何 燕，張紫菱，招彥彤，黎曉靜，魏 梅

（1. 廣東工業(yè)大學(xué) 生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2. 廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244）

2020年《全球癌癥統(tǒng)計報告》表明，原發(fā)性肝癌的發(fā)病率排名第六，死亡率排名第三，嚴重影響了人們的生活質(zhì)量[1-2]。中醫(yī)藥治療腫瘤歷史悠久、療效獨特，是我國肝癌患者綜合治療方案的重要組成部分之一。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)與現(xiàn)代術(shù)療、化療等西醫(yī)療法相結(jié)合，能夠起到減輕癥狀，增效減毒，增強免疫的效果，提高患者的生存率及生活質(zhì)量[3-4]。

百合地黃湯為中藥經(jīng)典名方之一，出自漢代張仲景《金匱要略方論·百合狐惑陰陽毒病證治篇》[5-6]，含“百合七枚(擘)，生地黃汁一升”，始載用于“百合病，不經(jīng)吐、下、發(fā)汗，病形如初者”。百合歸心、肺經(jīng)，具有養(yǎng)陰潤肺，清心安神之功效，地黃歸心經(jīng)、肝經(jīng)、腎經(jīng)，有清熱涼血，生津可治陰虛發(fā)熱等功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，百合地黃湯高劑量組對肝癌H22荷瘤小鼠有抑瘤作用，且抑瘤作用呈劑量依賴關(guān)系[7]。百合地黃湯加黃芪能降低肝癌小鼠PCNA蛋白及Cyclin D1蛋白的表達，可抑制肝腫瘤和Lewis肺細胞增殖，有較好的抗肺腫瘤轉(zhuǎn)移作用[8]。目前對百合地黃湯抗癌作用報道較少，有待深入研究。

現(xiàn)代信息的發(fā)展有助于對中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥領(lǐng)域進行抗腫瘤藥物的數(shù)據(jù)挖掘。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[9-13]是多向藥理學(xué)、計算生物學(xué)、大數(shù)據(jù)分析等學(xué)科融合而成的，體現(xiàn)了中醫(yī)整體觀、辨證論治、方劑配伍的理論，為從生物學(xué)分子網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和功能來認知中藥藥性提供了方法學(xué)契機和有力工具。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建多層網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測百合地黃湯抗肝癌信號通路和作用機制，以期推動其在在腫瘤防治方面的認識。

1 材料與方法

1.1 百合地黃湯化學(xué)成分的收集

利用文獻和TCMSP中藥系統(tǒng)藥理分析平臺[14](https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索百合和地黃中的化學(xué)成分及相關(guān)參數(shù)。主要通過文獻收集地黃中化學(xué)成分，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集百合中化學(xué)成分，借助PubChem數(shù)據(jù)庫[15](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲取其分子結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)統(tǒng)一保存為“sdf”格式，進一步導(dǎo)入SwissADME數(shù)據(jù)庫[16](http://www.swissadme.ch/index.php)中獲得百合、地黃的GI值(血糖生成指數(shù))、Lipinski值(類藥五原則)、OB值(口服生物利用度)。

1.2 疾病靶點和化合物靶點篩選

借助SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫[17](http://www.swisstargetprediction.ch)對收集的成分進行靶點匹配和預(yù)測，得到百合地黃湯化學(xué)成分的作用靶點。在OMIM[18](https://omim.org)、GeneCards數(shù)據(jù)庫[19](https://www.genecards.org)，以“Hepatocellular Carcinoma”為關(guān)鍵詞進行檢索，得到肝癌相關(guān)基因并導(dǎo)出結(jié)果，借助Uniprot數(shù)據(jù)庫[20](https://www.uniprot.org)將靶點蛋白名稱標準化。將百合、地黃化學(xué)成分作用靶點、肝癌相關(guān)靶點導(dǎo)入在線韋恩圖網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)，獲得百合地黃湯作用靶點與肝癌的交集靶點，即百合地黃湯抗肝癌的潛在作用靶點。

1.3 蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了在蛋白水平上進一步了解百合地黃湯與疾病靶點的作用機制，將百合地黃湯抗肝癌的潛在作用靶點輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.stringdb.org)中，物種限定為“homo sapiens”，置信度得分高于0.7，收集獲得的蛋白-蛋白相互作用信息，將其導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件[21]中。構(gòu)建蛋白相互作用圖，利用network analysis計算每個節(jié)點的打分，篩選打分較高的節(jié)點，從而得出PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因。

