王國恩，楊 帆，劉心雨，葉鈺菁，王若鴻，呂茜婷，劉小婷

人參皂苷Rb1改善拘束應激合并脂多糖誘導的小鼠免疫性肝損傷的作用機制研究

王國恩，楊 帆，劉心雨，葉鈺菁，王若鴻，呂茜婷，劉小婷

廣東藥科大學，廣東 廣州 510006

研究人參皂苷Rb1對拘束應激（restraint stress，RS）合并脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的免疫性肝損傷小鼠的保肝作用及其機制。BALB/c小鼠預先給予人參皂苷Rb1（15 mg/kg）共7 d，給予RS（18 h）合并15 μg/kg LPS誘發(fā)免疫性肝損傷。取小鼠肝臟進行組織學觀察、免疫組化和生化指標檢測，基因和蛋白表達檢測，利用網絡藥理學預測人參皂苷Rb1的潛在信號通路并加以驗證。人參皂苷Rb1改善RS合并LPS誘導肝損傷小鼠的肝臟炎性細胞浸潤、脂肪空泡以及炎癥壞死現象；顯著抑制肝組織白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）表達（＜0.05、0.01）；減少肝細胞凋亡；降低肝組織丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平（＜0.01）；升高肝組織SOD活性和去乙酰化酶Sirtuin-3（SIRT3）蛋白表達水平（＜0.01）。人參皂苷Rb1對LPS誘導的小鼠肝損傷及氧化應激影響不明顯。結合網絡藥理學結果提示人參皂苷Rb1改善氧化應激作用與上調SIRT3的下游靶標叉頭框轉錄因子O3（forkhead box O3，）的基因表達有關（＜0.01）。：人參皂苷Rb1對RS合并LPS誘導小鼠免疫性肝損傷有保護作用，其作用機制可能與上調SIRT3/FoxO3/SOD功能有關。

人參皂苷Rb1；免疫性肝損傷；氧化應激；Sirtuin-3；超氧化物歧化酶

免疫性肝損傷是由免疫系統(tǒng)介導的肝細胞損傷疾病，其主要的病理改變是肝組織內出現大量的炎性細胞浸潤、脂肪空泡、肝組織變性及炎癥壞死等特征。免疫性肝損傷可促進肝纖維化、肝硬化和肝癌等肝臟疾病的發(fā)展[1]。肝損傷的發(fā)生往往伴隨線粒體動力學的改變，使活性氧簇堆積，進而加重肝臟細胞損傷。而線粒體損傷和氧化應激的出現將是各類型肝損傷進展加劇的重要影響因素[2]。

人參具有保肝作用，與調節(jié)免疫功能和抗應激作用有關[3-4]。人參皂苷單體多達150余種，對肝損傷、肝炎、肝纖維化、脂肪肝有改善作用[5]。其中，人參中含量較高的成分人參皂苷Rb1在斑馬魚模型中顯示出改善酒精引起的肝損傷作用[6]。然而，人參皂苷Rb1在拘束應激（restraint stress，RS）負荷下對免疫性肝損傷是否有保護作用仍不清楚。本研究建立RS合并脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的小鼠模型考察人參皂苷Rb1的作用及機制。

