代金彩，強(qiáng)壯，楊敏，魏杰，聶竹蘭

(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建塔里木盆地生物資源保護(hù)利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；3.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)興新職業(yè)技術(shù)學(xué)院，新疆 鐵門關(guān) 841007)

塔里木裂腹魚(Schizothoraxbiddulphi)俗稱“尖嘴魚”，是塔里木河水系的特有物種，曾廣泛分布于阿克蘇河、葉爾羌河、和田河、渭干河等[1-2]。近年來，由于生態(tài)環(huán)境變化、人為活動(dòng)干擾、生長緩慢、性成熟晚及繁殖力低等因素的影響，塔里木裂腹魚的種群數(shù)量急劇減少[3-4]。有關(guān)塔里木裂腹魚的報(bào)道主要集中在地理分布[5]、形態(tài)特征[6]、繁殖特性[7]、線粒體DNA結(jié)構(gòu)分析[8]、遺傳標(biāo)記開發(fā)[9]及遺傳多樣性[10]等方面。

魚類腎臟的功能不僅具有泌尿作用，還具有造血功能和免疫調(diào)節(jié)的功能。腎是魚體維持體內(nèi)離子平衡，調(diào)節(jié)滲透壓的重要器官，水體的鹽堿度增加可使魚類體內(nèi)與外環(huán)境之間的滲透壓差值逐漸升高，迫使魚類調(diào)節(jié)滲透壓，影響魚類的腎組織等[11-12]。龍宏?duì)幍萚13]研究發(fā)現(xiàn)，鹽度對(duì)星斑川鰈(Platichthysstellatus)幼魚腎細(xì)胞結(jié)構(gòu)有明顯的影響；黨云飛[14]研究發(fā)現(xiàn)，大鱗鲃(Barbuscapito)幼魚的腎臟在不同濃度的鹽堿水環(huán)境中顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化；張瑩瑩[15]建立了金錢魚(Scatophagusargus)腎細(xì)胞系(SK)并從細(xì)胞水平對(duì)金錢魚腎細(xì)胞在滲透壓應(yīng)激作用下的調(diào)節(jié)機(jī)制做了進(jìn)一步分析；腎細(xì)胞可用于研究鹽堿度對(duì)魚類的生存影響，同時(shí)腎組織細(xì)胞被建立并應(yīng)用于各個(gè)方面，如徐進(jìn)[16]建立了斑點(diǎn)叉尾鮰(Lctaluruspuncatatus)腎臟細(xì)胞系(CCK)并應(yīng)用于病毒的分離鑒定；Guo等[17]建立了黑鯉魚(Procyprisrabaudi)腎細(xì)胞系(MPK)并應(yīng)用于病毒的敏感性試驗(yàn)；張曉雨等[18]建立了松江鱸(Trachidermusfasciatus)腎細(xì)胞系并應(yīng)用于病毒和鎘離子敏感性試驗(yàn)，得出松江鱸可作為鯉春病毒血癥病毒和鎘離子檢測(cè)的生物學(xué)指標(biāo)。上述研究為魚類腎組織細(xì)胞的研究提供了積極的技術(shù)借鑒。

本試驗(yàn)進(jìn)行塔里木裂腹魚腎細(xì)胞系的建立并研究NaCl鹽度和NaHCO3堿度對(duì)其增殖的影響。細(xì)胞系的建立將對(duì)其環(huán)境毒理學(xué)、病毒的分離、細(xì)胞遺傳學(xué)的研究提供基礎(chǔ)研究材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)動(dòng)物塔里木裂腹魚取自克孜勒河，飼養(yǎng)在新疆建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)試驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)試劑

DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640、M199培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；磷酸緩沖液(PBS)、青霉素-鏈霉素雙抗、二甲基亞砜(DMSO)購自Solarbio公司；臺(tái)盼藍(lán)和0.25%胰酶購自Biotopped公司；MS-222購自漁夫?qū)毠?；基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng) 取健康塔里木裂腹魚，置于高錳酸鉀(20 mg/L)溶液中浸泡30 min，加入0.1 μL/g的MS-222麻醉劑麻醉后，致死。用75%的酒精對(duì)魚體進(jìn)行消毒，然后置于超凈臺(tái)上的解剖盤中。再取4個(gè)培養(yǎng)皿，其中一個(gè)放75%的酒精，另外3個(gè)分別加入添加500 IU/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5 μg/mL兩性霉素B的PBS。解剖取魚的腎組織放入酒精中30 s，然后依次放入另外3個(gè)培養(yǎng)皿中浸泡，之后將其放入2 mL無菌離心管中，并用無菌眼科剪將其剪成大約1～2 mm3的組織碎塊，向其中加入500 μL的DME/F12培養(yǎng)液，將組織碎塊移到25 mm2培養(yǎng)瓶中正相放入25 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，觀察貼壁情況，4 h后反相放置，反相放置培養(yǎng)2 h后再向其中加入含20%FBS、500 IU/mL青霉素、500 μg/mL鏈霉素、12.5 μg/mL兩性霉素B的1 mL DME/F12培養(yǎng)液正相放入25 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，12 h后加入9 mL的培養(yǎng)液繼續(xù)正相放置培養(yǎng)。每天觀察組織塊遷移情況。

在進(jìn)行原代培養(yǎng)的過程中，更換一次培養(yǎng)液的時(shí)間為2～4 d。當(dāng)組織碎塊周圍遷出細(xì)胞，細(xì)胞濃度達(dá)106個(gè)/mL時(shí)按1∶2的比例進(jìn)行傳代。直到第5代后，青霉素、鏈霉素降低到200 IU/mL和200 μg/mL，F(xiàn)BS的濃度也降低到15%。到第8代后，培養(yǎng)液用含10% FBS和1% P/S的DME/F12培養(yǎng)液。

1.3.2 細(xì)胞生長曲線 將一定濃度的細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，分成8組，每組6孔，接種一定濃度的細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)7 d的常規(guī)培養(yǎng)，用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，每天記一組，分析數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞生長曲線的縱坐標(biāo)為每天計(jì)數(shù)的細(xì)胞平均個(gè)數(shù)，時(shí)間為橫坐標(biāo)。根據(jù)公式計(jì)算出細(xì)胞的群體倍增時(shí)間。

T=t×lg2/lg(Nt/N0)

式中：Nt為時(shí)間t后的細(xì)胞數(shù)，N0接種細(xì)胞數(shù)[19]。

1.3.3 最佳培養(yǎng)基 檢測(cè)DME/F12、M199、L-15、MEM、RPMI-1640 5種不同培養(yǎng)基維持細(xì)胞生長的能力。每種培養(yǎng)基中均補(bǔ)充10% FBS和1% P/S。分別將一定濃度的細(xì)胞接種在不同的培養(yǎng)基中，在25 ℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)96 h，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)即0、24、48、72及96 h利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞的生長曲線。

1.3.4 最適培養(yǎng)溫度 檢測(cè)20、25、30和37 ℃不同溫度對(duì)細(xì)胞生長的影響。所用培養(yǎng)液為含10% FBS和1% P/S的DME/F12培養(yǎng)液。在25 ℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)96 h，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)即0、24、48、72及96 h利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞的生長曲線。

1.3.5 最適血清濃度 在確定最適合的培養(yǎng)液及最適合的溫度條件下，其他條件一致的條件下，設(shè)置不同的FBS濃度為0、5%、10%和20%，在25 ℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)，在5個(gè)時(shí)間點(diǎn)即0、24、48、72及96 h利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞的生長曲線。

1.3.6 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 凍存：配制含20% FBS、70% DME/F12和10%二甲基亞砜(DMSO)的細(xì)胞凍存液預(yù)冷以備用。取生長旺盛的細(xì)胞，細(xì)胞濃度2.0×106個(gè)/mL，凍存。

復(fù)蘇：取凍存細(xì)胞快速解凍，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，逐滴加入5倍體積的預(yù)冷培養(yǎng)液，懸浮細(xì)胞，離心棄上清，加入PBS重懸，再次離心棄上清，重復(fù)3次。加入適當(dāng)培養(yǎng)液，取適量細(xì)胞采用臺(tái)盼藍(lán)染色，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率，置于25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞復(fù)蘇36 h后需首次換液。

