馬 力，宋延平，楊彥平，趙林濤，郭 倩

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 7100033;西安雨田農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，西安 710065)

仔豬細(xì)菌性腹瀉是由于感染大腸桿菌等細(xì)菌以及飼養(yǎng)管理不當(dāng)造成的一種高發(fā)的腸道疾病，好發(fā)于10～30日齡仔豬，致死率高[1]。中獸醫(yī)認(rèn)為仔豬細(xì)菌性腹瀉多因機(jī)體正氣不足，寒濕暑熱等外邪趁機(jī)入侵、飲食不潔、飼養(yǎng)過飽等，導(dǎo)致脾胃腐熟、運(yùn)化失調(diào)、清濁不分,毒邪滯留腸中,使腸道氣滯血瘀,化為膿血,故下痢色白或帶膿血；嚴(yán)重者會導(dǎo)致中氣下陷,出現(xiàn)脫肛等現(xiàn)象,嚴(yán)重者亡陽虛脫致死；中醫(yī)治則多采用澀腸止瀉、清熱燥濕的方劑治療該病,必要時(shí)以扶正固本的中藥為輔[2]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥治療細(xì)菌性仔豬腹瀉有良好的效果[3-5]。

苦白石顆粒由苦參、白頭翁、石榴皮、仙鶴草、肉桂、木香等中藥制成,方中苦參、白頭翁清熱燥濕、涼血止痢[6,7]；仙鶴草、石榴皮可收斂止血止痢、澀腸止瀉[8,9];肉桂[10]補(bǔ)元陽、暖脾胃,治命門火衰、亡陽虛脫、腹痛泄瀉;木香[11]主治行氣止痛、健脾消食,諸藥合用,具有清熱燥濕、澀腸止瀉、扶陽固本、健胃消食的作用,可治療仔豬濕熱下痢,且臨床試驗(yàn)表明療效可靠,安全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對仔豬無毒副作用,是臨床值得推廣的中獸藥方劑[12-14]。但是目前苦白石顆粒作用于仔豬腹瀉的機(jī)制和通路研究較少，無法體現(xiàn)中藥通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路共同作用的特點(diǎn)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合多向藥理學(xué)、分子網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)以及計(jì)算機(jī)模擬分析等技術(shù)，通過構(gòu)建藥物—成分—靶點(diǎn)之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系來闡明藥物作用的方法。在這項(xiàng)研究中，首先通過生物利用度和藥物相似度篩選獲得苦白石顆粒的有效成分，預(yù)測了活性成分的潛在靶點(diǎn)并進(jìn)行了相應(yīng)的基因本體(GO)分析和京都基因組百科全書(KEGG)富集分析，對方中的關(guān)鍵活性成分和靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行了分子對接。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)對潛在活性成分作用于靶點(diǎn)和通路的機(jī)制進(jìn)行初步研究，這符合中醫(yī)治療疾病的整體觀念，也為其深入研究和進(jìn)一步新藥開發(fā)提供參考。

1 材料和方法

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的具體研究內(nèi)容和方法見圖1。

圖1 研究內(nèi)容和方法流程圖Fig. 1 Flow chart of research contents and methods

1.1 篩選苦白石顆粒的活性成分 現(xiàn)代中藥化學(xué)已對苦白石顆粒中6味中藥進(jìn)行了很多研究，發(fā)現(xiàn)其中含有的化合物，有些已被報(bào)道具有抑菌[8]、調(diào)節(jié)炎癥因子[6]等顯著的藥理活性。這對利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法來研究藥物在中醫(yī)藥治理論指導(dǎo)下治療疾病提供了良好的思路。

所有候選化合物中肉桂的活性成分來自于BATMAN數(shù)據(jù)庫(Score cutoff≥20， Adjusted P-value≥0.05)，并錄入 TCMSP以匹配信息；其余5種中藥均來自于TCMSP數(shù)據(jù)庫(選擇DL≥0.18和OB≥30%為篩選條件[15])，以及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的整理。

1.2 藥物靶點(diǎn)預(yù)測 預(yù)測藥物靶點(diǎn)是解釋中藥進(jìn)入體內(nèi)生物作用過程的基礎(chǔ)。TCSMP數(shù)據(jù)庫通過已獲取活性成分預(yù)測其潛在作用靶點(diǎn)。

