馬平，王嘉晨，高翔，羊陽，朱亞平，馬國榮，杜送田 安建科

(蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司菌苗三室，甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730046)

約95%的侵襲性流感嗜血桿菌疾病由 b 型引起，b型流感嗜血桿菌[1](Haemophilusinfluenzaetypeb，Hib)侵襲性疾病主要表現(xiàn)為腦膜炎(約占50%～65%)，也可表現(xiàn)為肺炎、敗血癥、蜂窩組織炎、會厭炎、關(guān)節(jié)炎、骨髓炎和心包炎等[1-7]。為了提高b型流感嗜血桿菌分離與鑒定，需選擇適宜其生長的培養(yǎng)基。該細菌的氧化還原酶系統(tǒng)不完善，人工培養(yǎng)時需要添加兩種輔助因子(X因子和V因子)[8-12]?！癤”因子存在于血紅蛋白中，是血紅素及其衍生物，是細菌合成過氧化物酶、細胞色素氧化酶等呼吸酶的輔基，可耐115 ℃高溫；“V”因子是輔酶Ⅰ(β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate，NAD)或Ⅱ，在細菌呼吸中起遞氫體作用，耐熱性較差[13-15]。新鮮動物血液中含有X因子和V因子[16]，故臨床上通常使用馬血、兔血及羊血制備的巧克力培養(yǎng)基來分離培養(yǎng)b型流感嗜血桿菌及其他致病菌，但發(fā)現(xiàn)羊血相比兔血、馬血制備的巧克力培養(yǎng)基培養(yǎng)b型流感嗜血桿菌的檢出率較差[17-18]?？紤]易獲得性與經(jīng)濟性，商品化的無菌脫纖維羊血最易買到。羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌檢出率較差可能受培養(yǎng)基制備工藝和條件的影響，為了深入研究羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌檢出率較差的原因，以及期望找到優(yōu)化的羊血巧克力制備方法，使Hib可以在羊血巧克力培養(yǎng)基上生長良好，擴展羊血在Hib分離鑒定所需培養(yǎng)基中的應(yīng)用，試驗研究了b型流感嗜血桿菌在不同方法制備的羊血巧克力培養(yǎng)基上的生長情況。通過培養(yǎng)基中羊血含量的濃度、培養(yǎng)基加熱溫度以及添加輔酶的濃度證明了羊血含有豐富的NAD，只是制備巧克力培養(yǎng)基過程中羊血含有的NADase酶會完全破壞NAD，只有后期補加NAD或者先消除NADase的破壞作用，b型流感嗜血桿菌在羊血巧克力培養(yǎng)基上則生長良好。

1 材料與方法

1.1 試驗菌種

b型流感嗜血桿菌CMCC58547購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 主要試劑及儀器

脫纖維綿羊全血購自蘭州民海生物工程有限公司；酵母浸粉FM888購自安琪酵母股份有限公司；葡萄糖購自濰坊盛泰藥業(yè)有限公司；瓊脂粉、十二水合磷酸氫二鈉和二水合磷酸二氫鈉均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；NAD購自PanReac AppliChem公司；中國細菌濁度標準國家標準品購自中國食品藥品檢定研究院；SHHW21.600電熱恒溫三用水浴箱購自北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；BCM-1000A生物潔凈工作臺購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；MF3菌落計數(shù)儀購自杭州迅數(shù)科技有限公司；移液器購自德國Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 羊血巧克力培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)基配方如下：酵母浸粉 1%、十二水合磷酸氫二鈉 2.865%、二水合磷酸二氫鈉 0.312%、瓊脂粉 1.5%、葡萄糖 1%、六水合氯化鎂 0.203%、5%～10%脫纖維羊血(體積比)，0.1～0.4 μg/mL NAD(僅95 ℃制備方法使用)。

1.3.1.1 85 ℃制備方法 稱取瓊脂粉、十二水合磷酸氫二鈉和二水合磷酸二氫鈉加注射用水溶解后，121 ℃、15 min 高壓滅菌，冷卻至60 ℃左右加入除菌的酵母浸粉-葡萄糖-氯化鎂溶液和終濃度為5%、7.5%和10%脫纖維羊血，然后置于85 ℃水浴中搖動15 min，使其變成巧克力色，冷卻到50 ℃ 左右后傾注平板。

1.3.1.2 95 ℃制備方法 稱取瓊脂粉、十二水合磷酸氫二鈉和二水合磷酸二氫鈉加注射用水溶解后，121 ℃、15 min 高壓滅菌，冷卻至60 ℃左右加入除菌的酵母浸粉-葡萄糖-氯化鎂溶液和終濃度為5%、7.5%和10%脫纖維羊血，然后置于 95 ℃ 水浴中搖動15 min，使其變成巧克力色，冷卻到50 ℃ 左右后傾注平板。

