏葉以及觀賞用銀杏葉質(zhì)量的差異，采用UPLC技術(shù)建立了銀杏葉藥材中4種主要黃酮苷類成分的含量測(cè)定方法，以外標(biāo)法精確定量，準(zhǔn)確真實(shí)地揭示銀杏葉藥材中黃酮苷類成分的內(nèi)在質(zhì)量。建立了以指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)合PCA及PLS-DA的銀杏葉藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，為銀杏葉的藥材生產(chǎn)和快速鑒定及其質(zhì)量控制提供參考。

銀杏產(chǎn)業(yè)相關(guān)公司主要經(jīng)營(yíng)銀杏種苗收購(gòu)及供應(yīng)，銀杏樹(shù)價(jià)格從上萬(wàn)元降至千元，持續(xù)走低；銀杏葉單價(jià)從幾十元降至一元，低廉的收成價(jià)格嚴(yán)重打擊了銀杏種植戶的栽培積極性?？茖W(xué)評(píng)價(jià)銀杏藥材質(zhì)量，發(fā)展銀杏系列產(chǎn)品，提高銀杏市場(chǎng)價(jià)值，對(duì)于促進(jìn)產(chǎn)學(xué)研的有機(jī)結(jié)合具有重要意義。

志謝:浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院醫(yī)學(xué)科研中心公共平臺(tái)提供技術(shù)協(xié)助。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國(guó)藥典[S]. 一部. 2020: 329-330.

[2] Goh L M, Barlow P J, Yong C S. Examination of antioxidant activity ofleaf infusions [J]., 2003, 82(2): 275-282.

[3] 丁東, 張展鵬, 權(quán)美平. 銀杏葉提取物的化學(xué)成分、生物活性及應(yīng)用研究進(jìn)展 [J]. 江蘇調(diào)味副食品, 2015, 32(3): 5-8.

[4] Gagné B, Gélinas S, Bureau G,. Effects of estradiol, phytoestrogens, andextracts against 1-methyl-4-phenyl-pyridine-induced oxidative stress [J]., 2003, 21(1): 89-95.

[5] Horáková L, Licht A, Sandig G,. Standardized extracts of flavonoids increase the viability of PC12 cells treated with hydrogen peroxide: Effects on oxidative injury [J]., 2003, 77(1): 22-29.

[6] Kubota Y, Tanaka N, Umegaki K,.extract-induced relaxation of rat aorta is associated with increase in endothelial intracellular calcium level [J]., 2001, 69(20): 2327-2336.

[7] van Beek T A, Montoro P. Chemical analysis and quality control ofleaves, extracts, and phytopharmaceuticals [J]., 2009, 1216(11): 2002-2032.

[8] 劉國(guó)雄, 李華, 張軍. UPLC指紋圖譜快速評(píng)價(jià)銀杏葉提取物及制劑的質(zhì)量 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2017, 23(1): 64-68.

[9] 劉建莊. 銀杏黃酮類化合物的NMR指紋圖譜分析及定量研究 [D]. 長(zhǎng)沙: 湖南師范大學(xué), 2004.

[10] 王德偉, 朱紅, 高爾. 銀杏黃酮的藥理作用和臨床應(yīng)用 [J]. 食品與藥品, 2006, 8(6): 7-9.

[11] 鞠建明, 段金廒, 錢(qián)大瑋, 等. 不同樹(shù)齡邳州銀杏葉在不同采收期指紋圖譜比較 [J]. 中草藥, 2005, 36(9): 1388-1391.

[12] 周昊, 王成章. 銀杏資源加工利用產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀 [J]. 生物質(zhì)化學(xué)工程, 2021, 55(1): 10-14.

[13] 劉小允. 邳州市銀杏產(chǎn)業(yè)發(fā)展新思路 [J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2020, 26(24): 99-101.

[14] 楊偉麗, 馬媛媛. 甘肅不同產(chǎn)地及不同季節(jié)銀杏葉中總黃酮苷的含量測(cè)定 [J]. 甘肅醫(yī)藥, 2013, 32(3): 169-171.

