田俊雅，劉克海,2

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

枸骨(Ilexcornuta)為冬青屬常綠灌木，分布廣泛[1]，含有多種生物活性成分，如多糖、三萜、皂苷、黃酮等，具有抑菌、降血脂和消炎等功效[2-4]。其葉常被用作苦丁茶供人們飲用，根、果均可藥用，目前關(guān)于枸骨的研究主要集中于根、葉，而果實(shí)較少，尤其是其多糖組分。多糖通常源于動(dòng)植物和微生物，是重要的大分子活性物質(zhì)，具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤和降血糖等作用，本文對(duì)枸骨果中多糖進(jìn)行提取并評(píng)價(jià)其抗氧化活性。多糖提取常用水提醇沉法，但其存在能耗高、費(fèi)時(shí)、提取率低等缺點(diǎn)[5-6]，而利用超聲波空化作用的超聲輔助提取可提高多糖提取效率[7]。陳鑫等[8]使用超聲波輔助提取金針菇多糖，縮短了提取時(shí)間并提高了提取率。響應(yīng)曲面法(response surface methodology，RSM)廣泛用于提取條件優(yōu)化，可從多種因素中高效確定最佳工藝[9]。多糖的分離純化是研究其性質(zhì)和活性的基礎(chǔ)[10]，目前柱層析是常用的手段，其中陰離子交換法及凝膠色譜法常用于多糖的分級(jí)純化[11]，具有可回收、易操作和分離度好等優(yōu)點(diǎn)。本研究以枸骨果為原料，通過響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取粗多糖工藝，經(jīng)柱層析分級(jí)純化，得到均一酸性多糖，進(jìn)而考察其理化性質(zhì)與抗氧化活性，以期為枸骨果開發(fā)提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸骨果(購(gòu)買自安徽省亳州市)，洗凈，烘干至恒質(zhì)量，錘碎備用；文中所用化學(xué)試劑均為分析純；DEAE-52 纖維素陰離子交換柱(DEAE-52)、Sephadex G-100(G-100，上海蘭拓生物科技有限公司)。

1.2 儀器

氮吹儀，杭州瑞誠(chéng)儀器有限公司；冷凍干燥機(jī),Thermo Savant公司；恒溫水浴鍋,上海儀電精密儀器有限公司；TG20G型離心機(jī),上海顏麒生物科技有限公司；紫外分光光度計(jì)，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司；RE3000-D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，深圳市三莉科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枸骨果多糖提取、純化工藝流程

1.3.2 粗多糖提取 恒溫干燥箱60 ℃烘干枸骨果至恒質(zhì)量，稱取適量，加入10倍體積的蒸餾水，超聲恒溫(60 ℃，1 h)浸提，濾液減壓濃縮。濃縮液與無水乙醇按1∶3的比例混合，混合液在4 ℃條件下靜置12 h后8 000 r/min離心10 min得到多糖沉淀，沉淀使用冷凍干燥機(jī)凍干48 h得枸骨果粗多糖。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[12-13]利用超聲輔助方法考察超聲時(shí)間、超聲溫度和液料比對(duì)枸骨果多糖得率的影響。按(1)式計(jì)算枸骨果多糖得率：

W(%)=(m/M)×100%

(1)

式中:W，多糖得率，%；m，多糖質(zhì)量，mg；M，枸骨果質(zhì)量，mg。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)為依據(jù)，選擇三因素三水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，測(cè)定各試驗(yàn)條件對(duì)多糖得率的影響，利用Design-Experter軟件進(jìn)行回歸分析，確定枸骨果多糖最佳提取工藝條件。

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，研究三因素三水平對(duì)多糖得率的影響，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析的因素與水平

