黃 杰，張 雄，鄧 煜，陳 非，羅英茂，田茗源

(1.重慶市精神衛(wèi)生中心老年科 400036；2.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 400016；3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科 400010)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是最常見的神經(jīng)退行性變性疾病，是癡呆的最主要的類型，其臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的認(rèn)知功能障礙和記憶力損傷，而病理變化則是以細(xì)胞外β淀粉樣蛋白(Aβ)增多并沉積形成老年斑、細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)和神經(jīng)元丟失為主。其中，Aβ的產(chǎn)生及沉積形成老年斑是AD發(fā)生的關(guān)鍵[1]。在AD患者的腦內(nèi)，Aβ生成的增多通常是由淀粉樣前體蛋白(APP)依次經(jīng)β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶裂解導(dǎo)致。BACE1是Aβ生成的關(guān)鍵酶，主要位于細(xì)胞膜上膽固醇富集區(qū)，如脂筏(lipid raft)。而脂筏是質(zhì)膜上富含膽固醇和神經(jīng)鞘脂的動(dòng)態(tài)微結(jié)構(gòu)區(qū)域，其上分布著大量的膜蛋白受體，參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2]、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等過程[3]，也與神經(jīng)突觸可塑性有著密切的關(guān)系[4]，其標(biāo)志蛋白之一是小凹蛋白-1(caveolin-1)。研究表明，細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平可調(diào)節(jié)APP的加工，增強(qiáng)BACE1活性，促進(jìn)Aβ生成，因此，抑制膽固醇合成和降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平將改變脂筏的構(gòu)成，進(jìn)而減少Aβ的生成[5]。

腦是富含膽固醇的器官，神經(jīng)元中過多的膽固醇不能直接排到血液中，而是靠三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)膽固醇跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體系來促進(jìn)膽固醇的外排，減少其對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生的毒副作用。ABCA1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體系是以ABCA1為核心，以貧脂的載脂蛋白[如載脂蛋白A1(apoA1)、高密度脂蛋白(HDL)]為受體，并主要以肝臟X受體(liver X receptor，LXR)和視黃醇類X受體(retinoic X receptor，RXR)的聯(lián)合調(diào)控介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂偶聯(lián)后向外轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平。一系列報(bào)道都顯示，ABCA1跨膜膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)體系在Aβ的沉積及清除中發(fā)揮了重要作用[6-7]，這為開發(fā)防治AD的藥物提供了新靶點(diǎn)[8]。研究證實(shí)，LXR受體可防止記憶衰退，延緩AD的發(fā)展，但機(jī)制尚不清楚[9-10]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用LXR激動(dòng)劑TO901317處理穩(wěn)定表達(dá)APP的N2a/APP695swe細(xì)胞，檢測(cè)TO901317對(duì)細(xì)胞內(nèi)β淀粉樣蛋白42(Aβ42)的影響，以及脂筏標(biāo)記蛋白caveolin-1、APP和BACE1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況，為AD的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠來源的神經(jīng)瘤母細(xì)胞(N2a細(xì)胞)由廈門大學(xué)許華曦教授提供，分為兩種類型：野生型細(xì)胞(N2a/wt細(xì)胞)、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Swedish家族型突變的人APP695細(xì)胞(N2a/APP695swe細(xì)胞)。

1.1.2主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素和0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；LXR激動(dòng)劑TO901317購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；G418購(gòu)自Biosharp公司上海分公司；Aβ42 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Trizol細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；總蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、苯甲基磺酰氟(PMSF)和RIPA蛋白裂解液均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；除了內(nèi)參β-actin和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司外，其余所有抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millpore公司。

1.2 方法

1.2.1配置培養(yǎng)基

N2a/APP695swe細(xì)胞培養(yǎng)基：稱取G418粉劑40 mg溶于10 mL DMEM中，過濾后加入84 mL DMEM、94 mL Opti-DMEM、10 mL胎牛血清、2 mL青鏈霉素，共配制200 mL培養(yǎng)基；N2a/wt細(xì)胞培養(yǎng)基：94 mL DMEM、94 mL Opti-DMEM、10 mL胎牛血清、2 mL青-鏈霉素，以上液體按比例配制好后放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和TO901317處理