1 材料

1.1 動物

7周齡SPF級雄性BALB/c小鼠36只，體質量17～19 g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，動物許可證號SCXK（粵）2018-0002。動物飼養(yǎng)于廣東藥科大學實驗動物中心，室溫20～26 ℃，濕度40%～70%，通風良好，自由進食飲水。動物實驗經廣東藥科大學倫理委員會批準（批準號gdpulacspf2017379）。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rb1（質量分數≥98%，批號CHB210113）購自成都克洛瑪公司；LPS（批號099M4029V）購自美國Sigma公司；蘇木素-伊紅（HE）染液（批號BL700A）購自Biosharp公司；免疫組化SP試劑盒（批號SP-9000）購自中杉金橋生物技術有限公司；白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）抗體（批號SC-52012）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體（批號SC-52746）購自Santa Cruz Biotechnology公司；轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抗體（批號AF1027）購自Affinity公司；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）抗體（批號AB68155）購自英國Abcam公司；去乙?；窼irtuin-3（SIRT3）抗體（批號D22A3）購自美國CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號FD0063）購自弗德生物公司；山羊抗鼠二抗（批號FDM007）購自弗德生物公司；山羊抗兔二抗（批號SA00001-2）購自Proteintech公司；TUNEL試劑盒（批號C1088）購自碧云天公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號A003-1-2）、SOD試劑盒（批號A001-1-1）購自南京建成生物工程研究所；一步法除基因組cDNA試劑盒（批號W9813）購自天根生化科技有限公司；SYBR Green PCR Master Mix（批號067600）購自Toyobo公司；引物合成及測序由生工生物工程有限公司提供。

1.3 儀器

Pannoramic MIDI顯微鏡玻片掃描儀（3D HISTECH）；化學發(fā)光成像儀（莫納生物科技有限公司）；SIGMA2-16KL型通用臺式高速（冷凍）離心機（美國Sigma公司）；電泳儀、qRT-PCR儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

BALB/c小鼠隨機分為對照組、LPS組、RS組、RS＋LPS組、LPS＋人參皂苷Rb1組和RS＋LPS＋人參皂苷Rb1組，每組6只。各給藥組小鼠ip人參皂苷Rb1（15 mg/kg），其余小鼠ip等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)7 d。于給藥第5天15: 00時，給予RS負荷18 h；于給藥第6天16: 00時，ip LPS（15 μg/kg）誘導肝損傷。末次給藥前12 h，小鼠禁食不禁水，給藥后1 h乙醚麻醉處死并收集肝臟組織，于?80 ℃貯存。

2.2 肝組織病理學觀察

將肝組織按常規(guī)石蠟包埋制備4 μm組織切片，按照HE試劑盒染色后，于顯微鏡下觀察并拍照，對炎癥細胞進行統(tǒng)計。

2.3 免疫組化檢測肝組織IL-1β、TNF-α、TGF-β1和SOD蛋白表達

將肝組織石蠟切片進行脫蠟處理后，按照免疫組化試劑盒說明書檢測IL-1β、TNF-α、TGF-β1和SOD的表達，于顯微鏡下觀察并拍照，用Case Viewer軟件進行分析。

2.4 TUNEL法檢測肝細胞凋亡

將肝組織切片按照TUNEL試劑盒說明書分別滴加蛋白酶K、TUNEL檢測液和DAPI染液進行孵育，并用抗熒光淬滅液封片。處理后的樣品置于熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

2.5 肝組織MDA水平與SOD活性檢測

取肝組織20 mg，加入磷酸鹽緩沖液200 μL進行勻漿；12 000 r/min離心10 min，取上清，用BCA法測肝組織蛋白濃度，按照MDA和SOD試劑盒說明書測定MDA水平與SOD活性。

2.6 qRT-PCR檢測肝組織IL-1β、TNF-α、TGF-β1和叉頭框轉錄因子O3（forkhead box O3，FoxO3）mRNA表達

取肝組織30 mg，加入200 μL Trizol試劑，按試劑盒說明書提取總RNA。利用一步法除基因組cDNA試劑盒逆轉錄為cDNA。利用SYBR Green PCR Master Mix在qPCR儀上進行擴增，以18S為內參，采用2???Ct法計算目的基因表達量。引物序列：IL-1β上游引物5’-ATTGTGGCTGTGGAGAAG-3’，下游引物5’-AAGATGAAGGAAAAGAAGGTG-3’；上游引物5’-GGCGGCGGTGCCTATTTC- TC-3’，下游引物5’-GCAGCCTTGTCCCTTGA-3’；上游引物5’-GTGTGGAGCAACATGTGG- AACTCTA-3’，下游引物5’-TTGGTTCAGCCACTG- CCGTA-3’；上游引物5’AACCGGCTCCTTC- AACAGTAA-3’，下游引物5’-GAAGCAAGCAGG- TCTTGGA-3’；上游引物5’-ACGGCTACCA- CATCC-3’，下游引物5’-CAGACTTGCCCTCCA-3’。