1.3.5 粗多糖分離、純化 取適量粗多糖溶于蒸餾水，加入適量20%三氯乙酸溶液，使其終濃度為3%，攪拌均勻，混合液在4 ℃靜置12 h后離心(5 000 r/min，10 min)，上清液濃縮、凍干。采用DEAE-52柱分離粗多糖，配制1 mg/mL的多糖溶液上樣，用氯化鈉溶液(0,0.1,0.3,0.5 mol/L)依次洗脫，苯酚-硫酸法測(cè)吸光度，繪制曲線，收集多糖組分。使用G-100對(duì)多糖組分進(jìn)一步純化，同理，收集洗脫液，濃縮、透析、凍干，即為枸骨果均一多糖(LCFP-3)。

1.3.6 含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定LCFP-3中總糖含量[14]，BCA(bicinchoninic acid)法測(cè)其蛋白含量[15]。

1.3.7 分子量測(cè)定 精確稱取5 mg LCFP-3用0.1 mol/L的硝酸鈉配制成5 mg/mL的溶液，上清液過0.45 μm濾膜，GPC法測(cè)其相對(duì)分子量。色譜條件：WATERS 2414示差折光檢測(cè)器，WATERS凝膠色譜柱*3，聚乙二醇(PEG)作為標(biāo)準(zhǔn)品，流動(dòng)相為0.1 mol/L的硝酸鈉水溶液，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為100 μL，柱子方向?yàn)檎?，柱子及檢測(cè)器溫度為40℃。

1.3.8 單糖組成測(cè)定 取2 mg LCFP-3溶于3 mL三氟乙酸溶液(2 mol/L)，110 ℃反應(yīng)4 h后氮?dú)獯蹈?，加? mL甲醇，氮?dú)獯蹈?，重?fù)4～5次，加水1～2 mL溶解并洗凈瓶子，25 mL容量瓶定容，樣品保存在4 ℃冰箱等待上樣。

上機(jī)條件：Dionex公司生產(chǎn)的ICS-2500離子色譜儀，分析柱的型號(hào)為CarboPacPA20，脈沖安培檢測(cè)器，480 mmol/L NaOH為流動(dòng)相(0.45 mL/min，30 ℃)，25 μL待測(cè)樣品。海藻糖(fucose)、鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)、葡萄糖胺(glucosamine)、半乳糖(galactose)、葡萄糖(glucose)、木糖(xylose)、甘露糖(mannose)、果糖(fructose)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖醛酸(GluA)作為標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.9 DPPH自由基清除率的測(cè)定 參考張曼等[16]所述試驗(yàn)方法，配制0.04 mg/mL的DPPH-乙醇溶液和不同濃度LCFP-3溶液(0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL)。向不同濃度的LCFP-3溶液(70 μL)中加入180 μL DPPH-乙醇溶液，避光反應(yīng)15 min，517 nm測(cè)吸光值作為試驗(yàn)組，DPPH溶液為空白組，按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率：

M(%)=(1-A1/A0)×100%

(2)

式中：M，為自由基清除率，%；A1，樣品組吸光度，Abs；A0，空白組吸光度，Abs。

以不同質(zhì)量濃度的LCFP-3對(duì)DPPH自由基清除率作圖，并進(jìn)行線性擬合，計(jì)算IC50值(自由基清除率為50%時(shí)，LCFP-3的質(zhì)量濃度)，以IC50值作為評(píng)價(jià)待測(cè)液抗氧化能力指標(biāo)。

1.3.10 總還原能力的測(cè)定 參考龔文靜等[17]所述試驗(yàn)方法測(cè)定總還原力。取1 mL不同濃度的LCFP-3溶液(3、6、10、15、20、25 mg/mL)與試管，每個(gè)濃度做3個(gè)平行，依次加入2.5 mL的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)和2.5 mL 1%六氰合鐵鉀溶液，在50℃的水浴鍋保溫20 min后快速冷卻，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心10 min，取5.0 mL上清液，依次加入5.0 mL蒸餾水和1.0 mL 0.1%FeCl3溶液，靜置10 min，以蒸餾水為空白對(duì)照，在700 nm處測(cè)吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖2-A可知，在30～60 ℃范圍內(nèi)，多糖得率隨超聲溫度的升高而增加，這源于溫度升高加速多糖溶出，隨后多糖得率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能由于超聲和高溫共同作用，致使多糖降解[18]。圖2-B中在20～50 min范圍內(nèi)，多糖得率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高，超過50 min，多糖得率增幅減緩，考慮減少經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，將超聲時(shí)間定為50 min。如圖2-C所示，加大液料比可增加溶液與樣品接觸面積，利于多糖溶出，但超過25 mL/g時(shí)，多糖在水中含量達(dá)到飽和，故多糖得率增加緩慢[19]。

