付開聰 崔明筠 彭霜

摘要：目的建立哈尼族藥秦盾膠囊微生物限度檢查方法。方法按照2020年版《中國藥典》通則1105、1106、1107，采用常規(guī)法、薄膜過濾法、增加稀釋液法、增加培養(yǎng)基體積法、同時增加稀釋液和培養(yǎng)基體積法進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，計(jì)算各試驗(yàn)菌回收比。結(jié)果薄膜過濾法、增加培養(yǎng)基體積法、同時增加稀釋液和培養(yǎng)基體積法3種方法各試驗(yàn)菌回收比值均在0.5～2.0范圍內(nèi)，結(jié)果符合2020年版《中國藥典》，其中增加培養(yǎng)基體積法結(jié)果優(yōu)于其他方法;控制菌檢查中，陽性對照組檢出陽性菌，試驗(yàn)組和陰性對照均無菌落生長。結(jié)論通過方法適用性試驗(yàn)，所建立微生物限度檢查方法適用于哈尼族藥秦盾膠囊的微生物限度檢查。

關(guān)鍵詞：秦盾膠囊;微生物限度檢查;民族藥;培養(yǎng)基

中圖分類號：R285.5? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 文章編號：1007-2349（2022）06-0065-05

秦盾膠囊是普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所在挖掘整理哈尼族醫(yī)藥過程中，整理得到的哈尼族驗(yàn)方，主要由秦皮、倒心盾翅藤等組成，有清熱、利尿、散瘀、除濕、止痛的作用。前期研究表明，秦盾膠囊有較好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，具有較好的安全性，該方在當(dāng)?shù)嘏R床使用中療效顯著，副作用低，早期痛風(fēng)患者服用該藥后兩月基本恢復(fù)正常，部分典型痛風(fēng)晚期病例服用1～2個療程后，尿酸有明顯降低，能夠有效改善尿酸高引起的痛風(fēng)，緩解患者痛苦[1]。

秦盾膠囊內(nèi)含中藥原粉，在原輔料、生產(chǎn)工藝及環(huán)境等可控因素下，藥材的土壤、水源、運(yùn)輸、加工、儲藏等多個環(huán)節(jié)也可能增加污染風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致制劑微生物污染菌的檢出[2]。為了更好地控制其質(zhì)量，保證臨床用藥安全，本試驗(yàn)按照2020年版《中國藥典》相關(guān)要求，通過方法學(xué)適用性試驗(yàn)建立秦盾膠囊微生物限度檢查方法，更好地控制藥品質(zhì)量和安全，以期為后續(xù)的民族藥制劑研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SW-CJ-2FD型潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、手提式壓力蒸汽滅菌鍋（新華醫(yī)療器械股份有限公司）、DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海錦凱科學(xué)儀器有限公司）、Scout系列電子天平（奧豪斯儀器有限公司）、HHWS-Ⅱ-250型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）、新華牌121℃壓力蒸汽滅菌化學(xué)指示卡（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）、CYW-300B型微生物限度檢測儀（杭州川-實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、玻璃培養(yǎng)皿、滅菌桶、三角瓶、試管、藥匙、一次性無菌滴管（獨(dú)立包裝）、酒精燈等。

1.2 培養(yǎng)基與試藥 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSA（批號：1090951）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSB（批號：1090991）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基SDA（批號：1080971）、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（批號：1082851）、麥康凱液體培養(yǎng)基（批號：1087341）、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基（批號：1090811）等，上述培養(yǎng)基均由廣東環(huán)凱微生物科技有限公司提供，培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果均符合2020版《中國藥典》四部項(xiàng)下規(guī)定。pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：150526，北京三藥科技開發(fā)有限公司），秦盾膠囊（普洱市民族傳統(tǒng)醫(yī)藥研究所制，批號：20210901、20210902、20210903）、純化水、75 %乙醇消毒液等。

1.3 菌種 金黃色葡萄球菌（G0004B）、銅綠假單胞菌（F0042B）、黑曲霉菌（F0041B）、枯草芽孢桿菌（F0058B）、大腸埃希菌（D0069DX）、白色念珠菌（G0012B），上述菌種均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，經(jīng)鑒定合格，本試驗(yàn)所用均為第三代菌種。

