查 娟，潘曉軍，李恩民，陳 龍，章潮軍，陳春峰，商甜波，羅艷娟，徐慧婷

(1.浙江醫(yī)藥股份有限公司，浙江 紹興 312000；2.脂溶性維生素浙江省工程研究中心，浙江 紹興 312000；3.紹興文理學院 化學化工學院，浙江 紹興 312000)

乳腺癌（HBDC）是發(fā)生在乳腺上皮組織的一種惡性腫瘤[1-2]，乳腺上皮細胞發(fā)生癌變導致細胞增殖失控，主要發(fā)生在為40～60 歲的絕經(jīng)婦女群體中。據(jù)2012 年全球腫瘤流行病統(tǒng)計數(shù)據(jù)(GLOBOCAN)顯示，全球每年新增病例約167 萬例，有超過52.5 萬人死于乳腺癌。乳腺癌已成為危害人類健康的一種嚴重疾病。由于乳腺癌細胞不再具有正常細胞的特征，細胞之間連接疏松，易脫落為游離細胞，可以通過血液或淋巴擴散到全身，從而嚴重危及生命。我國乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，北京、上海等大都市發(fā)病率達56/10萬，已經(jīng)成為婦女發(fā)病率第一的惡性腫瘤[3]，嚴重影響了患者的生活質量。

乳腺癌對患者體內雌激素存在依懶性，主要原因在于雌激素能夠刺激乳腺細胞快速增殖。細胞不斷分裂產(chǎn)生新細胞，分裂增殖過程的核心是脫氧核糖核酸（DNA）的復制，DNA 復制過程會產(chǎn)生單鏈DNA，相比擁有穩(wěn)定堿基對的雙鏈DNA，單鏈DNA 更易發(fā)生損傷[4]。目前臨床上主要有三種治療乳腺癌的手段：卵巢剝除、抗雌激素藥物及芳香酶抑制劑[5-7]。其中芳香酶抑制劑有特異選擇性強、耐受性強、毒副作用較小等優(yōu)點，是目前應用最廣的治療手段。芳香酶抑制劑[8-11]作為新一代藥物，其作用機制為：作用于人體雌激素合成路線上的限速酶——芳香化酶(AR,CYP19)，通過占據(jù)雌激素合成過程中芳香化酶的位點，打斷其合成以降低雌激素的生成水平，持續(xù)性地降低人體內的雌激素水平。主要代表藥物為依西美坦、來曲唑及阿拉曲唑，其中依西美坦具有可口服、高特異性、無明顯交叉耐藥反應等優(yōu)點，因此臨床應用廣，是研究的熱點[12]。依西美坦屬于甾體類芳香酶抑制劑（AIs），AIs 高度的專一性和持久的作用性引起人們的注意，科研人員一直在探索合成新型的甾體化合物，為新型抗乳腺癌藥物的開發(fā)做前期工作。

最初的甾體藥物都是天然存在的化合物，一般從動物腺體中分離提取得到，由于甾體藥物在臨床上表現(xiàn)優(yōu)良，治療效果好，科學家開始針對其結構進行研究并探索人工合成這類化合物的方法[13]，自甾體藥物開發(fā)以來，其發(fā)展迅速已成為第二大生產(chǎn)藥物，僅次于抗生素，產(chǎn)品種類超過400 種。從結構上看，甾體化合物屬于多環(huán)化合物，擁有四環(huán)結構，由3 個六元環(huán)和1 個五元環(huán)構成，且一般在C-10、C-13 上有兩個角甲基，結構上可以修飾的地方較多。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)：以甾體化合物為母核，對其進行支鏈或者雜原子修飾得到的部分衍生物具有類似甚至超越母核的藥理活性[14-20]，在抗癌藥開發(fā)方面有重大應用前景，因此該領域的研究吸引了越來越多人的注意。

本文提供一種雄烯二酮衍生物—6,16-二亞甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）的制備方法，具體路線見圖1。本研究以依西美坦（Ⅱ）和多聚甲醛為原料，二甲胺鹽酸鹽為催化劑，乙醇為溶劑，采用一鍋法經(jīng)Mannich 反應直接合成目標產(chǎn)物6,16-二亞甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）。通過氣相色譜-質譜法（GC-MS）、核磁共振波譜法（1H NMR、13C NMR）等表征并確認其結構。同時，對該化合物的體外抗腫瘤活性進行實驗，選用細胞株分別為胃癌細胞株（MKN45）、肺癌細胞（HCC-78）、人乳腺癌細胞（MDA-MB-231）、肝癌細胞（HepG2）以及卵巢癌細胞（3AO）。

圖1 6,16-二亞甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）的合成路線

1 儀器與試劑

核磁共振儀：Bruker AVANCE DMX ⅡⅠ400M；高效液相色譜儀：Agilent Technologies 1200 Series；氣質聯(lián)用儀：Agilent Technologies MS5973NGC6890N；酶聯(lián)免疫檢測儀HBS-1096A。

試劑均為市售分析純。

2 實驗部分

2.1 6,16-二亞甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）的制備

向150 mL 的三口反應瓶中依次加入依西美坦（14.80 g，0.050 mol）、多聚甲醛（1.65 g，0.055 mol）、二甲胺鹽酸鹽（0.40 g，0.005 mol）和乙醇（65 mL），攪拌溶解后，升溫至回流并繼續(xù)攪拌反應，薄層色譜跟蹤反應[展開劑體積比為V（乙酸乙酯）:V（石油醚）=1:3]，3 h 后反應結束。減壓蒸餾回收溶劑，得到棕色粗品，濕法過柱精制得到目標化合物（I），為淡黃色固體，稱重為13.20 g，液相含量為98.6%，熔點為150 ℃～151 ℃，收率為86.3%。