將N2a/APP695swe細(xì)胞和N2a/wt細(xì)胞復(fù)蘇后，貼壁生長(zhǎng)于上述配置的培養(yǎng)基中，置37 ℃ 5% CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將TO901317溶于DMSO∶磷酸鹽緩沖液(PBS)為1∶3的溶液中，形成濃度分別為5、10和20 μmol/L的TO901317混合溶液，然后加入N2a/APP695swe細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，以N2a/wt細(xì)胞作為對(duì)照。

1.2.3ELISA檢測(cè)細(xì)胞Aβ42濃度

各組細(xì)胞(N2a/wt組、N2a/APP695swe組、DMSO對(duì)照組，以及經(jīng)5、10和20 μmol/L TO901317處理N2a/APP695swe細(xì)胞的各TO901317處理組)經(jīng)胰蛋白酶消化離心后收集上清液，加入20 μL Protease Inhibitor Cocktail Set 1，至終濃度為1 mmol/L，以防一系列蛋白酶降解Aβ，分裝保存于-20 ℃。做好試劑和標(biāo)準(zhǔn)品的制備工作后，按照說明書進(jìn)行操作：取出96孔板，加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品后，再加入50 μL Aβ42檢測(cè)抗體，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，橡皮膏條封存，置室溫3 h；洗滌4遍，甩掉板中液體后用吸水紙吸干，加入100 μL兔抗IgG-HRP工作液，封存并置室溫30 min；吸干水分后再加入100 μL穩(wěn)定液，封存，置室溫30 min；再加入100 μL終止液，終止顯色，用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度(A450)值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出Aβ42的濃度。

1.2.4RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞caveolin-1、BACE1與APP mRNA水平

各組細(xì)胞(N2a/wt組、N2a/APP695swe組、DMSO對(duì)照組、20 μmol/L TO901317處理組)經(jīng)胰蛋白酶消化離心棄上清液，用Trizol法提取總RNA。β-actin：正向5′-GCC ATG TAC GTA GCC ATC CA-3′，反向5′-GAA CCG CTC ATT GCC GAT AG-3′；APP mRNA：正向5′-GGT GGC TGA GGA GAT TCA AG- 3′，反向5′-ATG AGA GCG TCG TTT CCG TA- 3′；BACE1 mRNA：正向5′-GGC GGG AGT GGT ATT ATG AA-3′，反向5′-GTG ATG CGG AAG GAC TGA TT-3′；caveolin-1：正向5′-TAT GAC GCG CAC ACC AAG GA-3′，反向5′-GCC CAG ATG TGC AGG AAG GA-3′。反應(yīng)體系：Go Taq Green Master Mix 12.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)2.5 μL，下游引物1 μL，上游引物1 μL，無核酸酶水8 μL，總體積 25 μL。PCR反應(yīng)步驟：預(yù)變性94 ℃ 3 min；變性94 ℃ 30 s；退火58 ℃ 30 s；延伸72 ℃ 45 s。

1.2.5Western blot檢測(cè)細(xì)胞caveolin-1、BACE1與APP水平

各組細(xì)胞(N2a/wt組、N2a/APP695swe組、DMSO對(duì)照組、20 μmol/L TO901317處理組)經(jīng)胰蛋白酶消化離心棄上清液，加入1 mL RIPA蛋白裂解液，充分裂解后于4 ℃，13 000 r/min離心15 min后，用Bradford法測(cè)定每組蛋白樣品濃度并分裝保存。配置8%～10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)膠，上樣50 μg經(jīng)十二烷基硫酸鈉-PAGE(SDS-PAGE)，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，然后置入TBST緩沖液稀釋的抗體caveolin-1、APP、BACE1和內(nèi)參β-actin，4 ℃孵育過夜；充分洗滌后加入1∶5 000的HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫孵育2 h，最后用ECL試劑盒行曝光顯影，經(jīng)Bio-rad Chemical Dox XRS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶的分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 TO901317降低了N2a/APP695swe細(xì)胞內(nèi)Aβ42的生成

