肝豆狀核變性又稱威爾遜氏病，是銅的轉(zhuǎn)運基因ATP7B發(fā)生突變導致銅的轉(zhuǎn)運和排泄出現(xiàn)障礙，進而造成的一種常染色體隱性遺傳性疾病

。肝豆狀核變性的主要臨床表現(xiàn)為肝損傷及神經(jīng)系統(tǒng)損傷，嚴重影響人們的生活質(zhì)量，同時對生命安全也造成一定的威脅

。原纖維蛋白-1(fibrillin-1，F(xiàn)BN1)基因編碼的FBN1蛋白是微原纖維的主要成分，它是一種結(jié)構(gòu)蛋白，與纖維化程度有關(guān)

。而肝纖維化幾乎是所有肝豆狀核變性患者肝臟的主要病理改變，推測FBN1可能與肝豆狀核變性的病理改變有關(guān)

。雖然FBN1基因甲基化在癌癥中的研究較多

，但關(guān)于FBN1基因甲基化及蛋白表達水平與肝豆狀核變性間的關(guān)系仍需進一步探究。因此，本研究通過探討FBN1基因甲基化及蛋白表達水平與肝豆狀核變性患者臨床病理特征及預后的關(guān)系，以期為肝豆狀核變性的臨床診斷及治療提供新靶點和依據(jù)。

1 資料與方法

選取重慶市黔江中心醫(yī)院和四川大學華西醫(yī)院2013年2月至2016年2月收治的79例肝豆狀核變性患者肝病變組織為研究對象(肝豆狀核變性組)，年齡(45.28±13.46)歲(20～76歲)，男47例，女32例。選取其肝臟正常組織作為正常對照組。另收集患者肝豆狀核變性家族史、病程及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、銅藍蛋白(ceruloplasmin，CP)、尿銅(urine copper，u-Cu)水平等基線資料。

納入標準：(1)經(jīng)影像學檢查、臨床特征及組織病理證實確診為肝豆狀核變性患者，符合肝豆狀核變性診斷標準

；(2)病歷資料齊全者；(3)患者均自愿參加并簽署知情同意書；(4)術(shù)前未接受過其他輔助治療。排除標準：(1)合并其他感染性疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤者；(2)有嚴重精神障礙者；(3)妊娠期或哺乳期婦女；(4)伴有其他肝臟疾病者。本研究經(jīng)重慶市黔江中心醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準(批號：Lw2012011)。

優(yōu)先選取連接鄉(xiāng)、鎮(zhèn)、大村莊之間的道路，通往高等級道路、車站、碼頭、礦山的道路，作為行政界線的道路，穿越國境線的道路以及連接水源的道路。一般應使鄉(xiāng)鎮(zhèn)級居民地有道路通往、居民地與主要地物之間均有道路連接。兩居民地之間有數(shù)條道路相連接時，應優(yōu)先選取等級較高、距離較短的道路[2]。

PCR儀(型號：MA-1600)購自中國雅睿生物。CpGenome DNA Modification Kit(貨號：XY-S7821)購自德國Merck Millipore公司；DNA抽提試劑盒(貨號：JL1545)購自德國QIAGEN公司；DAB顯色試劑盒(貨號：DA1010)購自上海吉至生化科技有限公司；FBN1抗體(貨號：ATA29131)購自武漢益普生物科技有限公司；PTG19-T載體(貨號：SWFZ022)購自上海信帆生物科技有限公司；XL-10 Gold感受態(tài)細胞(貨號：CM-6013K)購自上海淳麥生物科技有限公司。

肝豆狀核變性組FBN1蛋白陽性表達率(70.89%)顯著高于正常對照組(13.92%)，差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)(見表3、圖2)。

研究區(qū)15年來年均RUE總體呈下降趨勢，年均下降 0.000 1。RUE最高值出現(xiàn)在 2002年，為0.016 18，最低值出現(xiàn)在2012年。從各縣來看，除若爾蓋縣以外，其他各縣最高值均出現(xiàn)在2002年。由表1可以得到，各縣RUE線性趨勢均為負值，其中石渠縣RUE下降最快，為研究區(qū)平均下降速度的兩倍，壤塘縣與甘孜縣下降速度最慢，其他4個縣下降速度近于研究區(qū)RUE下降的速度。

1.3.3 FBN1蛋白表達水平檢測：采用免疫組織化學法檢測肝組織FBN1蛋白表達水平，常規(guī)操作(一抗為FBN1抗體)后采取半定量法進行評分

。雙盲法進行結(jié)果判定，隨機選10個高倍鏡視野(200倍)觀察，取每個標本兩次觀察評分的平均值。首先按染色強度計分：棕褐色為3分，棕黃色為2分，淺黃色為1分，無色為0分；之后按陽性細胞率計分，陽性細胞百分數(shù)≥76%、51%～75%、26%～50%、6%～25%、≤5%分別判定為4、3、2、1、0分。上述兩種得分相乘，總分<4分為陰性(-)，≥4分為陽性(+)。

