李 賽，高翔宇，蘇飛鴻，顧愛星

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052

棉花枯萎病是由尖孢鐮刀菌引起的一種真菌性土傳病害，病原為為尖孢鐮刀菌萎蔫?；驼婢?[Fusarium oxysporium Schl.f.sp.vasinfectum（Atk）Snyder&Hanson]，屬半知菌亞門鐮刀菌屬[1]，危害部位為棉花維管束。關(guān)于棉花枯萎病的致病機(jī)制的研究報(bào)道，主要集中在是因?yàn)椴≡蚣闹髦参锔胁『笏a(chǎn)生的毒素致病，還是菌絲體或其產(chǎn)物堵塞導(dǎo)管而導(dǎo)致病株枯萎；有些學(xué)者認(rèn)為,當(dāng)尖孢鐮刀菌從根毛侵入寄主植物后,擴(kuò)展到導(dǎo)管周圍,果膠酶等水解酶、分泌纖維素酶,用來降解寄主植物細(xì)胞壁,植物細(xì)胞壁被降解以后，細(xì)胞內(nèi)的果膠等物質(zhì)就會堵塞寄主植物的導(dǎo)管,寄主植物因吸水困難而萎蔫致死，即阻塞學(xué)說[2];有些學(xué)者認(rèn)為尖孢鐮刀菌侵入寄主植物之后,會分泌一些有毒物質(zhì),這些毒素在尖孢鐮刀菌致病過程中起著重要作用。目前發(fā)現(xiàn)的毒素有鐮刀菌酸、恩鐮孢毒素、脫氫鐮刀菌酸、串珠鐮刀菌素、白僵菌素、伏馬菌素、麥角固醇、卡毒素以及玉米赤烯酮等。這些有毒物質(zhì)能損傷寄主植物根系，也會影響種子萌發(fā)，呂金殿等證實(shí)了病原菌毒素蛋白是棉花致病的關(guān)鍵，即毒素學(xué)說[3]。由于枯萎病為土傳真菌病害，通過田間噴灑普通化學(xué)農(nóng)藥等解決棉花枯萎病危害效果不明顯，并加大了對環(huán)境的污染[4]。為了響應(yīng)國家的綠色防治的號召，培育抗病棉花新品種和生物防治是解決這一問題的有效途徑。

現(xiàn)階段的研究中已發(fā)現(xiàn)許多對棉花枯萎病菌有抑制作用的拮抗微生物[5][6]，經(jīng)過大量的試驗(yàn)驗(yàn)證，許多拮抗微生物被開發(fā)為生防產(chǎn)品逐步走向?qū)嶋H應(yīng)用[7]。周京龍[8]等發(fā)現(xiàn)蠟狀芽孢桿菌YUPP-10菌株能抑制尖鐮孢的生長、促進(jìn)棉花部分生物量指標(biāo)的增長并控制枯萎病的危害；賈熙超[9]等發(fā)現(xiàn)生防菌JNJX-2多粘類芽孢桿菌是通過抑制病原菌絲和孢子發(fā)揮作用的，抑菌物質(zhì)通過菌絲發(fā)生溶斷、原生質(zhì)溢出、孢子壁破碎等途徑使病原菌無法再侵染宿主植物；丁建朋[9]等研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌HFW217對棉花枯萎病的預(yù)防和治療作用顯著，溫室和田間對棉花枯萎病防治效果分別達(dá)到77.62%和73.18%；李玉洋[10]等從土壤中分離出的解淀粉芽孢桿菌SN06，其拮抗作用具有較好的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性與蛋白酶穩(wěn)定性，接種解淀粉芽孢桿菌SN06可顯著降低枯萎病的發(fā)病指數(shù),平均防效高達(dá)65.19%。

新發(fā)展階段，由于國家對環(huán)境污染和生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的重視，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)也要遵循綠色、健康、高效的發(fā)展理念，生物型種衣劑以其對環(huán)境無殘留、無污染且安全性好等優(yōu)點(diǎn)成為棉花病蟲害防治的重要發(fā)展方向[11]。