ELISA結(jié)果顯示：正常N2a/wt細(xì)胞(N2a/wt組)上清液中分泌的Aβ42為(1.33±0.33)ng/mL，低于N2a/APP695swe細(xì)胞(N2a/APP695swe組)的(3.78±0.31) ng/mL，以及DMSO處理后的N2a/APP695swe細(xì)胞(DMSO對(duì)照組)生成的Aβ42水平(3.67±0.28) ng/mL，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)5 μmol/L TO901317處理后，細(xì)胞上清液中生成的Aβ42水平為(3.55±0.34)ng/mL，與N2a/APP695swe組和DMSO對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；隨著TO901317處理濃度增加至10、20 μmol/L，細(xì)胞內(nèi)Aβ42水平下降至(2.96±0.23)、(2.54±0.16)ng/mL，與N2a/wt組和N2a/APP695swe組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且具有濃度-依賴性，見圖1。

1：N2a/wt組；2：N2a/APP695swe組；3：DMSO對(duì)照組；4：5 μmol/L TO901317處理組；5：10 μmol/L TO901317處理組；6：20 μmol/L TO901317處理組；a：P<0.01，與N2a/wt組比較；b：P<0.01，與N2a/APP695swe組比較。

2.2 TO901317對(duì)N2a/APP695swe細(xì)胞內(nèi)caveolin-1、BACE1和APP mRNA水平的影響

RT-PCR結(jié)果表明：與N2a/wt組細(xì)胞比較，N2a/APP695swe組細(xì)胞內(nèi)caveolin-1 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，BACE1和APP mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。N2a/APP695swe細(xì)胞經(jīng)DMSO處理后(DMSO對(duì)照組)，細(xì)胞內(nèi)caveolin-1、BACE1和APP mRNA表達(dá)水平與N2a/APP695swe組比較無明顯差異(P>0.05)；而經(jīng)20 μmol/L TO901317處理后，N2a/APP695swe細(xì)胞中caveolin-1 mRNA表達(dá)水平較N2a/APP695swe組明顯升高(P<0.01)，BACE1和APP mRNA表達(dá)水平較N2a/APP695swe組明顯下降(P<0.01)，見圖2。

1：N2a/wt組；2：N2a/APP695swe組；3：DMSO對(duì)照組；4：20 μmol/L TO901317處理組；a：P<0.01，與N2a/wt組比較；b：P<0.01，與N2a/APP695swe組比較。

2.3 TO901317對(duì)N2a/APP695swe細(xì)胞內(nèi)caveolin-1、BACE1和APP水平的影響

Western blot結(jié)果表明：與N2a/wt組細(xì)胞比較，N2a/APP695swe組細(xì)胞內(nèi)caveolin-1表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，BACE1和APP表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)。經(jīng)DMSO處理后，N2a/APP695swe細(xì)胞內(nèi)(DMSO對(duì)照組)caveolin-1、BACE1和APP表達(dá)水平與N2a/APP695swe組比較無明顯差異(P>0.05)；而經(jīng)20 μmol/L TO901317處理后，N2a/APP695swe細(xì)胞中caveolin-1表達(dá)水平較N2a/APP695swe組明顯升高(P<0.01)，BACE1和APP表達(dá)水平較N2a/APP695swe組明顯降低(P<0.01)，見圖3。