1.3.7 細(xì)胞污染鑒定 體外組織細(xì)胞培養(yǎng)很容易受到真菌、細(xì)菌、支原體的污染。真菌的種類繁多，肉眼可見，漂浮于培養(yǎng)液面上。細(xì)菌增殖快，在短時(shí)間內(nèi)即可大量擴(kuò)增，并產(chǎn)生毒素殺死細(xì)胞。支原體無致死毒性，可與細(xì)胞長期共存，對(duì)細(xì)胞有潛在影響，但體積小，不易鑒別。選用觀察法與PCR法檢測(cè)細(xì)胞是否被細(xì)菌、真菌、支原體污染。所用引物見表1。

表1 通用引物序列

1.3.8 細(xì)胞來源鑒定 利用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒(DP304)提取塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞的基因組DNA。通過PCR(polymerase chain reaction)擴(kuò)增提取DNA。根據(jù)塔里木裂腹魚16srRNA設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增引物為16sF和16sR(表2)。配置50 μL反應(yīng)體系，其中含有25 μL 2×TaqPCR MasterMix，引物各2.5 μL，5 μL模板DNA，15 μL的滅菌超純水。PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性，3 min；循環(huán)反應(yīng)35次，循環(huán)條件為94 ℃變性30 s，56.8 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；72 ℃末輪延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取1 μL PCR產(chǎn)物在核酸蛋白檢測(cè)儀上檢測(cè)DNA的濃度；取8 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)。PCR產(chǎn)物測(cè)序，比較獲得序列與GenBank已發(fā)表序列的一致率。

表2 16srRNA基因的PCR擴(kuò)增和序列引物

1.3.9 塔里木裂腹魚細(xì)胞系的應(yīng)用(MTT細(xì)胞增殖試驗(yàn)) NaCl鹽度設(shè)置1‰、2‰、4‰、6‰、8‰、10‰ 6個(gè)梯度。

NaHCO3堿度設(shè)置2、3、4、5、6、7、8、10 g/L 8個(gè)梯度。

細(xì)胞鋪板：將對(duì)數(shù)生長期BIM14用含10%胎牛血清DME/F12培養(yǎng)液調(diào)整密度為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，鋪置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每種材料鋪6孔。每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，按分組分別加入不同濃度鹽堿，各孔20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。之后將每個(gè)含液體孔加入MTT 20 μL后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸出各孔內(nèi)液體，后每孔加入150 μL二甲基亞砜。搖床搖培養(yǎng)板20 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長條件下測(cè)定各孔D值。通過計(jì)算得出細(xì)胞相對(duì)增殖率：

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 塔里木裂腹魚腎細(xì)胞原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)

觀察塔里木裂腹魚腎細(xì)胞每天的生長狀態(tài)。1 d后的細(xì)胞貼壁，4 d后組織塊周圍逐漸有細(xì)胞遷出，9 d后細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶70%，10 d后細(xì)胞出現(xiàn)懸浮現(xiàn)象，在13 d后進(jìn)行傳代(圖1)。

A、B、C、D分別為細(xì)胞原代培養(yǎng)1 d、4 d、9 d、10 d的細(xì)胞生長狀態(tài).

傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中濃度達(dá)到106個(gè)/mL時(shí)，進(jìn)行1∶2傳代，每隔2～4 d傳代1次。細(xì)胞呈懸浮生長，現(xiàn)已成功傳至60代。

2.2 塔里木裂腹魚腎細(xì)胞生長曲線

繪制塔里木裂腹魚腎細(xì)胞系第10代細(xì)胞的生長曲線，細(xì)胞生長呈“S”型，0～1 d為潛伏期、1～2 d為指數(shù)生長期、2～5 d為平臺(tái)期、5 d之后為衰退期(圖2)。第10代腎細(xì)胞系細(xì)胞的群體倍增時(shí)間為16.80 h，細(xì)胞分裂旺盛。

圖2 塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞生長曲線

2.3 塔里木裂腹魚腎細(xì)胞最佳培養(yǎng)基

塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞在DME/F12、M199、L-15、MEM、RPMI-1640不同培養(yǎng)基中維持細(xì)胞生長的能力如圖3所示，在M199、MEM及RPMI-1640培養(yǎng)基中細(xì)胞基本不生長，在L-15培養(yǎng)基中細(xì)胞生長緩慢，在DME/F12培養(yǎng)基中細(xì)胞生長最好，因此選擇DME/F12培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基。