其中，濕法過柱步驟為：先向玻璃層析柱中加入一小團棉花堵住出口，裝柱；向層析柱中緩緩倒入硅膠直至2/3 處，用洗耳球敲平整，然后倒入配好的洗脫劑[V（乙酸乙酯）：V（石油醚）=1:6]，并通過加壓裝置加快洗脫劑的流出，直至柱子中的硅膠無氣泡或空隙，呈緊實狀，再倒入洗脫劑至液面處于硅膠平面上方1～2 cm 時，關閉活塞，停止加壓，準備加樣。將減壓旋蒸得到的產(chǎn)品溶解于少許二氯甲烷中，用長吸管吸取少量產(chǎn)物緩慢沿壁加樣，燒瓶中的產(chǎn)物加完后，將燒瓶潤洗再加樣，重復直至燒瓶中基本沒有反應液，加樣完成。先用吸管緩慢滴加洗脫劑，到安全高度后可以直接倒入，將產(chǎn)物沖洗下來。用小試管接洗脫液，過程中通過TLC 檢測跟蹤過柱過程，將含有目標化合物的洗脫液合并收集，減壓旋干得到目標化合物。

產(chǎn)物結構驗證：MS：308，293，281，265，207，160，148（100%），128，105，91，77。

1HNMR (δ,ppm,400 MHz,CDCl3)：7.096 (d,J=10.4 Hz,1H,);6.274 (d,J=10.4 Hz,1H,CH=);6.190 (s,1H,CH=);6.117 (s,1H);5.440 (s,1H);5.082,5.013 (s,1H,1H,=CH2);2.591～2.663 (m,2H,-CH2-);2.269～2.341 (m,2H);1.929～2.057(m,6H);1.189(s,3H);0.979(s,3H)。

13C NMR (δ,ppm,100 MHz,CDCl3)：207.3;187.1;167.8;153.9;145.2;143.6;127.8;122.8;119.3;112.5;49.9;48.2;47.8;43.7;39.3;34.9;31.2;29.2;22.04;19.7;14.2。

2.2 不同條件下制備6,16-二亞甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）

在150 mL 的三口反應瓶中依次加入依西美坦（14.80 g，0.050 mol）、多聚甲醛、二甲胺鹽酸鹽，65 mL 乙醇于一定溫度下攪拌反應，薄層色譜跟蹤檢測反應至結束，減壓旋干后，過柱得到目標化合物（I），計算收率，見表1。

表1 不同條件下化合物（I）收率

實驗發(fā)現(xiàn)，該反應中最佳投料比為依西美坦:多聚甲醛:二甲胺鹽酸鹽=1:1.1:0.1（摩爾比），最佳反應溫度為78.3 ℃，即回流溫度。

2.3 6,16-二亞甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）體外抗腫瘤活性實驗

采用國際通用的噻唑藍法（MTT 法）進行，對化合物（I）進行體外腫瘤細胞抑制活性實驗。首先，在96 孔細胞板上接種4×104個對數(shù)生長期的腫瘤細胞，分別為胃癌細胞株（MKN45）、肺癌細胞（HCC-78）、人乳腺癌細胞（MDA-MB-231）、肝癌細胞（HepG2）、卵巢癌細胞（3AO）；按每孔5000個細胞鋪板，5 個復孔，細胞貼壁后，再加入不同濃度待測樣品（I）。本實驗共設置6 個藥物濃度梯度，分別為：1.0，5.0，25，125，250 和500（單μmol/L）的化合物樣品組；空白組加入含5% 胎牛血清（FBS）的DMEM 培養(yǎng)基（一種含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基），二甲基亞砜組（DMSO 組）加入含1% DMSO 的完全培養(yǎng)液；72 h 后，于96 孔板對應孔中加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，棄去孔板中上清液，加入150 μL 的DMSO，用搖床搖勻（10 min，60 次/min），使甲瓚充分溶解。待細胞內藍紫色結晶溶解后，利用酶標儀測定其490 nm 處吸光度值（OD490），計算化合物（I）對細胞生長的半數(shù)抑制濃度IC50。

表2 化合物（I）對不同腫瘤細胞株的IC50

實驗結果表明，雄烯二酮衍生物（I）能夠抑制多種腫瘤細胞的生長，其中對人乳腺癌細胞（MDA-MB-231）和卵巢癌細胞（3AO）抑制效果較好。

3 總結與展望

本文設計了一種雄烯二酮衍生物——6,16-二亞甲基雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮（I）的制備方法：以依西美坦和多聚甲醛為原料，二甲胺鹽酸鹽為催化劑，乙醇為溶劑，采用一鍋法一步反應直接合成目標產(chǎn)物（I），并通過氣相色譜-質譜法、核磁共振波譜法等確認了結構。最佳反應條件為：投料比為n(依西美坦):n(多聚甲醛):n(二甲胺鹽酸鹽)=1:1.1:0.1，反應溫度為78.3 ℃，即回流溫度。同時，本文對該化合物的體外抗腫瘤活性進行了實驗，結果表明化合物（I）對人乳腺癌細胞（MDA-MB-231）和卵巢癌細胞（3AO）抑制效果較好。開發(fā)新的具有甾體母核的芳香酶抑制劑是未來值得長期研究的課題方向。本研究可為新型甾體類抗乳腺癌藥物的開發(fā)提供借鑒和參考。