1.4 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建和活性化合物的篩選

以百合地黃湯化學(xué)成分、作用靶點為數(shù)據(jù)來源，采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-化學(xué)成分-作用靶點”網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點為藥物、化學(xué)成分、作用靶點。將百合地黃湯的潛在抗肝癌靶點與化合物做映射，獲得活性化合物。在Cytoscape 3.7.2軟件中建立“藥物-活性成分-抗肝癌靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，借助network analysis進行拓撲學(xué)分析，獲得每個化學(xué)成分的自由度，從而得出百合地黃湯抗肝癌的核心成分。

1.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

為了進一步了解上述選擇的核心基因的功能及其在信號通路中的作用，將篩選的百合地黃湯抗肝癌的潛在作用靶點導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫[22](https://david.ncifcrf.gov/)，并將物種限制在人類，所有的基因名稱都被更正為它們的官方名稱。在上述數(shù)據(jù)庫搜索和轉(zhuǎn)換操作，設(shè)定閾值P＜0.05，進行GO生物過程富集分析和KEGG信號通路富集分析，選取前15的通路通過在線繪圖網(wǎng)站OMishare Tools(https://www.omicshare.com/tools/)將結(jié)果可視化。

1.6 分子對接驗證

在Pubchem數(shù)據(jù)庫中下載百合地黃湯抗肝癌的核心成分的3D分子結(jié)構(gòu)，在PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中下載PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因的靶點蛋白。通過AutoDock Tool 1.5.6軟件進行分子對接前處理，如去水、確定分子對接坐標等，再利用AutoDock Vina 4.2軟件[23]對PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心基因和百合地黃湯抗肝癌的核心成分進行分子對接。運用PyMol 2.4軟件展示得到的分子對接結(jié)果，立體表現(xiàn)出化合物配體在蛋白靶點中的情況。

2 結(jié)果

2.1 百合地黃湯活性成分篩選

經(jīng)過數(shù)據(jù)庫、文獻查詢，查找出百合地黃湯中共含有化合物131個。為了更全面地篩選活性成分，將收集到的百合地黃湯中所有化合物進行分析考察。表1展示了部分百合地黃湯化合物的GI值、Lipinski值、OB值。

表1 百合地黃湯部分化合物信息Table 1 Information of some compounds of Baihe Dihuang Decoction

2.2 藥物靶點與疾病靶點的交集

經(jīng)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測，得到百合作用靶點711個，地黃作用靶點454個，核查數(shù)據(jù)后刪除重復(fù)項，共得到藥物靶點360個。在OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫中，經(jīng)篩選共得到肝癌相關(guān)靶點488個。將360個藥物靶點與488個疾病靶點導(dǎo)入在線韋恩圖網(wǎng)站，得到58個交集基因(見圖1)。這58個交集基因即為百合地黃湯抗肝癌作用靶點，其中百合、地黃、肝癌都對應(yīng)的靶點有MMP2、KDR、EGFR、ALK、IL2、LGALS3、CDK1、PPARG、ABCB1、STAT3、F2、CA9、ESR1、HRAS、AR、ESR2和MMP9。

圖1 百合地黃湯與肝癌對應(yīng)靶點匹配韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Baihe Dihuang Decoction and corresponding targets of HCC

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

由肝癌相關(guān)基因與藥物靶點基因映射篩選出共同靶點58個，構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)包括58個節(jié)點，821條邊，見圖2。圖中節(jié)點的大小依自由度而設(shè)定，節(jié)點之間的關(guān)系強弱由邊的線條粗細表示，邊的線條越粗則兩蛋白的Combine score(連接分數(shù))值越高。采用Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，結(jié)果表明，間距中心度、自由度及緊密中心度大于均值(間距中心度為0.009，自由度為28.31，緊密中心度為0.68)的關(guān)鍵節(jié)點有15個，占總節(jié)點數(shù)的25%。表2展示了百合地黃湯抗肝癌靶點蛋白質(zhì)相互作用靶點自由度值排名，其中CASP3、VEGFA、STAT3與其他靶點的連接最多，節(jié)點最大，這說明它們與其他靶點蛋白相互作用更強，在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

表2 百合地黃湯抗肝癌靶點蛋白質(zhì)相互作用靶點自由度值排名Table 2 Ranking of the degree of target protein interaction of Baihe Dihuang Decoction against HCC

圖2 百合地黃湯抗肝癌靶點蛋白質(zhì)相互作用圖Fig.2 Anti-HCC target protein interaction diagram of Baihe Dihuang Decoction

