關(guān) 皎，舒欣洋，吳 燕，張?chǎng)┾?，?云，范琢玉，湯鑫淼，朱鶴云，崔 悅*，馮 波*

(1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院 藥學(xué)院，吉林吉林 132013；2. 深圳技師學(xué)院，廣東深圳 518116)

龍膽為龍膽科植物條葉龍膽GentianamanshuricaKitag.、龍膽GentianascabraBge.、三花龍膽GentianatrifloraPall. 或堅(jiān)龍膽GentianarifescensFranch. 的干燥根和根莖。文獻(xiàn)報(bào)道，其能抗抑郁、保肝、抗炎、抗氧化、保護(hù)心肌等[1-5]。在獸藥領(lǐng)域，主治馬、牛、駝、羊等獸類的濕熱黃疸、目赤腫痛、濕疹瘙癢。獸藥制劑如：龍膽瀉肝散、龍膽碳酸氫鈉片、復(fù)方龍膽酊等[6]中也有應(yīng)用。因此，其質(zhì)量控制方法研究對(duì)于控制龍膽藥材以及含有龍膽的復(fù)方制劑具有重要意義?！吨袊?guó)獸藥典》2015年版中收載的龍膽質(zhì)量控制指標(biāo)為龍膽苦苷。然而，龍膽中其他化學(xué)成分，如馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷、異葒草苷和異牡荊素亦具有多種藥理活性[7-12]。因此，對(duì)龍膽中的多種活性成分進(jìn)行質(zhì)量控制十分必要。課題組前期采用了HPLC、UFLC等多種分析技術(shù)建立了相關(guān)質(zhì)量控制方法[13-14]，研究在此基礎(chǔ)上，建立了UFLC-MS/MS方法，同時(shí)測(cè)定龍膽藥材中的7個(gè)活性成分，可為龍膽藥材的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器 3200 QTRAP質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex)，Prominence UFLC型超高快速液相色譜儀(日本島津)，F(xiàn)W80型粉碎機(jī)(天津泰斯特)，N-1300-WB型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELA)。

1.2 試藥 藥品對(duì)照品，其中馬錢苷酸(批號(hào)：111865-202005)、獐牙菜苦苷(批號(hào)：110785-201404)、龍膽苦苷(批號(hào)：110770-201918)和異葒草苷(批號(hào)：111974-201401)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(批號(hào)：180420)、獐牙菜苷(批號(hào)：140401)、異牡荊素(批號(hào)：18053107)購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度均大于98 %。乙腈和甲醇為色譜純(美國(guó)Fisher)。龍膽藥材購(gòu)自吉林市吉林大藥房，吉林醫(yī)藥學(xué)院李景華副教授鑒定為真品。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件 Shim-Pack XR-ODS色譜柱(75 mm×3.0 mm，2.2 (m)，以0.1%甲酸水(A)-甲醇(B)為流動(dòng)相；梯度洗脫(0～12 min，10%→30%B；12～18 min，30%→55%B)，流速為0.5 mL·min-1，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 采用的離子源為電噴霧離子源，即ESI源，正離子檢測(cè)，源噴霧電壓和輔助加熱氣溫度分別為5500 V、550 ℃，多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)進(jìn)行掃描，檢測(cè)的離子反應(yīng)分別為m/z377.2→m/z215.2(馬錢苷酸)、m/z375.2→m/z195.2(獐牙菜苦苷)、m/z519.2→m/z195.2(6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷)、m/z357.2→m/z195.2(龍膽苦苷)、m/z359.2→m/z197.1(獐牙菜苷)、m/z449.1→m/z 299.2(異葒草苷)和m/z433.2→m/z 283.2(異牡荊素)。上述7個(gè)成分的碰撞能量(CE)分別為13 eV、11 eV、20 eV、10 eV、12 eV、33 eV和35 eV。

1.4 溶液的制備

1.4.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液 分別精密稱取7個(gè)對(duì)照品適量并置于5 mL容量瓶中，用甲醇配制成濃度為1.0 mg·mL-1的各成分對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.4.2 供試品溶液 取龍膽藥材粉末0.1 g于具塞錐形瓶中，加入甲醇溶劑20 mL，超聲提取30 min，濾過(guò)后取續(xù)濾液1 mL，離心后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，所得即為供試品溶液。