圖3 塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞最佳培養(yǎng)基

2.4 塔里木裂腹魚腎細(xì)胞最適培養(yǎng)溫度

塔里木裂腹魚腎細(xì)胞在37 ℃生長最慢，25 ℃生長最快，20 ℃生長較快，30 ℃生長較慢，在20～30 ℃范圍內(nèi)細(xì)胞皆能進(jìn)行良性生長(圖4)，細(xì)胞生長的最適溫度為25 ℃。

圖4 塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞最適培養(yǎng)溫度

2.5 塔里木裂腹魚腎細(xì)胞最適血清濃度

塔里木裂腹魚腎細(xì)胞在未加血清的培養(yǎng)基中生長明顯低于添加血清的細(xì)胞生長，隨著血清濃度5%、10%、20%依次增大，細(xì)胞生長依次加快，當(dāng)FBS濃度為20%時(shí)，細(xì)胞生長最快(圖5)。

圖5 塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞最適血清濃度

2.6 塔里木裂腹魚腎細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞對(duì)第6代細(xì)胞進(jìn)行液氮冷凍保存40、90及180 d后復(fù)蘇，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色并計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，復(fù)蘇存活率如表3所示，40 d后存活率為(96.01±0.74)%，90 d后存活率為(91.32±0.72)%，180 d后存活率為(91.13±0.72)%，90 d和180 d存活率差異不顯著(P>0.05)(表3)。細(xì)胞具有活性，且復(fù)蘇后增殖速度快(圖6)，可正常傳代(圖7)。

表3 凍存后復(fù)蘇存活率

圖6 MTT法測(cè)定復(fù)蘇細(xì)胞增殖

A和B分別為細(xì)胞復(fù)蘇后1 d和3 d的細(xì)胞生長狀態(tài).

2.7 塔里木裂腹魚腎細(xì)胞污染與檢測(cè)鑒定

塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞中提取細(xì)菌、真菌、支原體，經(jīng)過PCR法鑒定細(xì)菌、真菌、支原體污染。如圖8所示，1、3、5泳道分別為細(xì)菌、真菌、支原體PCR產(chǎn)物陽性對(duì)照；2、4、6泳道分別為腎細(xì)胞中提取細(xì)菌、真菌、支原體PCR產(chǎn)物；樣品均無與陽性對(duì)照組一致的條帶，樣品中無細(xì)菌、真菌、支原體，塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞未被污染。

M泳道為2 000 bp Marker；1、3、5泳道分別為細(xì)菌、真菌、支原體PCR產(chǎn)物陽性對(duì)照；2、4、6泳道分別為腎細(xì)胞中提取細(xì)菌、真菌、支原體PCR產(chǎn)物.

2.8 塔里木裂腹魚腎細(xì)胞來源鑒定

用基因組DNA試劑盒提取塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，目的條帶大小符合16srRNA的大小(圖9)。經(jīng)測(cè)序后的序列片段與數(shù)據(jù)庫中的GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)。塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞同源性與GenBank中發(fā)布的來源于塔里木裂腹魚線粒體基因(JQ844133.1)的序列達(dá)到99.91%，序列在2606位有一個(gè)堿基缺失(圖10)，因此塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞來自于塔里木裂腹魚。

M泳道為2 000 bp Marker；1泳道為塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞PCR產(chǎn)物.

灰色：不一致序列.