1.3.1.3 85 ℃含NAD制備方法 稱取瓊脂粉、十二水合磷酸氫二鈉和二水合磷酸二氫鈉加注射用水溶解后，121 ℃、15 min 高壓滅菌，冷卻至60 ℃左右加入除菌的酵母浸粉-葡萄糖-氯化鎂溶液和終濃度為5%、7.5%和10%脫纖維羊血，然后置于 85 ℃ 水浴中搖動15 min，使其變成巧克力色，冷卻到50 ℃ 左右再加入終濃度為0.1、0.2、0.4 μg/mL除菌的NAD溶液，混勻后傾注平板。

1.3.1.4 兔血平皿的制備 稱取瓊脂粉、十二水合磷酸氫二鈉和二水合磷酸二氫鈉加注射用水溶解后，121 ℃、15 min 高壓滅菌，冷卻至60 ℃左右加入除菌的酵母浸粉-葡萄糖-氯化鎂溶液和脫纖維兔血，然后置于85 ℃水浴中搖動15 min，使其變成巧克力色，冷卻到50 ℃ 左右后傾注平板。

1.3.2 b型流感嗜血桿菌菌懸液的制備 刮取生長良好的b型流感嗜血桿菌菌落，懸浮于生理鹽水中，配制細菌濃度約為23 億/mL的菌懸液。

1.3.3 b型流感嗜血桿菌的生長情況考察 將上述菌懸液稀釋106倍后取0.1 mL均勻涂布于巧克力瓊脂平板上，不同制備方法制備的巧克力瓊脂培養(yǎng)基均平行接種 6 塊平板，置于35～37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，使用MF3菌落計數(shù)儀統(tǒng)計得菌落平均直徑(mm)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，所得數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，當P<0.05時，兩組數(shù)據(jù)間差異有統(tǒng)計學(xué)意義；當P>0.05時，兩組數(shù)據(jù)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 水浴溫度為85 ℃制備的羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌生長情況

水浴溫度為85 ℃制備的不同含量羊血巧克力培養(yǎng)基與兔血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌生長情況見表1。培養(yǎng)24 h后，可見b型流感嗜血桿菌在兔血巧克力平板上生長良好，菌落平均直徑為1.52 mm，見圖1。b型流感嗜血桿菌在水浴溫度為85 ℃制備的不同含量羊血巧克力培養(yǎng)基上均不生長。

圖1 b型流感嗜血桿菌在5%兔血巧克力培養(yǎng)基生長情況

表1 水浴溫度為85 ℃制備的巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌生長情況比較

2.2 水浴溫度為95 ℃制備的羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌生長情況

水浴溫度為95 ℃制備的不同含量羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌生長情況見表2。水浴溫度95 ℃制備的羊血巧克力培養(yǎng)基，含5%羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌的菌落直徑為(1.08±0.09)mm，菌落平均生長數(shù)為93±6(圖2-A)，含7.5%羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌的菌落直徑為(1.32±0.10)mm，菌落平均生長數(shù)為152±7(圖2-B)，含10%羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌的菌落直徑為(1.46±0.12)mm，菌落平均生長數(shù)為176±9(圖2-C)；水浴溫度95 ℃制備的不同含量羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌的菌落直徑和生長率隨著羊血含量增加而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002 353，P<0.05)，10%羊血巧克力培養(yǎng)基上的菌落直徑和生長率與兔血巧克力培養(yǎng)基相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.489 63，P>0.05)。

A：5%；B：7.5%；C：10%

表2 水浴溫度為95 ℃制備的羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌生長情況

2.3 水浴溫度為85 ℃后續(xù)補加不同濃度輔酶I(NAD)的羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌生長情況

水浴溫度為85 ℃后續(xù)補加不同濃度輔酶I(NAD)的羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌生長情況見表3。在水浴溫度為85℃后續(xù)補加終質(zhì)量濃度0.1 μg/mL輔酶I(NAD)的不同含量羊血巧克力平板上，b型流感嗜血桿菌幾乎不生長。水浴溫度為85 ℃后續(xù)補加終質(zhì)量濃度0.2 μg/mL與0.4 μg/mL輔酶Ⅰ(NAD)的羊血巧克力平板上，b型流感嗜血桿菌菌落直徑和生長率均良好，與兔血巧克力培養(yǎng)基差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.612 8，P>0.05)，NAD終質(zhì)量濃度0.2 μg/mL和0.4 μg/mL之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1，P>0.05)，不同含量羊血之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.273 102，P>0.05)。