肝移植手術(shù)后5年內(nèi)采用電話、入戶和門診等方式進行隨訪，術(shù)后第1～3年平均每3～6個月隨訪1次，之后每半年隨訪1次。其生存期從手術(shù)之日起計算。

1.3.1 樣品采集及保存：采集患者肝移植術(shù)中病變肝組織及其肝臟正常組織，部分置于-80 ℃保存；部分經(jīng)10%甲醛固定后，進行梯度脫水、透明、浸蠟、包埋及切片(厚度4 μm)。肝豆狀核變性患者肝臟病理表現(xiàn)：早期肝細胞呈小、大泡混合性脂變，肝小葉未見明顯炎癥(見圖1)。

1.3.2 FBN1基因甲基化測定：DNA抽提試劑盒提取受試者肝組織基因組DNA，紫外分光光度計檢測DNA純度后-20 ℃保存。采用亞硫酸氫鈉修飾試劑盒對DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，75 ℃ 40 s，40個循環(huán)。PCR反應體系：模板DNA(50 ng/μl)2 μl，2×PCR Mix 25 μl，ddH

O 21 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl。目標片段割膠回收后連接，PTG19-T做載體，采用XL-10 Gold感受態(tài)細胞進行轉(zhuǎn)化、復蘇、涂板，酶切法鑒定陽性菌落，測序后甲基化數(shù)據(jù)用BIQ Analyzer軟件分析和整理。FBN1甲基化與非甲基化引物序列如表1所示，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

與此同時，還不斷加大了全縣77個探礦權(quán)的科學規(guī)范管理，與河南省地質(zhì)調(diào)查院等22個地勘單位建立了合作關(guān)系。全縣不僅又探明鉬金屬233萬t，而且還新探明白鎢59萬t，鉛鋅126萬t，黃金74萬t，為本縣的礦產(chǎn)資源可持續(xù)發(fā)展提供了充分的資源保障。

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以例數(shù)/%表示，組間比較行

檢驗及Fisher精確檢驗；采用Kaplan-Meier法分析肝豆狀核變性患者FBN1基因甲基化及蛋白表達水平與預后的關(guān)系，采用Log-rank進行生存曲線顯著性檢驗，以

=0.05為檢驗水準；采用多因素Cox回歸分析影響肝豆狀核變性患者預后的因素。

<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

隨訪5年，79例肝豆狀核變性患者中死亡18例、生存61例。用Kaplan-Meier法分析FBN1基因甲基化及蛋白表達水平與肝豆狀核變性患者5年生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示FBN1蛋白陽性表達肝豆狀核變性患者5年生存率(69.64%)低于FBN1蛋白陰性表達患者(95.65%)，差異有統(tǒng)計學意義(

=6.269，

<0.05)；FBN1基因甲基化肝豆狀核變性患者5年生存率(95.24%)高于FBN1基因非甲基化患者(70.69%)，差異有統(tǒng)計學意義(

=5.281，

<0.05)(見圖3～4)。

5.并購價值的效應體現(xiàn)。一個是效益效應，據(jù)某些資料顯示，對于雙方融資成立的新公司，首次融資已經(jīng)超33億元，融資后公司的估值可超180億元，這是全球范圍最大的私募融資之一，這有利于新企業(yè)在未來的時間內(nèi)上市。兩家的合并重構(gòu)使得用戶數(shù)量急劇上升，覆蓋的群體范圍以及地域范圍也擴大。新公司覆蓋了超過2800個縣、市、區(qū)，日訂單量突破1000萬單，移動端月度活躍用戶超1.5 億人，年購買用戶近2億人，2015年總交易額超過1700億元人民幣。另一個是戰(zhàn)略效應，對于企業(yè)來說，拿下O2O市場，就有在互聯(lián)網(wǎng)領(lǐng)域的主動權(quán)，未來發(fā)展的潛力不可限量，美團與大眾點評的戰(zhàn)略整合，兩家企業(yè)優(yōu)勢互補，有利于公司的長遠發(fā)展。

根據(jù)肝豆狀核變性患者FBN1基因甲基化及其蛋白表達情況，將其分為FBN1非甲基化組58例，F(xiàn)BN1甲基化組21例；FBN1蛋白陰性組23例，F(xiàn)BN1蛋白陽性組56例。FBN1基因甲基化及蛋白表達與性別、病程及AST、ALT水平無相關(guān)性(