1.3 仔豬細(xì)菌性腹瀉差異表達(dá)基因的篩選 芯片數(shù)據(jù)(GSE28003)[16]從GEO數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下載，這個(gè)芯片數(shù)據(jù)是基于GPL3533 芯片平臺。GSE28003包含了18例樣品標(biāo)本，其中12例經(jīng)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)GIS26菌株處理，6例作為正常對照，采用GEO2R在線工具篩選由于ETEC感染的腹瀉仔豬和正常仔豬樣本的差異表達(dá)基因(differential expression genes(DEGs),設(shè)置閾值為：|log2FC|>0.5，校正P<0.05。FC(fold change)代表兩組基因表達(dá)值間的差異倍數(shù)。

1.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 藥物預(yù)測靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)映射后得到交集靶點(diǎn)，導(dǎo)入String(https:∥string-db.org/cgi/input.pl)將蛋白質(zhì)互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)保存為“.tsv”文件，通過Cytoscape3.7.2[17]進(jìn)行可視化，并利用其內(nèi)置network analyzer 分析工具分析網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)，包括連接度中心性(Degree centrality，DC)、緊密度中心性(Closeness centrality，CC)、介度中心性(Betweenness centrality，BC)等。

1.5 構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

構(gòu)建 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)主要通過軟件Cytoscape3.7.2來完成，其中節(jié)點(diǎn)代表藥物、活性成分、靶點(diǎn)或疾病，邊代表它們之間的相互關(guān)系；同時(shí)利用network analyzer計(jì)算各個(gè)節(jié)點(diǎn)的重要屬性值，以研究其中較為重要的成分和靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.6 富集分析 基因本體論(GO)和《京都議定書》百科全書的基因和基因組(KEGG)分析獲得的生物過程和信號相關(guān)通路相關(guān)也是研究藥物作用于人體的關(guān)鍵。Metascape平臺(http:∥metascape.org)[18]可對靶點(diǎn)進(jìn)行通路富集分析，該平臺更新及時(shí)，整合了GO、KEGG、Uniprot 等多個(gè)權(quán)威的功能數(shù)據(jù)庫，支持對批量基因或蛋白質(zhì)進(jìn)行注釋、富集分析及構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，GO富集分析可分為細(xì)胞成分(CC)、分子功能(MF)和生物過程(BP)三個(gè)部分。將潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 平臺進(jìn)行GO 及KEGG 分析，保存其結(jié)果并對其進(jìn)行可視化。

1.7 分子對接 從Protein Data Bank (PDB, http:∥www.rcsb.org)[19]下載關(guān)鍵蛋白結(jié)構(gòu)，從ZINC database (http:∥zinc.docking.org/)[20]中找到主要活性成組分的三維結(jié)構(gòu)。將改造后的蛋白和組分引入AutoDock Vina進(jìn)行分子對接，在相同條件下進(jìn)行分子對接模擬，兩者結(jié)合能越低，構(gòu)象越穩(wěn)定，發(fā)生作用可能性越大，一般以結(jié)合能絕對值大于 4.25 說明具有結(jié)合活性，大于 5.0 表明有較好的結(jié)合活性，大于 7.0 說明具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[15]；選擇構(gòu)象最高、結(jié)合自由能絕對值最大的對接結(jié)果,并應(yīng)用 Pymol軟件將對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦白石顆粒的活性成分 在TCSMP數(shù)據(jù)庫中通過各組分的ADME性質(zhì)來篩選潛在的活性成分，結(jié)果得到了74個(gè)OB≥30%、DL≥0.18的潛在活性分子(苦參45個(gè)，白頭翁11個(gè)，石榴皮7個(gè)，仙鶴草5個(gè)，木香6個(gè))；通過BATMAN數(shù)據(jù)庫(Score cutoff≥20， Adjusted P-value≥0.05)，共得到了肉桂19個(gè)活性成分。最后，共有93個(gè)化合物被認(rèn)為是苦白石顆粒潛在的活性化合物。

2.2 獲取活性成分的潛在靶點(diǎn) 通過TCSMP數(shù)據(jù)庫對93種潛在活性化合物的靶點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測，共收集到269個(gè)靶點(diǎn)。其中，苦參45種潛在有效成分共同作用于203個(gè)靶點(diǎn); 白頭翁11種潛在有效成分共同作用于83個(gè)靶點(diǎn); 石榴皮7種潛在有效成分共同作用于197個(gè)靶點(diǎn); 仙鶴草5種潛在有效成分共同作用于182個(gè)靶點(diǎn); 肉桂19種潛在有效成分共同作用于77個(gè)靶點(diǎn);木香6種潛在活性成分共同作用于32個(gè)靶點(diǎn)。因此，不同的活性化合物可以作用于同一靶點(diǎn)，同一活性化合物也可以作用于不同的靶點(diǎn)，體現(xiàn)了中藥復(fù)方多組分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

