陳韋任，霍 霞，周玉杰，陳韻岱，馬 茜，金琴花，吳雪萍，沙 媛

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心內(nèi)12病房 北京市心肺血管疾病研究所 冠心病精準(zhǔn)治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 首都醫(yī)科大學(xué)冠心病臨床診療與研究中心，北京 100029 2中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心心血管內(nèi)科 國(guó)家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853 3中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心心血管內(nèi)科，北京 100853

血管鈣化是動(dòng)脈粥樣硬化和慢性腎臟疾病患者常見(jiàn)的并發(fā)癥，能夠增加心血管疾病的發(fā)病率和死亡率。有研究將血管鈣化分為3種類(lèi)型：遺傳型、炎癥型和代謝型[1-3]。目前認(rèn)為血管鈣化的機(jī)制主要和遺傳、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)成骨型轉(zhuǎn)化、鈣磷代謝失衡、鈣化促進(jìn)因子和抑制因子間失衡、炎癥、細(xì)胞凋亡、線粒體自噬等相關(guān)[4-7]。最近研究發(fā)現(xiàn)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變?cè)谘茆}化中起著重要作用[8-9]。視神經(jīng)萎縮蛋白1(optical atrophy 1，OPA1)是線粒體塑形蛋白家族中的成員，參與線粒體內(nèi)膜融合，對(duì)線粒體的結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化時(shí)OPA1表達(dá)水平下降，線粒體分裂增加，線粒體氧化應(yīng)激和凋亡增多，而促進(jìn)OPA1表達(dá)能夠增加線粒體融合，減少線粒體分裂，減輕血管鈣化[10]。但OPA1上游調(diào)控通路尚不清楚。雙特異性磷酸酶1(dual-specificity phosphatase 1，DUSP1)是細(xì)胞調(diào)控低氧、氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中具有抗炎癥和抗凋亡作用[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)DUSP1是線粒體調(diào)控的重要蛋白[14-15]。在心肌缺血再灌注損傷中，DUSP1表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡增加，而激活DUSP1可以抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放，下調(diào)線粒體分裂蛋白表達(dá)，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能，抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，減輕再灌注損傷[16]。因此，本研究建立VSMC鈣化體外模型，探討DUSP1是否通過(guò)調(diào)控OPA1蛋白影響VSMC鈣化，并闡明其可能的機(jī)制，為血管鈣化的防治提供新思路。

材料和方法

材料4周齡SD大鼠30只，購(gòu)于中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。β磷酸甘油、氯化鈣、茜素紅S染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，鈣測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京中生北控生物公司，TUNEL試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司，DUSP1抗體、OPA1抗體、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx-2)抗體、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP-2)抗體和β-actin抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。本研究通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審查編號(hào)：S2021-099-01。

VSMC分離與純化及模型構(gòu)建無(wú)菌臺(tái)內(nèi)獲取大鼠胸主動(dòng)脈，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，去除血管外的結(jié)締組織，使用眼科剪剪成小碎塊，采用貼塊法獲取原代VSMC[17]。使用10%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用免疫組織化學(xué)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白染色證實(shí)VSMC純度大于95%。鈣化模型構(gòu)建：在含有胎牛血清的培養(yǎng)基中加入10 mmol/L β磷酸甘油和7.2 mmol/L氯化鈣(鈣化培養(yǎng)基)培養(yǎng)14 d，以制備VSMC鈣化模型[18]。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染大鼠DUSP1基因過(guò)表達(dá)和OPA1基因敲減慢病毒載體購(gòu)自北京賽業(yè)生物科技有限公司，參照公司試劑說(shuō)明書(shū)，將3～6代VSMC接種至6孔板，細(xì)胞密度為2×105個(gè)/孔，通過(guò)載體轉(zhuǎn)染DUSP1。另將OPA1基因敲減慢病毒感染VSMC，使用單克隆細(xì)胞方法篩選OPA1敲減細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

細(xì)胞分組將VSMC分為4組：(1)對(duì)照組：培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d；(2)鈣化組：鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d；(3)鈣化+DUSP1TG組：過(guò)表達(dá)DUSP1蛋白后，鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d；(4)鈣化+DUSP1TG+OPA1-/-組：過(guò)表達(dá)DUSP1和敲減OPA1蛋白后，鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d。每2 d更換1次培養(yǎng)基。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)6次。

Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞，加入100 μl RIPA裂解液裂解細(xì)胞，取上清液，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，然后取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉。加入一抗DUSP1(1∶1000)、OPA1(1∶1000)、Runx-2(1∶1000)、BMP-2(1∶1000)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific proteinase-3，Caspase-3)(1∶1000)、β-actin(1∶1000)4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗室溫孵育60 min。TBST洗滌后ECL發(fā)光顯影。使用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度定量分析。

細(xì)胞鈣化檢測(cè)β磷酸甘油和氯化鈣誘導(dǎo)VSMC鈣化后，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，PBS沖洗細(xì)胞后，加入2%茜素紅S(pH=4.2)，室溫下孵育30 min，去離子水沖洗細(xì)胞3次，觀察各組細(xì)胞染色情況并拍照。隨后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行脫鈣處理，按照說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞鈣含量水平[19]，同時(shí)測(cè)定總蛋白含量，以細(xì)胞鈣含量除以總蛋白含量得出細(xì)胞鈣含量結(jié)果。