2.7 Western blotting檢測肝組織SIRT3蛋白表達

取肝組織30 mg，加入IP裂解液1 mL勻漿，離心取上清。BCA法測總蛋白濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入脫脂牛奶封閉2 h，分別加入SIRT3、GAPDH抗體，4 ℃孵育過夜；加入二抗孵育1 h，以TBST洗滌，滴加超敏化學發(fā)光底物，置于化學發(fā)光成像儀顯影，采用Quantity One軟件分析條帶灰度值。

2.8 網絡藥理學驗證

使用PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi. nlm.nih.gov/）[7]確認人參皂苷Rb1結構，導入到SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction. ch/）和PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/ pharmmapper/）[8]以及BATMAN-TCM（http://bionet. ncpsb.org.cn/batman-tcm/）數據庫，預測出人參皂苷Rb1作用靶點；再通過GeneCards數據庫（https:// www.genecards.org）獲得氧化應激相關的靶點。將2個靶點導入Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/venny/）取交集，用DAVID6.8（https://david. ncifcrf.gov/）對交集富集分析，最后用Cytoscape3.8.2軟件構建人參皂苷Rb1-靶點-信號通路網絡。

2.9 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 人參皂苷Rb1對RS合并LPS誘導小鼠肝損傷的影響

如圖1所示，與對照組比較，LPS＋RS組小鼠肝組織出現炎性細胞浸潤、脂肪空泡，肝組織炎癥因子IL-1β和TNF-α的陽性表達和mRNA表達顯著增加（圖2、3，＜0.05、0.01），細胞凋亡增多（圖4）。人參皂苷Rb1能抑制LPS＋RS刺激的小鼠肝組織炎性細胞浸潤、脂肪空泡及炎癥細胞數量，下調LPS＋RS組小鼠肝組織炎癥因子IL-1β和TNF-α的陽性表達及mRNA表達（＜0.05、0.01），抑制肝細胞凋亡。人參皂苷Rb1對LPS誘導小鼠的肝損傷相關指標影響不顯著。以上結果說明人參皂苷Rb1改善RS合并LPS誘導誘導的小鼠肝損傷。

藍色箭頭：脂肪空泡；紅色箭頭：炎癥浸潤 A-對照組 B-RS組 C-LPS組 D-LPS＋人參皂苷Rb1組 E-LPS＋RS組 F-LPS＋RS＋人參皂苷Rb1組 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與LPS＋RS組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

圖2 人參皂苷Rb1對RS合并LPS誘導肝損傷小鼠肝組織IL-1β和TNF-α蛋白表達的影響 (×40)

圖3 人參皂苷Rb1對RS合并LPS誘導肝損傷小鼠肝組織IL-1β和TNF-α mRNA表達的影響(, n = 3)

圖4 人參皂苷Rb1對RS合并LPS誘導肝損傷小鼠肝組織細胞凋亡的影響(×20)

3.2 人參皂苷Rb1對RS合并LPS誘導小鼠氧化應激的影響

如圖5、6所示，與對照組比較，LPS＋RS組肝組織中TGF-β1陽性表達、基因表達均顯著升高（＜0.01），MDA水平升高（＜0.01），SOD陽性表達及活性顯著降低（＜0.01）。人參皂苷Rb1能抑制LPS＋RS誘導小鼠肝臟中TGF-β1的陽性表達及基因表達（＜0.01），降低MDA水平（＜0.01），并且升高SOD陽性表達及活性（＜0.01）。提示人參皂苷Rb1可能抑制RS合并LPS誘導小鼠氧化應激。研究發(fā)現，SIRT3可使SOD脫乙?；栽鰪奡OD活性[9]。如圖7所示，人參皂苷Rb1可以逆轉LPS＋RS組肝組織SIRT3蛋白表達下降（＜0.01），提示人參皂苷Rb1可能激活SIRT3改善氧化應激。另外，人參皂苷Rb1對LPS組小鼠氧化應激相關指標的影響不大。