本實(shí)驗(yàn)將已在室內(nèi)進(jìn)行防治效果初步鑒定的生防菌短小芽孢桿菌KX-33為主要成分制作種衣劑，研究其在田間的實(shí)際防治效果，為新型微生物種衣劑的制作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試棉種

選用抗病品種：10719；耐病品種：10857；感病品種：10900。

1.1.2 供試種衣劑

羧甲基纖維素鈉（滬試）。

1.1.3 供試微生物與藥劑

拮抗微生物；由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花病害研究室篩選出具有對棉花枯萎病較好拮抗作用的的短小芽孢桿菌KX-33。

病原菌：棉花枯萎病病原菌。

藥劑：0.3%四霉素水劑(遼寧微科生物工程股份有限公司)，200億/g枯草芽孢桿菌微生物菌劑（山東慧可豐生物有限公司），8%寧南霉素水劑（淹溶生物股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌菌液制備

挑取純化的拮抗菌KX-33單菌落，接種至裝有100mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，進(jìn)行搖菌處理使拮抗菌快速繁殖，將孢子懸液濃度調(diào)至1×108CFU/mL備用。

1.2.2 種衣劑的制作

設(shè)置菌液與成膜劑用量比例為100∶1，種衣劑成分包括KX-33菌液、成膜劑、LB液體培養(yǎng)基，含KX-33種衣劑現(xiàn)配現(xiàn)用，種衣劑與種子比例為1∶100[12]。

選用有效成分含量為200億/g枯草芽孢桿菌微生物菌劑與成膜劑按照100∶1混合，制成50mL液體種衣劑，現(xiàn)配現(xiàn)用。成分為成膜劑、去離子水。選用有效成分含量為0.3%四霉素水劑和8%寧南霉素水劑，配制成1g/mL藥液，與成膜劑按照100∶1混合，制成50mL液體種衣劑，現(xiàn)配現(xiàn)用[13]。

將各配好種衣劑分別與棉花種子拌種包衣，晾干備用。

1.2.3 田間病原菌接種

利用菌包培養(yǎng)物法進(jìn)行田間致病菌的接種操作：將病原菌活化培養(yǎng)后，挑取菌餅進(jìn)行180 r/min、30℃搖菌培養(yǎng)7d，將菌液裝入菌包中于以進(jìn)行消毒殺菌的陰涼倉庫內(nèi)靜置培養(yǎng)，待菌包長滿菌絲于7月15日棉花現(xiàn)蕾期剖開撒入距棉株根部10cm下的土壤中埋藏，及時澆水以保證菌種活性[14]。

1.2.4 田間防效試驗(yàn)

選取健康飽滿的棉種進(jìn)行脫絨處理，滅菌清洗后晾干[14]。試驗(yàn)設(shè)置五組處理：KX-33、枯草芽孢桿菌、寧南霉素與四霉素處理以及無菌水對照，每組處理三次隨機(jī)重復(fù)。每次重復(fù)為2.5×2m小區(qū)，穴間距為10cm，每穴兩粒，出苗后進(jìn)行定苗間苗操作。田間進(jìn)行常規(guī)管理，病原菌接種后，自接種后20d開始，每隔15d進(jìn)行一次病情記錄，至9月20進(jìn)行剖稈數(shù)據(jù)收集，統(tǒng)計(jì)總?cè)~數(shù)及發(fā)病葉數(shù)。病情分級標(biāo)準(zhǔn)如下[15]：

表1 病情分級標(biāo)準(zhǔn)

表2 田間病情考察分級標(biāo)準(zhǔn)

病情指數(shù)=∑（該級植株數(shù)×病害等級）/（調(diào)查植株數(shù)×最嚴(yán)重等級）×100；

防治效果（%）=[（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)]×100[15]。

1.2.5 農(nóng)藝性狀調(diào)查

在8月份末，對棉花的農(nóng)藝性狀展開調(diào)查，測量各項(xiàng)生長性狀，并記錄數(shù)據(jù)：株高、始節(jié)高、果枝數(shù)、有效果枝數(shù)、鈴數(shù)、有效鈴數(shù)；并在田間對每次處理選取連續(xù)的10株棉花，室內(nèi)記錄棉花的平均籽棉重、平均皮棉重。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和SPSS20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間防效分析