1.5 線性關(guān)系考察 吸取上述各對(duì)照品溶液，用甲醇配制成系列混合對(duì)照品溶液，其中馬錢苷酸濃度分別為2.5、5、10、25、50和 100 μg·mL-1，獐牙菜苦苷濃度為1、2、4、10、20和 40 μg·mL-1，6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷濃度為1、2、4、10、20和 40 μg·mL-1，龍膽苦苷濃度為5、10、20、25、50和 100 μg·mL-1，獐牙菜苷濃度為0.1、0.2、0.4、1、2和 4 μg·mL-1，異葒草苷濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1和 2 μg·mL-1，異牡荊素濃度分別為0.01、0.02、0.04、0.1、0.2和 0.4 μg·mL-1。將上述樣品于UFLC-MS/MS聯(lián)用儀中分析，同時(shí)記錄峰面積?；貧w方程的橫坐標(biāo)是對(duì)照品的濃度(μg·mL-1)，縱坐標(biāo)是峰面積積分值。

1.6 精密度試驗(yàn) 吸取上述混合對(duì)照品溶液，并連續(xù)進(jìn)樣6 次。

1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液于室溫下放置不同時(shí)間，于不同時(shí)間點(diǎn)(0、2、4、8、12、24 h)分析。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批龍膽樣品6 份，按上述方法得到供試品溶液；并分析測(cè)定，計(jì)算待測(cè)成分的含量。

1.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的同一批次龍膽樣品9份，每份0.05 g，分別加入相當(dāng)于樣品中各測(cè)定成分含量80 %，100 %，120 %的對(duì)照品溶液適量各3份，并制備供試品溶液，進(jìn)樣分析。

1.10 樣品含量測(cè)定 稱取6批龍膽樣品并制備供試品溶液，分析測(cè)定，計(jì)算7個(gè)待測(cè)成分在龍膽中含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜與色譜圖 7種成分的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1，混合對(duì)照品和龍膽樣品的MRM色譜圖見(jiàn)圖2和圖3。

圖1 馬錢苷酸(A)、獐牙菜苦苷(B)、6'-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷(C)、龍膽苦苷(D)、獐牙菜苷(E)、異葒草素(F)、異牡荊素(G)的正離子產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖Fig 1 Full scan product ion spectra of loganic acid(A) swertiamarin(B) 6'-O-β-D- glucosylgentiopicroside(C) gentiopicroside(D) swertioside(E) isoorientin(F) isovitexin(G) in positive ionization mode

1. 馬錢苷酸；2. 獐牙菜苦苷；3. 6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷；4. 龍膽苦苷；5. 獐牙菜苷；6. 異葒草苷；7. 異牡荊素1. Loganic acid; 2. Swertiamarin; 3. 6′-O-β-D- glucosylgentiopicroside; 4. Gentiopicroside；5. Swertioside；6. Isoorientin；7. isovitexin圖2 混合對(duì)照品的MRM色譜圖Fig 2 MRM chromatograms of mixed reference substances

1. 馬錢苷酸；2. 獐牙菜苦苷；3. 6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷；4. 龍膽苦苷；5. 獐牙菜苷；6. 異葒草苷；7. 異牡荊素1. Loganic acid; 2. Swertiamarin; 3. 6′-O-β-D- glucosylgentiopicroside; 4. Gentiopicroside；5. Swertioside；6. Isoorientin；7. isovitexin圖3 龍膽樣品的MRM色譜圖Fig 3 MRM chromatograms of Gentianae Radix Et Rhizoma sample

2.2 線性關(guān)系考察 7個(gè)成分的線性方程分別為：

Y= 5.716×103X+ 1.677×104r= 0.9996

Y= 2.088×104X+ 1.520×104r= 0.9995

Y= 1.441×104X+ 1.637×104r= 0.9995

Y= 2.221×104X+ 1.283×105r= 0.9996

Y= 3.574×104X-3.155×103r= 0.9995

Y= 2.462×104X+ 1.121×102r= 0.9998

Y= 5.731×104X- 2.823×101r= 0.9995

以上結(jié)果說(shuō)明，上述7個(gè)成分分別在2.5～100 μg·mL-1、1～40 μg·mL-1、1～40 μg·mL-1、5～200 μg·mL-1、0.1～4 μg·mL-1、0.05～2 μg·mL-1和0.01～0.4 μg·mL-1具有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn) 7個(gè)成分峰面積RSD值分別為2.8%、1.6%、1.4%、1.7%、2.6%、1.9%和2.5%，即儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 7個(gè)成分峰面積RSD分別為2.0%、1.8%、2.4%、1.7%、1.7%、2.4%和2.6%，表明供試品在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 7個(gè)成分含量的平均值和峰面積RSD分別為0.644%(1.6%)、0.184%(1.9%)、0.155%(2.3%)、3.24%(1.6%)、0.00610%(2.2%)、0.00101%(2.1%)和0.000576%(2.6%)，即方法重復(fù)性符合要求。