2 方法與結(jié)果

2.1 秦盾膠囊微生物限度檢查方法

2.1.1 檢驗(yàn)依據(jù) 由于秦盾膠囊內(nèi)含有中藥原粉，照2020年版《中國藥典》四部制劑通則（0103）膠囊劑和通則（1100）生物檢查法項(xiàng)下要求，固體口服給藥制劑不含豆豉、神曲等發(fā)酵原粉需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、控制菌應(yīng)符合非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標(biāo)準(zhǔn)。按微生物計(jì)數(shù)法（通則1105）、控制菌檢查法（通則1106）及非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（通則1107）方法及要求，進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，建立秦盾膠囊微生物限度檢查方法，結(jié)果應(yīng)符合要求。

2.1.2 菌液制備 參照相關(guān)制劑微生物限度檢查方法[2-5]，在檢驗(yàn)開始前，先取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌幾種菌種分別接種于對應(yīng)的做好標(biāo)記的培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)一定時間，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分別將上述各菌種的培養(yǎng)物稀釋成含菌數(shù)約50～100 cfu/mL的菌液，作為陽性對照菌液，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 參照文獻(xiàn)相關(guān)檢查方法[2]，取3個批次的秦盾膠囊，從每個批次中隨機(jī)抽取3個樣品，打開外包裝，編號，將內(nèi)包裝消毒后置于生物安全柜內(nèi)，打開生物安全柜，精密稱取每個樣品的秦盾膠囊10 g，加無菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基TSB至100 mL，待囊殼和內(nèi)容物全部溶解后，混勻，制成1∶10的供試液，即第一梯度。取上述供試液1 mL加到9 mL的無菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，制成1∶100的供試液，作為第二梯度，同法制成1∶1000 的供試液，作為第三梯度，標(biāo)記好，備用[3-5]。

2.1.4 需氧菌檢查方法考察

2.1.4.1 常規(guī)法 將本實(shí)驗(yàn)分為3組：（1）試驗(yàn)組：精密吸取“2.1.2菌液制備”項(xiàng)下菌液0.1 mL，加到9.9 mL的第一梯度供試液中，作為試驗(yàn)組溶液;（2）供試品組：精密吸取0.1 mL稀釋液，加入9.9 mL的1∶10第一梯度供試液中，混勻，作為供試組溶液;（3）陽性菌對照組：精密吸取0.1 mL菌液，加入9.9 mL稀釋液中，混勻，作為陽性菌液對照組溶液[6-9]。

接種：分別吸取上述三組溶液1 mL，分別注入平皿中，照2020年版《中國藥典》通則1105，分別加入15～20 mL 45℃左右的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基TSA和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基SDA，混勻，凝固，每組制備1個相同的平行對照皿，放入相應(yīng)的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，計(jì)算平均菌落數(shù)。

2.1.4.2 薄膜過濾法 精密吸取“2.1.4.1常規(guī)法”項(xiàng)下3個實(shí)驗(yàn)組溶液各1 mL，至100 mL pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中過濾沖洗，每組沖洗三次，每次100 mL，然后將濾膜取下，菌面朝上貼于相應(yīng)的培養(yǎng)基上，放入培養(yǎng)箱，在適宜的條件下培養(yǎng)，測定菌落數(shù)[2]。

2.1.4.3 增加稀釋液法 參照常規(guī)法，精密吸取“2.1.2菌液制備”項(xiàng)下菌液0.1 mL，加入9.9 mL制備好的1∶100和1∶1000的秦盾膠囊供試液中，混勻，作為試驗(yàn)組溶液，分別精密吸取制備好的試驗(yàn)組溶液1 mL，注入培養(yǎng)皿中，加入15～20 mL溫度不超過45 ℃熔化的TSA或SDA培養(yǎng)基，混勻，凝固，每組制備1個相同的平行對照皿，標(biāo)記好放入相應(yīng)的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，計(jì)算平均菌落數(shù)[2]。

2.1.4.4 增加培養(yǎng)基體積法 取制備好的菌液0.1 mL，加入到9.9 mL的1∶10供試液中，混勻，作為試驗(yàn)組，分別吸取0.5 mL和0.2 mL注入培養(yǎng)皿中，倒入15～20 mL溫度不超過45 ℃熔化的TSA和SDA培養(yǎng)基，混勻，凝固，每組制備1個相同的平行對照皿，標(biāo)記好放入相應(yīng)的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，計(jì)算平均菌落數(shù)。

2.1.4.5 同時增加稀釋液和培養(yǎng)基體積法 吸取菌液0.1 mL，分別加入9.9 mL的1∶100和1∶1000的供試液中，混勻，作為試驗(yàn)組溶液，分別吸取制備好的溶液0.2、0.4、0.5 mL注入培養(yǎng)皿中，加入15～20 mL溫度不超過45℃的TSA和SDA培養(yǎng)基，混勻，凝固，每組制備1個相同的平行對照皿，標(biāo)記好放入相應(yīng)的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，計(jì)算平均菌落數(shù)。