2.9 MTT法檢測(cè)各組鹽堿度對(duì)細(xì)胞增殖的影響

2.9.1 NaCl鹽度對(duì)塔里木裂腹魚腎細(xì)胞增殖的影響 相同NaCl濃度下，隨時(shí)間的延長(24、48、72 h)BIM14相對(duì)增殖依次下降，NaCl鹽度對(duì)BIM14的相對(duì)增殖的抑制可隨時(shí)間延長而增強(qiáng)。在同一時(shí)間點(diǎn)上，NaCl鹽度1‰、2‰、4‰、6‰依次使BIM14增殖上升，6‰、8‰、10‰依次使BIM14細(xì)胞增殖下降，6‰時(shí)BIM14增殖最高，BIM14增殖隨NaCl鹽度增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)(表4)。

表4 NaCl鹽度對(duì)BIM14細(xì)胞增殖的影響

2.9.2 NaHCO3堿度對(duì)塔里木裂腹魚腎細(xì)胞增殖的影響 NaHCO3堿度對(duì)BIM14細(xì)胞的相對(duì)增殖在濃度一致情況下，BIM14細(xì)胞的增殖隨時(shí)間的延長(24、48、72 h)依次下降，NaHCO3堿度對(duì)BIM14細(xì)胞的相對(duì)增殖的抑制可隨時(shí)間延長而增強(qiáng)。在同一時(shí)間點(diǎn)上，NaHCO3堿度2、3、4、5、6 g/L依次使BICF1和BIM14細(xì)胞增殖上升，6、7、8、10 g/L依次使BICF1和BIM14細(xì)胞增殖下降，6 g/L使BICF1和BIM14細(xì)胞增殖最高，BICF1和BIM14細(xì)胞增殖隨NaHCO3堿度增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)(表5)。

表5 NaHCO3堿度對(duì)BIM14細(xì)胞增殖的影響(M±SD)

3 討論

本研究以塔里木裂腹魚腎組織為材料，用組織塊移植法成功啟動(dòng)了塔里木裂腹魚腎組織細(xì)胞原代培養(yǎng)，命名為BIM14。BIM14在10% FBS的DME/F12培養(yǎng)液中生長良好。細(xì)胞培養(yǎng)常用的培養(yǎng)液有L-15、MEM、RPMI-1640和M199，但不同的魚類對(duì)環(huán)境要求不盡相同，因此，不同魚類的最適培養(yǎng)基亦不同。金鯧魚(Trachinotusovatus)頭腎細(xì)胞系(TOHK)[23]、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)頭腎細(xì)胞系(LYCK)[24]、云紋石斑魚(Epinephelusmoara)腎細(xì)胞系(EMK)[25]的最佳培養(yǎng)液均為L-15，而圓斑星鰈(Veraspervariegates)腎臟組織細(xì)胞系(SHK)的最佳培養(yǎng)液是MEM[26]，羅非魚(Oreochromisniloticus)腎臟組織細(xì)胞(TiK)最佳培養(yǎng)液是DMEM[27]，本試驗(yàn)中使用DME/F12、L-15、MEM、RPMI-1640和M199培養(yǎng)基，得出DME/F12為最佳培養(yǎng)液。魚類組織細(xì)胞生長溫度范圍和哺乳類組織細(xì)胞比較，范圍比較廣。BIM14在20～25 ℃均能正常生長，與已報(bào)道的魚類細(xì)胞的溫度適應(yīng)范圍是一致的[26]，這與魚類是變溫動(dòng)物有很大的關(guān)系。在0%、5%、10%、20%的FBS中生長時(shí)，未加FBS的細(xì)胞生長速度明顯低于添加FBS的生長，在20%FBS時(shí)生長最快，F(xiàn)BS濃度對(duì)細(xì)胞生長有明顯的影響，與已經(jīng)報(bào)道的研究相似[23]。本研究測(cè)定了第10代BIM14生長曲線，呈“S”型生長曲線，1 d進(jìn)入指數(shù)生長期，羅非魚腎細(xì)胞(TiK)在2～5 d為指數(shù)生長期，5 d之后為平穩(wěn)期，與羅非魚腎細(xì)胞(TiK)[27]相比，BIM14進(jìn)入指數(shù)生長期更快。