圖1 多糖提取、純化工藝流程

圖2 單因素對(duì)多糖得率得影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化枸骨果多糖提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行17組試驗(yàn)，結(jié)果如表2。每個(gè)試驗(yàn)3組平行，取3次多糖得率的平均值代入表2，對(duì)超聲時(shí)間(A)、超聲溫度(B)、液料比(C)進(jìn)行多元回歸擬合，得到方程：

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Y=0.086A+0.081B+0.080C+0.011AB-6.941E-003AC-6.185E-003BC-0.17A2-0.17B2-0.16C2+1.54

2.2.3 響應(yīng)面模型分析 各因素交互作用的三維響應(yīng)面圖及等高線如圖3所示。從表3的P值和圖3可知，A和B間的交互作用為顯著水平(P<0.05)。多糖提取率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果一致。通過C和A、C和B在圖3中響應(yīng)面的坡度和等高線的形狀以及表3中P值均大于0.05、，說明AC、BC之間的交互作用不顯著。

表3 回歸模型方差分析

圖3 各因素交互影響的響應(yīng)面和等高線圖

根據(jù)回歸模型分析，得到最優(yōu)工藝條件為超聲時(shí)間52.59 min、超聲溫度62.48 ℃、液料比26.19∶1(mL∶g)，多糖得率2.47%。為了實(shí)際操作便利，將超聲提取時(shí)間、超聲提取溫度、液料比分別設(shè)定為53 min、63 ℃、26∶1(mL∶g)，測(cè)得得率為2.36%，與模型得出的結(jié)果相近，表明該最佳提取工藝可行。如表4所示，與傳統(tǒng)水提法比，超聲法可提高多糖得率，減少提取時(shí)間。

表4 超聲法與水提法比較

2.3 枸骨果多糖的分離、純化

如圖4所示，在氯化鈉0.3 mol/L濃度下的多糖組分其吸光度明顯高于其它組分，說明多糖主要集中在該洗脫液中，因此，收集該洗脫液并對(duì)其進(jìn)行濃縮透析后，使用G-100進(jìn)一步純化，得到單一對(duì)稱峰，收集后濃縮，透析，凍干即得枸骨果純化多糖LCFP-3(圖5)。

圖4 粗多糖經(jīng)DEAE-52分離

圖5 多糖經(jīng)G-100純化

2.4 總糖含量及分子量

LCFP-3采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量為90.31%，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量為0.246%，表明多糖純化效果較好，進(jìn)一步通過GPC測(cè)定其分子量，如圖6所示，GPC洗脫峰為單一對(duì)稱的曲線，無雜峰，其重均分子量(Mw)為41 199 U，數(shù)均分子量(Mn)為21 704 U，分散系數(shù)為1.898，說明其均一性相對(duì)較好。

圖6 多糖的相對(duì)分子量

2.5 單糖組成

如圖7所示，經(jīng)高效陰離子色譜分析可知，枸骨果多糖主要含有半乳糖(31.92%)、阿拉伯糖(25.87%)、半乳糖醛酸(23.35%)并含有少量鼠李糖(6.43%)、葡萄糖(6.26%)、甘露糖(3.69%)和木糖(2.48%)。此外，位于7-GalA左側(cè)的高峰為溶劑峰即水峰。

采用HPAEC分析得到LCFP-3的單糖組成。Rha，鼠李糖；Ara，阿拉伯糖；Xyl，木糖；Man，甘露糖；Glu，葡萄糖；Gal，半乳糖；GalA，半乳糖醛酸。