2.1.5 回收比計(jì)算 回收比計(jì)算按下列公式計(jì)算：試驗(yàn)組菌落數(shù)回收比：（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液對照組平均菌落數(shù)。稀釋液菌落數(shù)回收比：（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-稀釋劑對照組平均菌落數(shù)）/菌液對照組平均菌落數(shù)

2.1.6 考察結(jié)果

2.1.6.1 常規(guī)法計(jì)數(shù)結(jié)果 本次試驗(yàn)在相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，用常規(guī)法考察了常見中藥材的幾種菌的回收比，為了使結(jié)果更加準(zhǔn)確，每個批次測定3次，結(jié)果見表1。

根據(jù)上述表1常規(guī)法測定結(jié)果可知，9個試驗(yàn)組各菌株的回收比未完全在0.5～2之間，其中，4組樣品中金黃色葡萄球菌的平均回收比偏高，同時9組樣品的金黃色葡萄球菌的平均回收比均低于0.5，9組樣品中有7個白色念珠菌回收比低于0.5，說明秦盾膠囊對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有較強(qiáng)的抑制作用，本次試驗(yàn)選用金黃色葡萄球菌和白色念珠菌作為需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)測定的敏感菌株。霉菌、酵母菌計(jì)數(shù)時，得到的各試驗(yàn)菌的平均回收比在0.5～2.0之間，說明試驗(yàn)符合2020年版《中國藥典》四部要求，可用常規(guī)法進(jìn)行檢查。

2.1.6.2 秦盾膠囊微生物檢查敏感菌適用性考察 結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，根據(jù)常規(guī)法計(jì)數(shù)結(jié)果，以金黃色葡萄球菌和白色念珠菌為敏感菌，按照“2.1.4.2”、“2.1.4.3”、“2.1.4.4”、“2.1.4.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，每個批次樣品做3次，通過比較四種方法得到的回收比，確定需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)方法。結(jié)果見表2。

由表2秦盾膠囊微生物檢查敏感菌回收比結(jié)果可知，敏感菌株回收比差異明顯。其中，金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)結(jié)果中，增加稀釋液法（1∶100）組有3個樣品平均回收比低于0.5，說明當(dāng)供試液濃度為1∶100時，對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用;薄膜過濾法、增加培養(yǎng)基體積法、同時增加稀釋液培養(yǎng)基體積法三種方法所得平均回收比均在0.5～2.0之間，且增加培養(yǎng)基體積法（0.2 mL/皿）菌株平均回收比優(yōu)于其他方法，故選擇增加培養(yǎng)基體積法進(jìn)行秦盾膠囊需氧菌計(jì)數(shù)檢查。

2.1.6.3 需氧菌檢查方法適用性驗(yàn)證 根據(jù)常規(guī)法計(jì)數(shù)結(jié)果及敏感菌適用性考察，選用增加培養(yǎng)基體積法對3個批次秦盾膠囊進(jìn)行需氧菌檢查方法適用性試驗(yàn)驗(yàn)證，按“2.1.4.4增加培養(yǎng)基體積法”項(xiàng)下進(jìn)行操作，計(jì)數(shù)結(jié)果見表3。

根據(jù)表3秦盾膠囊微生物檢查適用性驗(yàn)證結(jié)果可知，3個批次9組樣品的秦盾膠囊5種菌株平均回收比均在0.5～2.0范圍內(nèi)，符合2020年版《中國藥典》相關(guān)要求，確定以增加培養(yǎng)基體積法測定溫度膠囊需氧菌總數(shù)，方法可行。

2.2 秦盾膠囊控制菌檢查 根據(jù)“2.1.1檢驗(yàn)依據(jù)”項(xiàng)下《中國藥典》對非無菌含藥材原粉制劑的微生物限度檢查要求，照通則1106項(xiàng)下控制菌檢查方法分別對秦盾膠囊中耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌、沙門菌進(jìn)行檢查。

2.2.1 耐膽鹽革蘭陰性菌 照分別吸取“2.1.3供試品溶液制備”項(xiàng)下各樣品1∶10的供試液各1 mL加入9 mL的腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，作為供試品試驗(yàn)組。同法分別吸取各樣品1∶10供試品溶液各1 mL加入到9 mL的腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，并加入0.1 mL“2.1.2菌液制備”項(xiàng)下的大腸埃希菌液和銅綠假單胞菌液，作為陽性菌對照組。再取1 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加入到9 mL的腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，作為陰性對照組。