塔里木裂腹魚BIM14呈懸浮生長。貼壁培養(yǎng)型的細(xì)胞，細(xì)胞膜表面含有大量黏附因子。這些黏附因子可激活不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)貼壁細(xì)胞的活性和增殖，如整合素(integrins)活化黏著斑激酶(focal adhesion kinase)激活信號(hào)通路抑制細(xì)胞內(nèi)源性的凋亡[28]。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞一般為淋巴細(xì)胞等血液系統(tǒng)來源的細(xì)胞，這種細(xì)胞體積小，缺乏粘附分子的表達(dá)[29-30]。本課題組在對(duì)塔里木裂腹魚BIM14染色體的制備中發(fā)現(xiàn)，用0.075 mol/L的KCl低滲時(shí)間達(dá)90 min。當(dāng)其他條件一致，低滲時(shí)間是45 min時(shí)，染色體不分散，低滲時(shí)間達(dá)90 min時(shí)染色體才分散(圖11)。有研究報(bào)道棕點(diǎn)石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀)×鞍帶石斑魚(Epinepheluslanceolatus♂)F1染色體制備中低滲時(shí)間25 min[31]；鯉魚染色體標(biāo)本的制備中低滲的時(shí)間控制在35 min[32]；黃顙(Pelteobagrusfulvidraco)染色體標(biāo)本的制備中低滲的時(shí)間控制在40 min[33]；灰海馬(Hippocampuserectus)染色體標(biāo)本的制備中低滲的時(shí)間為50 min[34]；已報(bào)道的研究中低滲時(shí)間為25～50 min。因此，推測(cè)塔里木裂腹魚BIM14細(xì)胞膜不易破裂，與BIM14細(xì)胞膜的堅(jiān)韌程度有關(guān)。用物理方法進(jìn)行貼壁型細(xì)胞的懸浮訓(xùn)化時(shí)使細(xì)胞產(chǎn)生失巢凋亡(Anoikis)[35]，無血清與生物反應(yīng)器訓(xùn)化使貼壁細(xì)胞產(chǎn)生失巢凋亡的拮抗。目前，MDCK[36]，BHK-21[37]，ST[38]，PK15[39]，Vero[40]等被訓(xùn)化。塔里木裂腹魚BIM14培養(yǎng)中可能產(chǎn)生類似于失巢凋亡的調(diào)節(jié)。塔里木裂腹魚腎細(xì)胞呈懸浮生長的狀態(tài)，可能與其體積和細(xì)胞膜表面粘附分子的表達(dá)及細(xì)胞膜堅(jiān)韌程度有關(guān)，也可能與類似于失巢凋亡的調(diào)節(jié)有關(guān)，具體原因有待于進(jìn)一步研究。

A:KCl低滲45 min不分散染色體；B:KCl低滲90 min分散染色體.

細(xì)胞來源的鑒定通常采用16srRNA、12srRNA和Cytb等基因片段，其中16srRNA基因?qū)儆谶M(jìn)化緩慢的保守序列，因此本試驗(yàn)選擇16srRNA進(jìn)行鑒定，序列分析結(jié)果與塔里木裂腹魚基因序列一致性為99.91%，證明細(xì)胞系來自于塔里木裂腹魚。

塔里木裂腹魚曾是博斯騰湖主要經(jīng)濟(jì)魚類，自20世紀(jì)70年代，由于開荒造田，農(nóng)田鹽堿水大量的排入湖水，鹽堿度逐年升高[41]。水體中鹽堿度水平對(duì)魚類的存活有顯著的影響，鹽堿度過高或過低都會(huì)使魚類的存活率顯著的降低[42-43]。在尼羅羅非魚鹽堿度的耐受性研究中鹽度為20時(shí)僅少數(shù)個(gè)體能存活到96 h，NaHCO3堿度為12 g/L時(shí)，96 h全部死亡[44]；以縊蟶(Sinonovaculaconstricta)為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行急性低鹽脅迫，并檢測(cè)當(dāng)鹽度由2到0時(shí)，其存活率隨著鹽度的下降而降低[45]；當(dāng)碳酸鹽濃度為0～44.58 mmol/L、pH值為9.0～10.0時(shí)，隨著碳酸鹽濃度的上升，縊蟶的存活率明顯下降[46]。本研究中NaCl鹽度6‰使BIM14增殖率最高；NaHCO3堿度6 g/L使BIM14增殖率最高。本研究結(jié)果顯示，鹽堿度過高或過低都會(huì)使塔里木裂腹魚腎細(xì)胞的存活率降低，可應(yīng)用于塔里木裂腹魚對(duì)鹽堿脅迫適應(yīng)性的研究。