由表4可知，三種不同抗病品種在個處理下病情指數(shù)均顯著低于對照。其中抗病品種10719在枯草芽孢桿菌處理下病情指數(shù)均為最低，最低為6.58；耐病品種10857在枯草芽孢桿菌處理下病情指數(shù)最低，為6.87。三種品種在枯草芽孢桿菌處理下均為最低，KX-33處理下各品種的病情指數(shù)與防效均與枯草芽孢桿菌相近。

表3 8月5日病情防效

表4 8月20日病情防效

由4張病情指數(shù)表中可知，四種處理的最高防效依次為58.72%、56.49%、62.48%和60.83%。防效從8月5日隨時間逐漸下降至9月20日收獲期前各個處理的防效分別下降至44.42%、42.92%、47.28%、46.10%，總體防效水平為枯草芽孢桿菌處理＞KX-33處理＞寧南霉素處理＞四霉素處理。就品種水平而言抗病品種10719對微生物種衣劑的敏感程度較高，防效表現(xiàn)明顯優(yōu)于其他兩種棉花品種。實(shí)驗(yàn)證明KX-33種衣劑處理的防效表現(xiàn)良好，對棉花枯萎病有較強(qiáng)的抑制作用。

表5 9月5日病情防效

表6 9月20日病情防效

2.2 農(nóng)藝性狀分析

四組藥劑對棉株的農(nóng)藝性狀具有不同程度的促生效果，對各項(xiàng)農(nóng)藝性狀的增益效果有所差異。株高方面，KX-33處理下的株高較對照組增長尤為明顯，增幅為7.81%，最高為66.73 cm；始節(jié)高方面，枯草芽孢桿菌處理下較對照組增長尤為明顯，增幅為16.16%，最高始節(jié)高為18.23cm；果枝數(shù)、鈴數(shù)方面四種處理均略高于對照組且四種處理之間的差異不明顯；產(chǎn)量方面，KX-33處理的皮棉與籽棉產(chǎn)量相較于其他處理增產(chǎn)效果顯著，相較于對照組增產(chǎn)幅度為19.14%和13.38%。KX-33棉株的促生效果的增益顯著，對株高、始節(jié)高、皮棉和籽棉產(chǎn)量等方面均有影響。

表7 藥劑對棉花農(nóng)藝性狀的影響（10719）

表8 藥劑對棉花農(nóng)藝性狀的影響（10765）

表9 藥劑對棉花農(nóng)藝性狀的影響（10900）

3 討論

現(xiàn)階段在田間的實(shí)際生產(chǎn)中，由于價格、購買途徑和使用方法等原因，微生物菌劑的市場占比依舊較少，仍以化學(xué)藥劑為主。

在田間防效實(shí)驗(yàn)中，含短小芽孢桿菌KX-33的種衣劑包衣的三個品種，均對棉花枯萎病表現(xiàn)出良好的防治效果，總體防效表現(xiàn)中品種10719的防效表現(xiàn)較優(yōu)，防效率最高為60.83%，柳自清[13]等的盆栽防效實(shí)驗(yàn)中的盆栽防效試驗(yàn)中接種棉花枯萎病第45d時，1×108CFU/mL濃度微生物種衣劑處理下對兩個品種棉花的防效均最好，分別為65.35%和63.77%，略高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果；賈熙超[16]通過盆栽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株JNJX-2對棉花枯萎病有一定的防治作用，防效為54.77%，低于本試驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中的防效數(shù)據(jù)略低于柳自清室內(nèi)防效試驗(yàn)，分析原因可能是田間的發(fā)病效果更加嚴(yán)重。

后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可以將拮抗菌與藥劑或者微生物菌劑混合進(jìn)行協(xié)同防治效果的研究，繼續(xù)優(yōu)化種衣劑配方，為微生物種衣劑的開發(fā)提供參考依據(jù)。