2.6 DPPH自由基清除率

由圖8可知，在3.125～50 mg/mL濃度范圍內(nèi)，LCFP-3對(duì)DPPH自由基清除率逐漸增大。當(dāng)濃度達(dá)到50 mg/mL時(shí)，LCFP-3對(duì)DPPH的清除率約為79.0%。在3.125～19 mg/mL濃度范圍內(nèi)，LCFP-3對(duì)DPPH自由基的清除率的線性回歸方程為：y=4.18x-12.404，R2=0.995 1(圖9所示)。由線性回歸方程計(jì)算得出枸骨果多糖清除DPPH自由基的IC50值為(14.929±0.131)mg/mL，表明LCFP-3具有較好的清除DPPH自由基能力。

圖8 多糖清除自由基反應(yīng)曲線

圖9 多糖濃度對(duì)DPPH清除率的線性擬合

2.7 總還原力測(cè)定

抗氧化劑具有強(qiáng)的還原力，可以使體內(nèi)三價(jià)鐵還原成二價(jià)鐵，從而增強(qiáng)血紅蛋白的運(yùn)氧能力，也可以與自由基反應(yīng)，減輕自由基對(duì)人體的損害。如圖10所示，吸光度隨LCFP-3濃度的增加而逐漸升高，在3～25 mg/mL范圍內(nèi)具有線性關(guān)系，線性擬合方程為y=0.023 1x+0.042 63，R2=0.998 8，表明其可作為抗氧化劑提供電子，具有較強(qiáng)還原性。如圖11可知，還原力與DPPH自由基清除率作為L(zhǎng)CFP-3抗氧化活性的兩個(gè)指標(biāo)，二者相關(guān)系數(shù)為R2=0.992 8，表明相關(guān)性良好。

圖10 多糖的總還原能力

圖11 還原力與DPPH自由基清除率的相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

本文通過超聲輔助、單因素試驗(yàn)以及正交試驗(yàn)法對(duì)枸骨果多糖提取方法進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳提取工藝為超聲時(shí)間53 min、超聲溫度63 ℃、液料比26∶1(mL∶g)。通過柱層析法首次從枸骨果中分離純化得到均一多糖LCFP-3，其總糖含量為90.31%，其單糖主要為半乳糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸，并含有少量鼠李糖、葡萄糖、甘露糖和木糖。單糖組成是多糖重要的理化性質(zhì)，對(duì)多糖生物活性有直接影響，如糖醛酸殘基可改變多糖綴合物的理化性質(zhì)和溶解度，進(jìn)而影響其活性，有文獻(xiàn)報(bào)道富含糖醛酸的多糖具有更高的抗氧化活性[20]。LCFP-3糖醛酸含量較高，具有發(fā)展為抗氧化劑的潛能。多糖作為天然的抗氧化劑，其含有多個(gè)羥基可作為良好的電子或氫原子供體中和自由基、活性氧(ROS)或氮形態(tài)(RNS)[21]?？寡趸瘎┑淖饔脵C(jī)理主要包括消除活性自由基、消除非活性氧化因子和結(jié)合金屬離子等[22]，其中DPPH自由基清除能力和總還原力的測(cè)定是研究多糖體外抗氧化常用的試驗(yàn)方法[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)LCFP-3在濃度3～25 mg/mL范圍內(nèi)與還原力存在量效關(guān)系，并與DPPH自由基清除率具有良好相關(guān)性，表明其具有良好抗氧化活性。氧化應(yīng)激(OS)產(chǎn)生的自由基、ROS和RNS與許多疾病密切相關(guān)，尤其是慢性退行性疾病(CDD)，如癌癥、糖尿病、心血管疾病和肥胖癥等[25-26]，因此，評(píng)價(jià)LCFP-3抗氧化活性可為研究其輔助抗腫瘤、降血糖及降血脂等功能奠定基礎(chǔ)，從而進(jìn)一步開發(fā)為功能性基料。