2.6 加樣回收率試驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 龍膽樣品中7個(gè)成分的回收率Tab 1 Recoveries of seven analytes in Gentianae Radix Et Rhizoma

2.7 含量測(cè)定 6批樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 龍膽樣品中7個(gè)成分的含量(%)Tab 2 The contents of seven analytes in Gentianae Radix Et Rhizoma (%)

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)中考察了不同種類的流動(dòng)相組成，最終確定采用0.1%甲酸-乙腈作為流動(dòng)相。通過(guò)分析時(shí)間和流動(dòng)相比例的調(diào)整，優(yōu)化后的梯度洗脫程序?yàn)?～12 min，10%→30%B；12～18 min，30%→55%B，此條件可將7個(gè)待測(cè)物成功分離，獲得較好的分離效果。7個(gè)待測(cè)物在ESI源正離子模式響應(yīng)較高。各待測(cè)成分主要形成的準(zhǔn)分子離子均為[M+H]+且信號(hào)穩(wěn)定，具體質(zhì)荷比如下：馬錢苷酸為m/z377.2、獐牙菜苦苷為m/z375.2、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷為m/z519.2、龍膽苦苷為m/z357.2、獐牙菜苷為m/z359.2、異葒草苷為m/z449.1、異牡荊素為m/z433.2，各離子靈敏度較高且信號(hào)較穩(wěn)定。通過(guò)考察不同的碰撞能量(CE)，最終確定上述各待測(cè)成分的CE值分別為13 eV、11 eV、20 eV、10 eV、12 eV、33 eV和35 eV。本研究建立的UFLC-MS/MS分析方法同時(shí)測(cè)定龍膽中7個(gè)活性成分，與已有方法比較[13-14]，分析成分多、分離效果好、分析時(shí)間短、靈敏度高。

3.2 龍膽指標(biāo)成分的選擇 實(shí)驗(yàn)前期，為了能夠較全面完整地完成龍膽的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，對(duì)龍膽的指標(biāo)成分進(jìn)行了選擇。龍膽的主要化學(xué)成分包括環(huán)烯醚萜苷類、黃酮類、三萜類、木脂素類、生物堿等[15-16]?！吨袊?guó)獸藥典》2015年版中僅以龍膽苦苷為考察指標(biāo)，測(cè)定指標(biāo)較為單一，且僅用一種成分控制龍膽藥材的質(zhì)量也有一定局限性。馬錢苷酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷和獐牙菜苦苷為龍膽中的環(huán)烯醚萜苷類成分，異葒草苷和異牡荊素為龍膽中的黃酮類成分。文獻(xiàn)報(bào)道，馬錢苷酸具有抗炎活性[7]，獐牙菜苦苷、獐牙菜苷具有保肝、降脂。促進(jìn)細(xì)胞增殖等作用[8-10]。異葒草苷能夠抗病毒[11]，異牡荊素具有降糖、抗菌等多種藥理活性，近年來(lái)，有研究表明其對(duì)心肌細(xì)胞的瞬時(shí)外向鉀電流亦具有明顯的抑制作用[12]。因此，選擇上述7個(gè)成分作為龍膽質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。

3.3 龍膽藥材的含量測(cè)定 本研究建立了UFLC-MS/MS方法對(duì)龍膽中的7個(gè)活性成分進(jìn)行了含量測(cè)定，7個(gè)活性成分的含量順序由高到低依次為：龍膽苦苷、馬錢苷酸、獐牙菜苦苷、6′-O-β-D-葡萄糖基龍膽苦苷、異牡荊素、獐牙菜苷、異葒草苷?？傮w來(lái)看，環(huán)烯醚萜苷類含量要高于黃酮類成分。

3.4 結(jié)論 本研究首次建立了一種UFLC-MS/MS方法可同時(shí)測(cè)定龍膽中的7個(gè)環(huán)烯醚萜苷類和黃酮類活性成分的含量。該方法成功地測(cè)定了龍膽中上述成分的含量。本研究建立的UFLC-MS/MS方法具有分析時(shí)間短、分離效果好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可為龍膽在獸藥領(lǐng)域的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。