細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用TUNEL試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。4%多聚甲醛固定細(xì)胞，每個(gè)樣本加入50 μl TUNEL反應(yīng)液，室溫下孵育60 min，用PBS沖洗后，加入辣根過(guò)氧化物酶孵育30 min，DAB液顯色，顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡數(shù)，細(xì)胞核染成棕褐色為凋亡細(xì)胞。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，多組間差異的兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

VSMC鈣化中DUSP1和OPA1蛋白表達(dá)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，β磷酸甘油和氯化鈣誘導(dǎo)細(xì)胞鈣化第7、14、21天，DUSP1蛋白表達(dá)水平較鈣化前顯著下降(t=4.899，P=0.008；t=8.573，P=0.001；t=7.961，P=0.001)(圖1)。對(duì)照組、鈣化組、鈣化+DUSP1TG組、鈣化+DUSP1TG+OPA1-/-組中OPA1表達(dá)量分別為1.00±0.11、0.51±0.05、1.01±0.12、0.32±0.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.678，P<0.001)。與對(duì)照組比較，鈣化組的DUSP1和OPA1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(t=11.951，P<0.001；t=8.487，P<0.001)；與鈣化組比較，鈣化+DUSP1TG組的DUSP1和OPA1蛋白表達(dá)水平均顯著增加(t=-8.660，P<0.001；t=-8.921，P<0.001)；與鈣化+DUSP1TG組比較，鈣化+DUSP1TG+OPA1-/-組的OPA1蛋白表達(dá)水平顯著降低(t=11.258，P<0.001)(圖2)。

DUSP1：雙特異性磷酸酶1；VSMC：血管平滑肌細(xì)胞；Mr：相對(duì)分子質(zhì)量

OPA1：視神經(jīng)萎縮蛋白1

過(guò)表達(dá)DUSP1蛋白促進(jìn)OPA1表達(dá)抑制VSMC鈣沉積茜素紅S染色結(jié)果顯示，β磷酸甘油和氯化鈣可以誘導(dǎo)VSMC紅色鈣化結(jié)節(jié)生成，過(guò)表達(dá)DUSP1能抑制鈣化結(jié)節(jié)生成，而敲減OPA1表達(dá)后紅色鈣化結(jié)節(jié)再次增多(圖3)。對(duì)照組、鈣化組、鈣化+DUSP1TG組、鈣化+DUSP1TG+OPA1-/-組中鈣含量分別為(51.2±5.2)、(403.5±49.3)、(50.6±5.8)、(416.3±50.5)nmol/(mg·pro)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=99.861，P<0.001)。與鈣化組比較，鈣化+DUSP1TG組細(xì)胞鈣含量顯著降低(P<0.001)；與鈣化+DUSP1TG組比較，鈣化+DUSP1TG+OPA1-/-組細(xì)胞鈣含量顯著升高(P<0.001)。

圖3 茜素紅S染色觀察DUSP1/OPA1對(duì)VSMC鈣化結(jié)節(jié)的影響

過(guò)表達(dá)DUSP1蛋白促進(jìn)OPA1表達(dá)抑制VSMC骨型分化對(duì)照組、鈣化組、鈣化+DUSP1TG組、鈣化+DUSP1TG+OPA1-/-組中Runx-2蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.09、2.76±0.21、0.99±0.11、3.38±0.24，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=148.363，P<0.001)；BMP-2蛋白表達(dá)量分別為1.00±0.10、3.25±0.22、1.19±0.12、3.01±0.26，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=142.704，P<0.001)。與對(duì)照組比較，鈣化組VSMC骨型分化標(biāo)志性蛋白R(shí)unx-2(P<0.001)和BMP-2(P<0.001)的表達(dá)水平顯著增加；與鈣化組比較，鈣化+DUSP1TG組Runx-2(P<0.001)和BMP-2(P<0.001)的表達(dá)水平顯著降低；與鈣化+DUSP1TG組比較，鈣化+DUSP1TG+OPA1-/-組Runx-2(P<0.001)和BMP-2(P<0.001)的表達(dá)水平顯著增加(圖4)。

Runx-2：Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2；BMP-2：骨形態(tài)發(fā)生蛋白2

過(guò)表達(dá)DUSP1蛋白促進(jìn)OPA1表達(dá)抑制VSMC凋亡對(duì)照組、鈣化組、鈣化+DUSP1TG組、鈣化+DUSP1TG+OPA1-/-組中活化的Caspase-3蛋白表達(dá)量分別是1.00±0.11、2.31±0.19、1.35±0.12、2.76±0.25，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=70.537，P<0.001)；細(xì)胞凋亡率分別是(3.2±2.6)%、(25.1±5.3)%、(11.2±3.1)%、(26.3±5.4)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=22.044，P<0.001)。與對(duì)照組比較，鈣化組活化的Caspase-3表達(dá)(P<0.001)和細(xì)胞凋亡率(P<0.001)顯著增加；與鈣化組比較，鈣化+DUSP1TG組活化的Caspase-3表達(dá)(P<0.001)和細(xì)胞凋亡率(P<0.001)顯著降低；與鈣化+DUSP1TG組比較，鈣化+DUSP1TG+OPA1-/-組活化的Caspase-3表達(dá)(P<0.001)和細(xì)胞凋亡率(P<0.001)顯著增加(圖5)。