2.3 苦白石顆粒治療仔豬細(xì)菌性腹瀉的靶點(diǎn)基因

GEO基因數(shù)據(jù)庫篩選仔豬細(xì)菌性腹瀉差異表達(dá)基因，再根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道補(bǔ)充未預(yù)測到的有效成分的已知靶點(diǎn)，并利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫將所得靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化，共得到疾病靶點(diǎn)479個(gè)，其中上調(diào)基因270個(gè)，下調(diào)基因209個(gè)。與2.2獲取的潛在靶點(diǎn)相映射，得到苦白石顆粒治療仔豬細(xì)菌性腹瀉的靶點(diǎn)32個(gè)，如圖2。

圖2 交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection target

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將獲得的32個(gè)交集靶點(diǎn)基因?qū)?String 數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Sus scrofa”，將獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(隱藏掉沒有交集的靶點(diǎn))。結(jié)果顯示，該網(wǎng)絡(luò)共涉及 25個(gè)節(jié)點(diǎn)、106條邊，如圖3所示節(jié)點(diǎn)顏色越深，形狀越大，說明其在網(wǎng)絡(luò)中越重要。不難發(fā)現(xiàn)TNF、VEGFA IL6、IL8、ICAM-1、SERPINE1、MMP1、MMP3等靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)相互作用較強(qiáng)，藥物作用于機(jī)體時(shí)這些靶點(diǎn)發(fā)揮重要作用。

String的PPI圖 Cytoscape的PPI圖圖3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 3 Protein-protein interaction network

2.5 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 靶點(diǎn)與其對應(yīng)的潛在活性成分導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，構(gòu)建了苦白石顆粒治療仔豬細(xì)菌性腹瀉的“藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。其中綠色三角代表藥物，Piglet diarrhoea代表疾病，主要的活性成分用藍(lán)紫色的圓形表示，黃色的四邊形代表靶點(diǎn)(圖4)。對化學(xué)成分進(jìn)行度值計(jì)算，發(fā)現(xiàn)度值較高的槲皮素、木犀草素、山奈酚等潛在活性成分可能是防控仔豬細(xì)菌性腹瀉的關(guān)鍵成分。

String的PPI圖 Cytoscape的PPI圖圖4 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 Drug - active ingredient - target - disease network

2.6 苦白石顆粒治療仔豬細(xì)菌性腹瀉通路富集結(jié)果分析及可視化

2.6.1 GO富集分析 對核心靶點(diǎn)分別進(jìn)行GO-CC、GO-BP和GO-MF富集分析，并將基因結(jié)果進(jìn)行可視化，如圖5。生物過程的富集結(jié)果主要集中在對脂多糖和氧含量的調(diào)節(jié)、損傷反應(yīng)、細(xì)胞運(yùn)動的正調(diào)節(jié)以及凋亡信號通路的負(fù)調(diào)控等。細(xì)胞組成主要包括參與膜筏組織的蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)、粘著斑、線粒體被膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔以及分泌顆粒內(nèi)腔等，表明藥物的活性成分會與多種蛋白相結(jié)合而發(fā)揮治療疾病的作用。就分子功能而言，藥物治療仔豬細(xì)菌性腹瀉的作用主要與細(xì)胞因子的活性、血紅素的結(jié)合、蛋白酶結(jié)合以及與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等分子功能相關(guān)，這些分子功能主要參與炎癥反應(yīng)、蛋白質(zhì)和藥物的選擇性作用，從而影響機(jī)體的結(jié)構(gòu)和功能。

圖5 GO富集分析結(jié)果Fig. 5 GO enrichment analysis results

2.6.2 KEGG通路分析 將核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，不難發(fā)現(xiàn)IL-17信號通路、HIF-1信號通路(排除與仔豬腹瀉無關(guān)的通路)等主要在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)以及細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮作用，這與GO富集結(jié)果具有一致性，說明苦白石顆粒主要活性成分的作用靶點(diǎn)是多條不同通路、多種成分、多個(gè)靶點(diǎn)相互作用的，如圖6。

圖6 KEGG富集分析結(jié)果Fig. 6 KEGG enrichment analysis results

2.7 對接結(jié)果 分子對接結(jié)果顯示，苦白石顆粒中DC值最高的3個(gè)化合物分別與治療核心靶點(diǎn)一一進(jìn)行對接，這些關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能普遍較高，如表3，這進(jìn)一步表明AG可能通過多組分靶通路模式發(fā)揮治療仔豬細(xì)菌性腹瀉的作用，部分可視化結(jié)果如圖7。

Luteolin—TNF Quercetin—TNF Kaempferol—TNFLuteolin—IL6 Quercetin—MMP1 Luteolin—ICAM-1圖7 分子對接可視化結(jié)果Fig. 7 Visualization results of molecular docking