2.2.2 大腸埃希菌 分別吸取1mL “2.1.3供試品溶液制備”項(xiàng)下各樣品的1∶10的供試品溶液加入到9 mL麥康凱液體培養(yǎng)基中，作為供試品試驗(yàn)組;同法吸取1mL各樣品1∶10的供試品溶液加入到9 mL的麥康凱液體培養(yǎng)基中，并加入0.1mL “2.1.2菌液制備”項(xiàng)下大腸癌抑菌液，作為陽性菌對照組;再吸取1 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加入到麥康凱液體培養(yǎng)基中，作為陰性對照組。

2.2.3 沙門菌 分別吸取1 mL“2.1.3供試品溶液制備”項(xiàng)下各樣品1∶10的供試品溶液，加入到9 mL RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，作為供試品試驗(yàn)組;同法吸取1 mL各樣品1∶10的供試品溶液加入到9 mL RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，并加入0.1 mL“2.1.3菌液制備”項(xiàng)下乙型副傷寒沙門氏菌液，作為陽性菌對照組;吸取1 mL胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基加入到9 mL的RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基中，作為陰性對照組。

2.2.4 控制菌檢查結(jié)果 將上述制備好的培養(yǎng)基放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，在適宜條件下培養(yǎng)并觀察記錄，秦盾膠囊控制菌檢查結(jié)果見表4。

本次試驗(yàn)采用常規(guī)法對秦盾膠囊控制菌進(jìn)行檢查，從表4控制菌檢查方法適用性結(jié)果可以看出，各試驗(yàn)組和陰性對照組均無菌落生長，而陽性對照組都檢出了陽性菌，說明可以用本試驗(yàn)方法可用于秦盾膠囊控制菌的檢查。

3 討論

有研究表明，藥品微生物限度檢查容易受到來自各種因素的影響[10]，包括藥品原輔料的采集、包材、生產(chǎn)工藝、設(shè)施、環(huán)境、人員等方方面面，是客觀衡量藥品質(zhì)量的重要指標(biāo)[11-13]。為了建立針對秦盾膠囊影響小，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，效率高的微生物限度檢查方法，本試驗(yàn)進(jìn)行了方法適用性試驗(yàn)，并對其可靠性和可行性進(jìn)行了分析和驗(yàn)證。

在對秦盾膠囊需氧菌、霉菌酵母菌檢查試驗(yàn)中可以看出，哈尼族藥秦盾膠囊具有一定的抑菌作用，在進(jìn)行微生物限度檢查的過程中，應(yīng)先消除其本身對細(xì)菌的抑制作用，保證被檢查的微生物正常的生長和繁殖[2，12]。通過查閱相關(guān)非無菌含中藥原粉制劑文獻(xiàn)及研究[13-15]，本試驗(yàn)首先采用常規(guī)法對各類需氧菌進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)秦盾膠囊對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌較為敏感，有較強(qiáng)的抑制作用。故分別采用薄膜過濾法、增加稀釋液法、增加培養(yǎng)基體積法、同時增加稀釋液和培養(yǎng)基體積法對其進(jìn)行適用性試驗(yàn)并進(jìn)行驗(yàn)證，當(dāng)稀釋液濃度為1∶100時，對敏感菌仍然具有抑制作用，而薄膜過濾法、增加培養(yǎng)基體積法及同時增加稀釋液和培養(yǎng)基體積法三種方法所得到菌株平均回收率均在0.5～2.0之間，說明這3中方法對細(xì)菌抑制作用基本消除，3種方法中，增加培養(yǎng)基體積法（0.2 mL/皿）菌株回收比優(yōu)于其他方法，最終選擇增加培養(yǎng)基體積法進(jìn)行下一步試驗(yàn)，通過驗(yàn)證，結(jié)果符合《中國藥典》相關(guān)要求。

在對秦盾膠囊控制菌檢查試驗(yàn)中，通過查閱相關(guān)資料及文獻(xiàn)，采用了常規(guī)法對其檢查，不同批次樣品檢出結(jié)果基本一致，陽性對照組均有菌落生長，也說明本方法對控制菌的抑菌作用基本沒有，適用于對??? 哈尼族藥秦盾膠囊的控制菌檢查。具有操作簡單、誤差較小、成本低，微生物污染風(fēng)險(xiǎn)小等特點(diǎn)。

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（收稿日期：2022-02-16）