圖5 人參皂苷Rb1對RS合并LPS誘導肝損傷小鼠肝組織TGF-β1和SOD蛋白表達的影響(×40)

圖6 人參皂苷Rb1對RS合并LPS誘導肝損傷小鼠肝組織TGF-β1 mRNA表達(n = 3)和MDA水平(n = 6)、SOD活性(n = 5) 的影響

圖7 人參皂苷Rb1對RS合并LPS誘導肝損傷小鼠肝組織SIRT3蛋白表達影響(, n = 4)

3.3 人參皂苷Rb1改善RS合并LPS誘導肝損傷的潛在信號通路預測及驗證

通過網絡藥理學的數據庫篩選和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，獲得人參皂苷Rb1改善肝損傷的作用靶點186個，信號通路78條。保留前20名通路（圖8-A）。其中，TGF-β1、SOD、SIRT3均屬于FoxO通路上的靶點。將FoxO通路與靶點綜合，構建人參皂苷Rb1-靶點-通路網絡圖（圖8-B）。驗證結果（圖8-C）顯示，LPS＋RS組肝組織基因表達量較對照組顯著下降（＜0.05），給予人參皂苷Rb1后肝組織基因表達則顯著增加（＜0.01），確證人參皂苷Rb1改善氧化應激作用與FoxO通路有關。

A-KEGG通路分析 (前20) B-人參皂苷Rb1-靶點-通路網絡圖 C-各組肝組織FoxO3 mRNA表達

4 討論

目前臨床上常用水飛薊素[10]、雙環(huán)醇[11]等治療肝損傷。研究報道，人參皂苷Rb1對酒精負荷引起的斑馬魚肝損傷有改善作用[6]。本研究發(fā)現人參皂苷Rb1對單獨LPS刺激的肝損傷的保護作用不明顯?？紤]到人參有抗應激作用[3]，推測人參皂苷Rb1對應激相關的免疫性肝損傷有保護作用。氧化應激出現會加劇各類型肝損傷[2]。故本研究利用RS合并LPS誘導的小鼠肝損傷模型來評價人參皂苷Rb1對肝損傷的改善作用及機制。結果發(fā)現，人參皂苷Rb1顯著減少了RS合并LPS負荷小鼠的肝損傷，減少炎性細胞浸潤和脂肪空泡，降低炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達，抑制了肝纖維化相關的TGF-β1表達，減少氧化應激相關的MDA水平，提高了SOD活性及肝臟SIRT3蛋白表達。以上結果提示人參皂苷Rb1抗肝損傷作用與抗氧化應激有關，可開發(fā)為保肝作用的候選藥物。

在探討人參皂苷Rb1的保肝作用機制的過程中，本研究發(fā)現人參皂苷Rb1增強了抗氧化酶SOD活性，減輕RS合并LPS誘導的肝損傷。故推測人參皂苷Rb1的抗肝損傷作用機制可能與激活SOD等增強抗氧化功能有關。SIRT3是一種去乙酰化酶，SOD的活性會受到SIRT3去乙?；挠绊慬9]。本研究發(fā)現人參皂苷Rb1干預后，RS合并LPS負荷小鼠肝組織SOD活性增強，去乙?；窼IRT3蛋白表達增加，推測人參皂苷Rb1對于RS合并LPS負荷小鼠的肝損傷保護機制是作用于去乙?；窼IRT3，對SOD脫乙?；?，恢復其抗氧化活性。該機制在Ke等[12]對人參皂苷Rb1改善內皮損傷的研究中得到了證實。Lü等[13]也指出人參皂苷Rb1能夠直接增加人臍靜脈內皮細胞SOD表達，提高SOD活性。