>0.05)；FBN1基因甲基化及蛋白表達與年齡、肝豆狀核變性家族史以及CP、u-Cu水平有相關(guān)性(

<0.05)(見表4)。

肝豆狀核變性組FBN1基因甲基化率(26.58%)顯著低于正常對照組(63.29%)，差異有統(tǒng)計學意義(

<0.05)(見表2)。

將肝豆狀核變性患者是否發(fā)生死亡作為因變量，以患者FBN1基因甲基化、FBN1蛋白陽性表達、年齡、肝豆狀核變性家族史、CP、u-Cu為自變量進行多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)BN1蛋白陽性表達是影響肝豆狀核變性患者死亡的獨立危險因素(

<0.05)，F(xiàn)BN1基因甲基化是影響肝豆狀核變性患者死亡的保護因素(

<0.05)(見表5)。

3 討論

肝豆狀核變性臨床癥狀差異較大，無法通過任何一項或幾項指標確診或排除，極易出現(xiàn)誤診、漏診等

。肝豆狀核變性患者體內(nèi)銅排泄出現(xiàn)障礙，在腦、腎、肝等器官處蓄積同時導致相應病變，進而造成患者病情加重，治療效果較差

。近年來分子生物醫(yī)學快速發(fā)展，然而目前關(guān)于肝豆狀核變性生物標志物的研究較少。因此，尋找切實有效的肝豆狀核變性生物標志物顯得尤為重要。

蘭江大橋高高地矗立著。蔣大偉把車開到路邊，兩人仰頭看著大橋。橋上，車輛在不停地穿梭流動。蔣大偉低聲地：這就是蘭江大橋！鄭馨默默看著大橋，沒有說話。蔣大偉繼續(xù)說道：我沒說錯吧，蘭江大橋很有氣勢，很美。鄭馨還是沒說話，她打開車門，蔣大偉：就這么下車了，不想再說點什么嗎？鄭馨仍然沒說話，蔣大偉急了：等等！臨死之前，還有什么未了之事，或許我能再幫你個忙。鄭馨皺緊眉頭，像竭力想著什么。蔣大偉說：反正是快死的人了，沒什么不好說的。鄭馨想了想，咬牙切齒地：我想等陳曉來，讓他看看我是怎么死的！

目前研究表明，表觀遺傳的重要組成部分為DNA甲基化驅(qū)動轉(zhuǎn)錄調(diào)控，DNA甲基化是一些功能基因沉默或失活的常見機制

。因此，基因甲基化在疾病的發(fā)生發(fā)展中可發(fā)揮重要作用。FBN1基因由66個外顯子組成，其編碼的蛋白是一個350 ku的糖蛋白

。FBN1可參與組成彈性蛋白，而彈性蛋白是一種細胞外基質(zhì)蛋白，在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用

。Wang等

研究表明，纖維蛋白原是肝豆狀核變性中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。本研究結(jié)果顯示，肝豆狀核變性組FBN1蛋白陽性表達率(70.89%)高于正常對照組(13.92%)，而肝豆狀核變性組FBN1基因甲基化率(26.58%)低于正常對照組(63.29%)。提示FBN1基因啟動子的低甲基化及蛋白高表達可能與肝豆狀核變性的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。此外，本研究中FBN1基因甲基化及蛋白表達與年齡、肝豆狀核變性家族史以及CP、u-Cu水平有相關(guān)性。研究表明，u-Cu升高和血清CP降低是診斷肝豆狀核變性的參考依據(jù)，CP、u-Cu水平異常的患者肝功能大多異常

。推測FBN1基因低甲基化使FBN1蛋白表達水平升高，F(xiàn)BN1參與合成彈性蛋白的作用異常增加，使得某些膠原纖維在肝內(nèi)的病理沉積過多，造成肝豆狀核變性患者出現(xiàn)肝纖維化，進而影響肝功能。結(jié)合本研究對臨床病理特征與基因甲基化及蛋白表達水平關(guān)系的分析結(jié)果，進一步推測FBN1基因低甲基化、FBN1蛋白高表達可能多發(fā)生于年齡<45歲、有肝豆狀核變性家族史的肝豆狀核變性患者。本研究結(jié)果中FBN1基因非甲基化及蛋白陽性表達患者5年生存率較低，且FBN1蛋白陽性表達是患者死亡的獨立危險因素，F(xiàn)BN1基因甲基化是患者死亡的保護因素。提示FBN1基因低甲基化及蛋白高表達可能不利于肝豆狀核變性患者預后，推測FBN1的低甲基化及高表達導致肝纖維化及肝功能損傷加重，肝豆狀核變性患者病情加重，死亡率增加。

綜上所述，F(xiàn)BN1基因甲基化及蛋白表達水平與肝豆狀核變性患者的臨床病理特征及預后關(guān)系密切，通過對FBN1基因甲基化的研究，可能對推動臨床今后尋找更多的肝豆狀核變性分子生物學標志物有重要作用。然而FBN1基因甲基化的檢測過程中可能會出現(xiàn)非特異性擴增，進而造成研究結(jié)果出現(xiàn)偏倚，有待今后加大樣本量進一步驗證。

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