A：各組細(xì)胞內(nèi)caveolin-1、BACE1和APP表達(dá)情況；B：N2a/APP695swe細(xì)胞內(nèi)caveolin-1、BACE1和APP表達(dá)的相對(duì)A450值統(tǒng)計(jì)柱狀圖；1：N2a/wt組；2：N2a/APP695swe組；3：DMSO對(duì)照組；4：20 μmol/L TO901317處理組；a：P<0.01，與N2a/wt組比較；b：P<0.01，與 N2a/APP695swe組比較。

3 討 論

AD是常見的癡呆類型，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。Aβ在腦組織中生成過度或清除障礙都可能引起Aβ的沉積并形成老年斑，這是誘發(fā)AD的共同通路，也是目前公認(rèn)的AD的關(guān)鍵致病因素。因此，尋找抑制Aβ產(chǎn)生的藥物成為防治AD的重要研究方向。

Aβ由APP剪切而來，其方式有α-分泌酶剪切途徑和BACE1剪切途徑[11]。通常情況下，只有少部分α-分泌酶的小片段位于脂筏內(nèi)，其絕大部分片段則位于含膽固醇極低的非脂筏區(qū)。而BACE1和γ-分泌酶都存在于富含膽固醇的脂筏區(qū)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平升高時(shí)，α-分泌酶發(fā)生了移位，從非脂筏區(qū)移至膜上脂筏區(qū)，這一位置的改變不僅增加了α-分泌酶對(duì)APP的剪切，還促進(jìn)了BACE1的糖基磷酸化，進(jìn)而顯著提高γ-分泌酶的活性，最終促進(jìn)了Aβ的生成[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，體外培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)APP的N2a/APP695swe細(xì)胞，結(jié)果顯示在該細(xì)胞內(nèi)脂筏亞結(jié)構(gòu)域質(zhì)膜微囊標(biāo)志性蛋白caveolin-1表達(dá)較弱，而APP和BACE1表達(dá)水平較高，產(chǎn)生的Aβ42更多。

研究表明，膽固醇水平與生成的Aβ水平呈正相關(guān)；降低體內(nèi)膽固醇水平會(huì)減少Aβ生成[5]。膽固醇的外排主要通過兩個(gè)途徑：B類Ⅰ型清道夫受體(SRBI)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體系、ABCA1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體系。前者經(jīng)證實(shí)在AD神經(jīng)元的膽固醇外流轉(zhuǎn)運(yùn)中未發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]，而后者則通過LXR/RXR的聯(lián)合調(diào)控，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂偶聯(lián)后向外轉(zhuǎn)運(yùn)，與AD的發(fā)生、發(fā)展密切聯(lián)系。RIDDELL等[14]利用LXR激動(dòng)劑TO901317處理轉(zhuǎn)基因鼠Tg2576后，發(fā)現(xiàn)小鼠海馬區(qū)Aβ沉積顯著減少，記憶能力也增強(qiáng)。美國(guó)匹茲堡大學(xué)的FITZ等[15]也使用TO901317處理APP轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果顯示TO901317促進(jìn)了高脂飲食飼喂轉(zhuǎn)基因小鼠大腦組織中Aβ的清除，并改善了小鼠的認(rèn)知功能，但其機(jī)制并未闡明。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，TO901317處理N2a/APP695swe細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的Aβ42生成減少，且呈濃度依賴性；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，TO901317處理后，N2a/APP695swe細(xì)胞內(nèi)的caveolin-1表達(dá)增強(qiáng)，而APP和BACE1表達(dá)則降低。

綜上所述，在AD的發(fā)生、發(fā)展過程中，膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙導(dǎo)致了脂筏的構(gòu)成發(fā)生改變，進(jìn)而引起脂筏上與Aβ生成密切相關(guān)的關(guān)鍵蛋白的增加。而LXR激動(dòng)劑TO901317能通過激活LXR啟動(dòng)膽固醇的外排過程，改善脂筏的構(gòu)成(增強(qiáng)caveolin-1的表達(dá))，從而抑制脂筏上APP和BACE1的募集，進(jìn)而阻礙APP的剪切，最終抑制Aβ的生成。