2.4 “藥物-化學(xué)成分-作用靶點”和“藥物-活性成分-抗肝癌靶點”網(wǎng)絡(luò)分析

百合地黃湯藥物-化學(xué)成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖見圖3，共有499個節(jié)點和1 319條邊，包括131個化合物節(jié)點，平均自由度是5.286。其中“BH”紅色三角節(jié)點代表百合藥物，“DH”紅色三角節(jié)點代表地黃藥物，“DH+數(shù)字”藍色橢圓節(jié)點代表地黃化學(xué)成分，“BH+數(shù)字”紫色橢圓節(jié)點代表百合化學(xué)成分，綠色橢圓節(jié)點代表作用靶點。由圖3可知，同一活性成分可以作用于不同靶標，同一靶標也可對應(yīng)不同活性成分，體現(xiàn)出百合地黃湯抗肝癌具有多成分、多靶標的特點。進一步分析發(fā)現(xiàn)，百合地黃湯抗肝癌的靶點可以映射到87個化合物，這87個化合物即為百合地黃湯抗肝癌活性化合物?！八幬?活性成分-抗肝癌靶點”網(wǎng)絡(luò)圖見圖4，“BH”紅色橢圓節(jié)點代表百合藥物，“DH”紅色橢圓節(jié)點代表地黃藥物，“BH+數(shù)字”橢圓藍色節(jié)點代表百合活性成分，“DH+數(shù)字”紫色橢圓節(jié)點代表地黃活性成分，綠色橢圓節(jié)點代表抗肝癌靶點。邊線代表藥物-活性成分、活性成分-抗肝癌靶點的相互關(guān)聯(lián)。網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析得到了各個節(jié)點之間的自由度，表3展示了“藥物-活性成分-抗肝癌靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中活性成分與靶點的自由度排名前10的活性成分，經(jīng)統(tǒng)計自由度值較高的活性成分有山奈酚、百合皂苷、百合苷C、26-O-β-Dglucopyranosylnuatigenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-o-[β-D-glucopyranosyl(1→4)]-β-Dglucopyranoside_qt。

表3 百合地黃湯藥物-活性成分-抗肝癌靶點網(wǎng)絡(luò)自由度值排名Table 3 Ranking of degree value of drug-active ingredient-anti-HCC target network of Baihe Dihuang Decoction

圖3 百合地黃湯藥物-化學(xué)成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network diagram of drug-chemical composition-targets of Baihe Dihuang Decoction

圖4 百合地黃湯藥物-活性成分-抗肝癌靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network diagram of drug-active ingredient-anti-HCC targets of Baihe Dihuang Decoction

2.5 GO功能富集分析與KEGG信號通路分析

對百合地黃湯抗肝癌作用所涉及的58個蛋白靶點進行GO功能富集分析和KEGG信號通路富集分析，以P＜0.05為篩選條件，得到富集基因數(shù)量較多的GO功能和信號通路。在KEGG富集分析中共涉及91條富集通路，包括了癌癥蛋白多糖、癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、VEGF信號通路、癌癥的中心代謝、胰細胞、腎癌、Rap1信號通路、H1F信號通路等。GO功能富集分析中確定了388個GO條目。生物過程相關(guān)的條目286個，涉及藥物反應(yīng)、細胞增殖及調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化、基因表達及調(diào)控、細胞遷移調(diào)控、信號傳導(dǎo)等。分子功能方面相關(guān)的條目68個，涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白絡(luò)氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、ATP結(jié)合酶活性、相同蛋白質(zhì)結(jié)合、類固醇激素受體、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。細胞組成相關(guān)的條目34個，涉及細胞器、質(zhì)膜、突觸等方面。圖5列出了GO功能富集分析的前24個條目，圖6列出了信號通路富集分析的前15個條目。

圖5 百合地黃湯百合地黃湯抗肝癌GO功能富集分析Fig.5 GO function enrichment analysis of anti-HCC targets of Baihe Dihuang Decoction

圖6 百合地黃湯抗肝癌靶點的信號通路富集Fig.6 Enrichment diagram of anti-HCC signal pathway of Baihe Dihuang Decoction

2.6 分子對接結(jié)果

根據(jù)上述篩選得到的87個活性成分，選取活性成分中自由度值前4的化合物(山奈酚、百合皂苷、百合苷C、26-O-β-D-glucopyranosylnuatigenin-3-O-α-Lrhamnopyranosyl(1→4)-o- [β-D-glucopyranosyl(1→4)]-β-D-glucopyranoside_qt)與位于前3位的核心基因(STAT3、CASP3、VEGFA)使用AutoDock Vina軟件進行分子對接，獲得活性化合物與靶標相互作用的最小結(jié)合能。分子對接結(jié)果見表4，結(jié)合能都小于-5 kJ·mol-1，可見百合地黃湯與這3個肝癌蛋白靶點具有較好的親和性，圖7展示了活性化合物與對接結(jié)合能最低的靶點的分子對接情況。

圖7 百合地黃湯中活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接圖Fig.7 Molecular docking diagram of active components and key targets in Baihe Dihuang Decoction