進一步利用網絡藥理學分析獲得人參皂苷Rb1治療肝損傷的潛在信號通路。其中，FoxO信號通路與氧化應激緊密相關[14]，并且人參皂苷Rb1-靶點-FoxO信號通路中含有TGF-β1、SOD、SIRT3等基因。以往的研究表明FoxO3是SIRT3的直接靶標，SIRT3能通過減少FoxO3的乙?；⒋龠MFoxO3的表達，改善氧化應激，從而保護線粒體免受氧化損傷[15]。本研究結果發(fā)現人參皂苷Rb1干預后顯著上調了RS合并LPS負荷小鼠的FoxO3基因表達。進一步證實了人參皂苷Rb1對RS合并LPS負荷小鼠肝損傷的保護作用與SIRT3介導的FoxO3表達上調相關。

綜上所述，人參皂苷Rb1可能通過上調SIRT3/FoxO3/SOD功能，進而改善RS合并LPS誘導的小鼠免疫性肝損傷。可用作評價人參皂苷Rb1對抗免疫性肝損傷的基礎數據，同時為人參皂苷Rb1在免疫性肝損傷的應用提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of ginsenoside Rb1on improving restraint stress and lipopolysaccharide-induced immune liver injury in mice

WANG Guo-en, YANG Fan, LIU Xin-yu, YE Yu-jing, WANG Ruo-hong, LYU Xi-ting, LIU Xiao-ting

Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China

To study the hepatoprotective effect and mechanism of ginsenoside Rb1on immune liver injury induced by restraint stress (RS) combined with lipopolysaccharide (LPS) in mice.BALB/c mice were pre-administered with ginsenoside Rb1(15 mg/kg) for 7 d, mice were given RS (18 h) combined with 15 μg/kg LPS to induce immune liver injury. Liver was taken for histological observation, immunohistochemical and biochemical index detection, gene and protein expression detection, and potential signaling pathway of ginsenoside Rb1was predicted and verified by network pharmacology.Ginsenoside Rb1ameliorated hepatic inflammatory cell infiltration, fat vacuoles and inflammatory necrosis in RS combined with LPS-induced liver injury mice; Significantly inhibited interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and superoxide dismutase (SOD) expressions in liver tissue (< 0.05, 0.01); Decreased hepatocyte apoptosis; Decreased malondialdehyde (MDA) level in liver tissue (< 0.01); Increased SOD activity and sirtuin-3 (SIRT3) protein expression in liver tissue (< 0.01). Ginsenoside Rb1had no obvious effect on LPS-induced liver injury and oxidative stress in mice. Combined with the results of network pharmacology, it was suggested that improvement of oxidative stress by ginsenoside Rb1was related to the up-regulation of gene expression of forkhead box O3 (), which was the downstream target of SIRT3 (< 0.01).Ginsenoside Rb1has protective effect on immune liver injury induced by RS combined with LPS in mice, and its mechanism may be related to the up-regulation of SIRT3/FoxO3/SOD function.

ginsenoside Rb1; immune liver injury; oxidative stress; Sirtuin-3; superoxide dismutase

R285.5

A

0253 - 2670(2022)13 - 4028 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.13.016

2022-03-23

廣東省基礎與應用基礎研究基金資助項目（2020A1515010894）；廣東省中醫(yī)藥管理局科研基金資助項目（20201195）；廣東省醫(yī)學科研基金資助項目（B2019067，A2020615）

王國恩（1988—），男，博士，講師，研究方向為代謝性疾病與中藥活性評價。E-mail: wangge07@126.com

[責任編輯 李亞楠]