表1 3個(gè)化合物與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果Table 1 Docking results of three compounds with core target molecules

3 討論與結(jié)論

武超[21]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了苦參止痢顆粒治療仔豬腹瀉的有效成分及作用機(jī)制，陳志飛[22]研究了黃芪防控豬繁殖與呼吸綜合征的物質(zhì)基礎(chǔ)及靶點(diǎn)信息，均是中獸醫(yī)藥領(lǐng)域通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)手段對中藥復(fù)方進(jìn)行的有益探索。中獸醫(yī)學(xué)具有整體觀念和辨證論治的中醫(yī)理論特點(diǎn)，中藥復(fù)方通過多組分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同發(fā)揮作用；中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則是對藥物分子-靶點(diǎn)-疾病構(gòu)建的生物信息網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行綜合分析，從而識別中藥的有效成分，闡釋其作用機(jī)制，兩者不謀而合，為中獸藥的開發(fā)提供了新的研究思路和手段[23]。

研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素、槲皮素等通過干擾PEDV復(fù)制影響感染初期，具有抗豬流行性腹瀉的活性，與化學(xué)藥物利巴韋林、干擾素-α等相比，具有低毒高效的優(yōu)勢[24,25]。對LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激體外實(shí)驗(yàn)[26]發(fā)現(xiàn)，木犀草素具有抗氧化和抗菌活性，能有效地保護(hù)豬腸上皮細(xì)胞抵抗革蘭氏陰性菌，預(yù)防和治療豬胃腸道感染；通過減緩體重減輕，降低腹瀉評分，抑制十二指腸、結(jié)腸的絨毛縮短、空泡化，促進(jìn)粘液蛋白的生成，預(yù)防和治療小鼠腸黏膜炎引起的腸道損傷[27]。槲皮素作為天然抗氧化劑，可緩和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇誘導(dǎo)的家畜胃腸道細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激反應(yīng)，通過促進(jìn)腸上皮細(xì)胞Nrf2蛋白豐度、調(diào)節(jié)GSH相關(guān)氧化還原穩(wěn)態(tài)來減輕腸細(xì)胞損傷，對弗氏志賀菌誘導(dǎo)的大鼠感染性腹瀉，槲皮素顯著降低糞便密度和含水量，并恢復(fù)血液參數(shù)、抗氧化狀態(tài)和促炎細(xì)胞因子(IL-6和TNF-α)表達(dá)，這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)槲皮素在維持腸道穩(wěn)態(tài)中的作用和有效的抗腹瀉活性[28-30]。山奈酚具有抗氧化、抗凋亡等多種生物活性，能夠改善豬腸上皮細(xì)胞的氧化損傷和凋亡，減輕腸屏障功能障礙[31]。

TNF-α是導(dǎo)致胃腸道炎癥易感和惡化的主要介質(zhì)，可在受損的腸粘膜中大量表達(dá)，表達(dá)量越高，其病變范圍越大、越嚴(yán)重，仔豬感染腹瀉后，TNF-α顯著提高了IL-6和IL-8的表達(dá)水平，促炎細(xì)胞因子通過直接誘導(dǎo)信號分子或間接刺激細(xì)胞增殖，從而在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[32]。

通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-17信號通路是苦白石顆粒治療仔豬細(xì)菌性腹瀉過程中最重要的信號通路之一，該通路在急、慢性炎癥反應(yīng)中起著舉足輕重的作用，IL-17 是T細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的早期啟動因子，可以促進(jìn)T 細(xì)胞的激活和刺激上皮細(xì)胞等產(chǎn)生多種細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、CAM-1等，放大炎癥反應(yīng)[33]。另外，多種胃腸道疾病的病因與氧化應(yīng)激有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)藥物作用使HIF-1信號通路中HIF-1α表達(dá)降低，下游COX-2的表達(dá)上調(diào)，表明腸粘膜對缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)，減輕了仔豬腸道的損傷[34]。

從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的角度探討了苦白石顆粒在仔豬細(xì)菌性腹瀉防治中的有效成分及作用機(jī)制，并利用分子對接技術(shù)進(jìn)行了初步驗(yàn)證，木犀草素、槲皮素、山奈酚等活性成分作用于TNF、VEGFA IL6、IL8、ICAM-1、SERPINE1、MMP1、MMP3等靶點(diǎn)，進(jìn)而調(diào)控IL-17、HIF-1等信號通路，參與抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫、抗感染等生物過程。下一步將通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法對苦白石顆粒作用的靶點(diǎn)和通路進(jìn)行充分研究。