表4 分子對接結(jié)果Table 4 Molecular docking results

3 討論

本文進行了百合地黃湯中抗肝癌主要活性成分及潛在作用機制的探討。百合地黃湯中含有131種化合物成分。在前期摸索中，采用文獻報道常用篩選標準(OB≥30%，DL≥0.18)對化學(xué)成分進行篩選[24]，僅得到8個化合物，其中大部分含有較高藥理活性的化合物如百合皂苷、百合苷C、梓醇、毛蕊花糖苷、梓醇、齊墩果酸等被篩除掉了。鑒于該標準的局限性，筆者綜合考量，將百合地黃湯的化合物都進行分析。本文經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選得到了87個活性成分及58個抗肝癌作用靶點，其中山奈酚、百合皂苷、百合苷C、26-O-β-D-glucopyranosylnuatigenin-3-O-α-Lrhamnopyranosyl(1→2)-o-[β-D-glucopyranosyl(1→4)]-β-D-glucopyranoside_qt等活性成分對應(yīng)靶點較多，大多為皂苷類化合物。中藥皂苷類成分可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制侵襲轉(zhuǎn)移、抑制腫瘤血管新生、逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥、調(diào)節(jié)機體免疫、誘導(dǎo)腫瘤細胞自噬死亡等機制發(fā)揮抗腫瘤作用[25-27]?，F(xiàn)代藥理研究表明，山奈酚通過調(diào)控環(huán)氧合酶-2的轉(zhuǎn)錄、抑制P-糖蛋白的功能和表達、抑制白細胞介素-4抗細胞增殖來誘導(dǎo)細胞凋亡、干預(yù)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和增強抑癌基因活性及抑制癌基因表達[28]。

PPI網(wǎng)絡(luò)顯示百合地黃湯潛在作用的關(guān)鍵靶點有STAT3、CASP3、VEGFA。STAT3在細胞惡變過程中起關(guān)鍵性作用，腫瘤的增殖、細胞凋亡抑制、侵襲和轉(zhuǎn)移、新血管生成以及腫瘤干細胞的自我更新和分化會導(dǎo)致其高表達從而減緩細胞惡變[29-31]。CASP3是與免疫細胞凋亡密切相關(guān)的半胱氨酸天蛋白酶，能促進免疫細胞發(fā)揮作用[32]。Folkman[33]提出了腫瘤性血管生成理論，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展依賴于腫瘤血管的生成。VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子的一種，可以通過與VEGFA2(血管內(nèi)皮生長因子受體)結(jié)合，影響血管內(nèi)皮細胞增殖、存活、遷移及血管通透性，進而抑制腫瘤細胞的增殖[34]。

信號通路富集表明百合地黃湯主要是調(diào)控癌癥蛋白聚糖、VEGF信號通路和PI3K-Akt通路而抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡等發(fā)揮抗肝癌作用?，F(xiàn)代藥理研究表明[27]，肝癌發(fā)展進程受多條信號通路傳導(dǎo)調(diào)控，中醫(yī)藥可同時干預(yù)多條信號通路，多靶點的調(diào)控轉(zhuǎn)導(dǎo)因子表達，從而抑制、殺傷腫瘤細胞，改善癥狀和體征，發(fā)揮防治肝癌的作用。腫瘤微環(huán)境中的許多蛋白聚糖(PGs)已被證明是關(guān)鍵的大分子，這些大分子有助于各種類型的癌癥的生物學(xué)發(fā)展，包括增殖、黏附、血管生成和轉(zhuǎn)移，從而影響腫瘤的進展，通過調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡、調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄等功能來治療癌癥[35]。Napoleone Ferrara等[36]研究發(fā)現(xiàn)，VEGF通過與肝癌細胞表面的結(jié)合，激活A(yù)kt激酶的相關(guān)信號通路而促進腫瘤細胞的遷移。Zou Y等[37]研究證明在多種腫瘤干細胞中，PI3K-Akt信號通路的激活發(fā)揮重要作用，抑制PI3K-Akt信號的激活可以抑制腫瘤干細胞的自我更新，并減少腫瘤干細胞的比例。由此預(yù)測，百合地黃湯通過以上通路抑制腫瘤細胞增殖，防治腫瘤細胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，同時調(diào)節(jié)機體免疫功能，提高機體免疫細胞殺傷腫瘤細胞的能力。分子對接結(jié)果顯示，百合地黃湯的4個核心活性成分與肝癌的3個核心靶點(STAT3、CASP3、VEGFA)具有良好親和活性。

綜上所述，本文以百合地黃湯主要活性成分為研究對象，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析了其潛在的抗肝癌靶點及信號通路，并結(jié)合分子對接方法驗證了百合地黃湯主要活性成分能與肝癌靶點發(fā)生相互作用。初步揭示了百合地黃湯抗肝癌作用具有多靶點、多通路的治療特點，為后續(xù)深入驗證百合地黃湯抗肝癌的作用機制提供了方向與參考。