[15] 殷平平. 基于基因組重測(cè)序的銀杏種群進(jìn)化歷史研究 [D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2019.

[16] 張衛(wèi)東. 中醫(yī)藥“五種資源”視角下的邳州銀杏 [J]. 產(chǎn)業(yè)與科技論壇, 2021, 20(4): 42-44.

[17] 王建國(guó), 韓小英, 景麗, 等. 銀川市銀杏樹(shù)雌雄同株形態(tài)特征調(diào)查研究 [J]. 寧夏農(nóng)林科技, 2011, 52(12): 89.

[18] 周興文. 銀杏 () 葉的形態(tài)發(fā)育與演化 [J]. 沈陽(yáng)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 18(4): 83-86.

[19] 范怡梅, 王勇, 譚仁祥, 等. 銀杏葉黃酮甙含量與生長(zhǎng)季節(jié)和植株性別的相關(guān)性研究 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 1998, 23(5): 267-269.

[20] 劉海萍, 巢志茂, 譚志高, 等. 雌雄異株藥用植物的物質(zhì)基礎(chǔ)分析及其研究技術(shù) [J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志, 2012, 19(4): 104-107.

[21] 葉東旭, 李欽, 杜紅巖, 等. 杜仲雌雄株葉高效液相色譜指紋圖譜和次生代謝產(chǎn)物的含量比較 [J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2014, 25(5): 1077-1079.

[22] 蔣雪梅, 胡進(jìn)耀, 戚文華, 等. 銀杏幼苗雌雄株對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的差別 [J]. 云南植物研究, 2009, 31(5): 447-453.

Quality comparison ofleaves from different sources based on UPLC fingerprint and flavonoid glycosides content

HUANG Shen, ZHU Bo, ZHANG Qiao-yan, LIN Liu-fen, YOU Jin-ling, MENG Xiong-yu, ZHANG Quan-long, QIN Lu-ping

School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

To compare the quality of Yinxingye (leaves) from different producing areas, sexes, and tree ages in the same harvest period to provide the basis for resource evaluation.The samples offrom five areas were investigated and collected, and the contents of rutin, quercetin, isorhamnetin and kaempferol were determined by ultra-high performance liquid chromatography (UPLC). The UPLC fingerprint ofwas established by using the software of similarity evaluation system of chromatographic fingerprint of traditional Chinese medicine of National Pharmacopoeia Committee. The quality differences ofleaves of different sexes were discussed by principal component analysis and partial least square discriminant analysis.The similarity of samples in each group was greater than 0.85, and the similarity between female plants was lower than that between male plants. The origin, sex, and tree age had certain effects on the chemical composition and proportion ofleaves, and the similarity of fingerprint of mature plants was larger than that of seedling plants. Phenophase differences between HM population was different from other populations.There are differences in the characters and characteristics ofleaves of male and female plants from different areas. The quality ofleaves in LT population is better and more stable. The stability of seedling plants is higher than mature plants. Besides, the quality differential markers ofleaves of different sexes are different. In this paper, UPLC fingerprint rapid detection method was established, and fingerprint similarity evaluation was carried out. Principal component analysis and partial least squares discriminant analysis were used to analyze the quality ofleaves with different genders, which provided a scientific basis for the quality comparison and resource evaluation ofleaves.

leaves; UPLC fingerprint; flavonoid glycoside; quality differences; rutin; quercetin; isorhamnetin; kaempferol

R286.2

A

0253 - 2670(2022)13 - 4125 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.026

2021-12-06

浙江省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2021C04029）

黃 申（1995—），女，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幤焚|(zhì)評(píng)價(jià)及資源開(kāi)發(fā)利用。Tel: 17326085210 E-mail: 202011014011079@zcmu.edu.cn

秦路平（1966—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幤焚|(zhì)評(píng)價(jià)和資源開(kāi)發(fā)利用研究。Tel: (0571)61768167 E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]