表3 水浴溫度為85 ℃后續(xù)補加不同濃度輔酶I(NAD)的羊血巧克力培養(yǎng)基上b型流感嗜血桿菌生長結(jié)果

A：0.2 μg/mL NAD；B：0.4 μg/mL NAD

3 討論與結(jié)論

動物血液的紅細胞中存在大量“V”因子，紅細胞完整時，血液中的“V”因子并不能被b型嗜血桿菌利用，因此b型流感嗜血桿菌在鮮血平皿上不生長。當將b型流感嗜血桿菌及金黃色葡萄球菌一起接種至鮮血平皿時，因金黃色葡萄球菌可引起溶血，使鮮血平皿中的紅細胞被破壞，釋放出“V”因子，故金黃色葡萄球菌菌落附近的b型流感嗜血桿菌菌落較大，遠離金黃色葡萄球菌的b型流感嗜血桿菌菌落較小或無菌落。該現(xiàn)象被稱為“衛(wèi)星現(xiàn)象”，常被用來檢定流感嗜血桿菌。當血液被加熱到85 ℃左右時，紅細胞也可被破壞，V因子充分釋放并發(fā)揮作用[18]，此時血顏色變?yōu)榍煽肆ι蔋ib在巧克力培養(yǎng)基上生長較佳。

使用馬血、兔血或羊血制備的巧克力培養(yǎng)基，Hib在羊血巧克力培養(yǎng)基上生長的比兔血或馬血巧克力培養(yǎng)基上更差[19-20]。本試驗就b型流感嗜血桿菌在不同動物血培養(yǎng)基的生長情況進行研究后發(fā)現(xiàn)，b型流感嗜血桿菌在85 ℃加熱制備的兔血巧克力平板上生長良好，菌落平均直徑為1.52 mm；而在85 ℃加熱制備的羊血巧克力培養(yǎng)基上不生長。這是由于羊血中含有快速水解V因子的NADase酶導(dǎo)致羊血巧克力培養(yǎng)基由于缺乏NAD來支持Hib細菌的生長，而兔血中不含有這種酶類不受影響。

NADase酶廣泛存在于許多微生物、動物的各種組織和毒液中，能催化水解NAD為等摩爾的尼克酰胺和腺嘌呤二磷酸核糖。選擇一個適中的溫度95 ℃加熱羊血使其中的NADase活性消失，NAD也在此溫度下不被徹底破壞[21]。試驗2中水浴溫度95 ℃制備的不同含量羊血巧克力培養(yǎng)基上，b型流感嗜血桿菌的菌落直徑和生長率隨著羊血含量增加而增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，10%羊血巧克力培養(yǎng)基上的菌落直徑和生長率與兔血巧克力培養(yǎng)基相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這是因為有95 ℃加熱破壞羊血中水解V因子的NADase酶，從而保留V因子活性，但由于V因子不耐高溫，95 ℃加熱過程中V因子有損失，必須增加羊血含量才能提供足量的“V”因子以供b型流感嗜血桿菌正常生長。依次提高羊血巧克力培養(yǎng)基中羊血含量，從5%至10%菌落直徑從(1.08 ±0.09)mm增加為(1.46±0.12)mm，菌落平均生長數(shù)從93±6到176±9；可以看出添加10%以上羊血制備的巧克力培養(yǎng)基上的菌落直徑和生長率與兔血巧克力培養(yǎng)基相當。羊血巧克力培養(yǎng)基中缺乏NAD并不是因為羊血本身缺乏足夠的NAD導(dǎo)致，而是因為羊血巧克力培養(yǎng)基制備過程V因子均被破壞而無法發(fā)揮作用，后期補加NAD可以彌補其缺乏[22]。試驗3證明補加0.2 μg/mL以上NAD之后b型流感嗜血桿菌在羊血巧克力培養(yǎng)基才生長良好。補加0.1 μg/mL NAD條件下，隨著羊血含量增加b型流感嗜血桿菌幾乎不生長；補加0.2 μg/mL與0.4 μg/mL NAD之后b型流感嗜血桿菌生長良好，菌落直徑與生長個數(shù)無明顯差異。綜合考慮各培養(yǎng)基制備方法與配方后，羊血添加量為5%、水浴溫度為85 ℃后續(xù)補加0.2 μg/mL輔酶I(NAD)制備的巧克力培養(yǎng)基是較優(yōu)選擇?？紤]NAD的價格及NAD需除菌后加入，從操作便利性來說，添加10%羊血、水浴溫度為95 ℃制備巧克力培養(yǎng)基是一種操作簡便，且無需除菌所需設(shè)備、耗材和費用的方法。

本研究通過對羊血巧克力培養(yǎng)基制備工藝進行優(yōu)化，使b型流感嗜血桿菌可以在羊血巧克力培養(yǎng)基上生長良好，菌落直徑與菌落生長數(shù)大幅提高。為羊血巧克力工藝優(yōu)化提供了借鑒意義，并且拓展了羊血在Hib分離鑒定所需培養(yǎng)基中的應(yīng)用。