討 論

隨著人口老齡化的加劇，心腦血管疾病發(fā)病率逐年增加，血管鈣化越來(lái)越常見(jiàn)。對(duì)于血管鈣化的機(jī)制和作用靶點(diǎn)的研究越來(lái)越重要。最近研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化受到鈣化因子調(diào)控，是主動(dòng)的可調(diào)控的過(guò)程，與骨發(fā)生過(guò)程類(lèi)似[20-21]。當(dāng)VSMC受到高血糖、氧化應(yīng)激、炎癥等刺激后，可向成骨型細(xì)胞轉(zhuǎn)化，分泌大量骨相關(guān)蛋白如Runx-2、BMP-2、堿性磷酸酶等，進(jìn)而誘導(dǎo)鈣化[22-23]。VSMC凋亡是血管鈣化的啟動(dòng)步驟，凋亡先于細(xì)胞鈣化，凋亡小體成為礦化和鈣聚集的成核位點(diǎn)[24]，細(xì)胞凋亡還能刺激Runx-2、BMP-2分泌，促進(jìn)VSMC骨型分化，而抑制細(xì)胞凋亡，細(xì)胞骨型分化減輕[25-26]。本研究也證實(shí)血管鈣化與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨型分化、鈣沉積密切相關(guān)，抑制細(xì)胞凋亡、細(xì)胞骨型分化和鈣沉積能明顯減輕血管鈣化。

DUSP1也稱絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶1(mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP-1)，是首個(gè)MKP磷酸酶家族成員，最早研究發(fā)現(xiàn)其通過(guò)調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶系統(tǒng)，在人類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)周期和腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[27]。最新研究發(fā)現(xiàn)其在動(dòng)脈粥樣硬化中具有抗炎、抗氧化和抑制細(xì)胞凋亡等心血管保護(hù)作用。DUSP1通過(guò)抑制動(dòng)脈粥樣硬化c-Jun氨基末端激酶和P38蛋白磷酸化，降低血管細(xì)胞黏附分子-1等炎癥黏附分子的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎和抗凋亡的血管保護(hù)作用[28]。DUSP1通過(guò)抑制P38蛋白磷酸化，下調(diào)Caspase-3蛋白水平，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗凋亡作用[29]。在糖尿病腎病模型中，DUSP1能抑制氧化應(yīng)激損傷，減少凋亡蛋白的表達(dá)，減輕高血糖對(duì)線粒體的破壞，保護(hù)腎功能，而抑制DUSP1則加重細(xì)胞凋亡和高血糖對(duì)腎臟的損害[30]。本研究中，血管鈣化抑制DUSP1表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而刺激Runx-2、BMP-2的表達(dá)和鈣鹽沉積，進(jìn)一步加重血管鈣化。過(guò)表達(dá)DUSP1后，細(xì)胞凋亡被抑制，VSMC骨型分化和鈣沉積減少，血管鈣化減輕。

研究發(fā)現(xiàn)DUSP1能通過(guò)調(diào)控線粒體相關(guān)蛋白，減少線粒體損傷，起到細(xì)胞保護(hù)作用[16，30]。研究證實(shí)血管鈣化時(shí)，線粒體融合蛋白OPA1分泌減少，線粒體分裂增加，線粒體結(jié)構(gòu)和功能受到損害，而促進(jìn)OPA1蛋白表達(dá)，能抑制線粒體分裂，減少細(xì)胞凋亡和細(xì)胞骨型分化，減輕血管鈣化[10]。本研究嘗試明確DUSP1是否通過(guò)調(diào)控OPA1起到影響血管鈣化的作用。結(jié)果顯示，DUSP1蛋白過(guò)表達(dá)可促進(jìn)OPA1蛋白的表達(dá)，敲減OPA1后鈣沉積增多、VSMC骨型分化、細(xì)胞凋亡率增加，由此推斷DUSP1通過(guò)OPA1調(diào)控鈣沉積、VSMC骨型分化、細(xì)胞凋亡進(jìn)而影響血管鈣化。

本研究的局限性在于DUSP1/OPA1之間的作用機(jī)制研究不夠深入，DUSP1是否通過(guò)OPA1調(diào)控線粒體融合和自噬，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能完整，進(jìn)而起到抗血管鈣化作用還有待于進(jìn)一步探索。

綜上，本研究結(jié)果顯示，DUSP1可能通過(guò)促進(jìn)OPA1蛋白表達(dá)起到抑制VSMC鈣化的作用。相信隨著研究的深入，將為血管鈣化的診斷和治療提供新的思路和作用靶點(diǎn)。