何 環(huán)，黃新穎，黃再興，張 倩，陳子豪，趙 晗，任恒星，黃冠華

(1.中國礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，煤炭加工與清潔利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221116；2.煤與煤層氣共采國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 晉城 048000)

煤層氣是成煤物質(zhì)在煤化作用過程中生成且儲(chǔ)集于煤層中的一種非常規(guī)天然氣[1]，根據(jù)成因可以分為熱成因氣和生物成因氣，其中，生物成因氣具有分布廣、埋藏淺和開發(fā)成本低的特點(diǎn)，利用微生物增產(chǎn)煤層氣是當(dāng)前煤層氣開發(fā)領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

煤生物產(chǎn)氣過程受到多種因素的影響，國內(nèi)外研究人員希望通過優(yōu)化產(chǎn)氣條件來提高甲烷生成效率[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)多種因素對(duì)煤生物產(chǎn)甲烷有很大影響。其中，包括物理因素如溫度[3]、pH 值[4-5]，化學(xué)因素如氧化還原電位[6]、外加碳源種類[7]、煤化程度[8]等，以及生物因素如外源菌群[9]、微生物預(yù)處理[10]等。煤是一種由無機(jī)礦物和有機(jī)質(zhì)構(gòu)成的復(fù)雜化合物，因此，其賦存的無機(jī)礦物對(duì)生物產(chǎn)氣過程也會(huì)存在一定影響。鄧寅生等[11]研究表明煤矸石的添加有利于義馬長(zhǎng)焰煤生物甲烷的產(chǎn)生；邵培等[12]證明煤中灰分對(duì)生氣速率有影響，其中，黃鐵礦和黏土礦物可以提高生物活性，加快生氣速率。

高嶺土是自然界中一種分布較常見的黏土礦物，在煤中分布也較多。已有研究表明，水相體系中固液界面上的離子、有機(jī)物和微生物與高嶺土的相互作用控制著環(huán)境中許多重要的地球化學(xué)過程[13]。高嶺土的存在會(huì)對(duì)微生物的分布、活性、多樣性、基因表達(dá)與電子傳遞等產(chǎn)生影響。D.A.Ams 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，高嶺土可以作為Pseudomonas mendocina的營養(yǎng)來源，該細(xì)菌所分泌的嗜鐵素與高嶺土中的鐵結(jié)合，加快礦物中鐵元素的溶出速率，為菌株代謝提供生長(zhǎng)因子。目前，研究人員大多支持礦物提高微生物活性是基于礦物的表面活性，但也有一些研究者認(rèn)為礦物可以改變微生物的代謝方式來提高微生物活性[15]。J.Cuadros等[16]報(bào)道高嶺土可以促進(jìn)Escherichia coli的生長(zhǎng)，主要原因在于高嶺石降低了大腸桿菌對(duì)葡萄糖的降解速率，并將菌株降解乙酸所釋放的部分能量用于細(xì)胞分裂。在貧瘠營養(yǎng)或者不利環(huán)境條件(如重金屬、加熱、紫外線等)下，礦物可保護(hù)微生物，維持微生物活性。最新研究結(jié)果顯示，當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞附著在高嶺土表面時(shí)，細(xì)菌的氧化還原代謝得到促進(jìn)，可以對(duì)抗惡劣環(huán)境刺激[17]。也有研究指出，高嶺土與銀組成的復(fù)合物可以有效控制食品中病原微生物數(shù)量[18]。S.Hwang等[19]指出在添加高嶺土和蒙脫石的培養(yǎng)基中，細(xì)胞的存活率明顯提高，造成這種現(xiàn)象的原因是礦物改變了細(xì)菌生存與代謝方式。

由此可見，高嶺土?xí)?duì)微生物的生長(zhǎng)代謝活性產(chǎn)生影響，它也是煤中較為常見的無機(jī)礦物。但是，目前有關(guān)煤中高嶺土對(duì)生物產(chǎn)氣影響的研究報(bào)道較少。榆林是我國主要的煤產(chǎn)地之一，前期研究表明，該地區(qū)的煤具有較好的生物產(chǎn)氣潛力[20]。因此，筆者以該地區(qū)煤樣作為產(chǎn)氣底物，前期馴化的微生物作為產(chǎn)氣菌群，通過大浮沉方法得到低灰分煤，研究不同高嶺土添加量對(duì)模擬產(chǎn)氣過程中CH4產(chǎn)量、總揮發(fā)性脂肪酸(Volatile Fatty Acids,VFAs)、輔酶F420、煤中有機(jī)官能團(tuán)和微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為闡明煤中無機(jī)礦物對(duì)生物產(chǎn)氣的影響機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與實(shí)驗(yàn)方法

1.1 微生物、煤與高嶺土

實(shí)驗(yàn)中所用微生物為前期馴化保存的產(chǎn)甲烷混合菌群，該菌群對(duì)褐煤有較好的厭氧降解產(chǎn)氣效果。微生物培養(yǎng)所用的基本鹽培養(yǎng)基、微量元素和微生物群落結(jié)構(gòu)組成見參考文獻(xiàn)[21-22]。研究所用煤樣采自陜西榆林，為了盡量減少煤本身的礦物組分對(duì)產(chǎn)氣結(jié)果的干擾，依據(jù)GB/T 478-2008《煤炭浮沉試驗(yàn)方法》進(jìn)行大浮沉實(shí)驗(yàn)，將榆林煤處理為不同密度等級(jí)煤，然后選擇密度等級(jí)最低的煤(1.3～1.4 g/cm3，灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)4.84%)，粉碎篩分至0.125 mm 以下作為生物模擬產(chǎn)氣底物，處理前后煤的工業(yè)分析結(jié)果見表 1。實(shí)驗(yàn)所用高嶺土樣品購自天津市福晨化學(xué)試劑廠(化學(xué)純)，粉碎篩分至0.125 mm 以下備用。

表1 原煤和低灰分煤樣工業(yè)分析測(cè)試結(jié)果Table 1 Proximate analysis of raw coal and low ash coal samples

1.2 生物模擬產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)

為探究高嶺土添加量對(duì)榆林煤生物模擬產(chǎn)氣的影響，根據(jù)原煤中元素含量和文獻(xiàn)[23]，按照高嶺土質(zhì)量占煤質(zhì)量的不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)，共設(shè)置7 個(gè)添加量梯度：0(空白對(duì)照組)、0.5%、1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%，編號(hào)分別為G-1、G-2、G-3、G-4、G-5、G-6、G-7。每個(gè)梯度設(shè)置3 組平行樣，將高嶺土添加到250 mL 厭氧瓶中，每組加入200 mL 培養(yǎng)基，20 g 煤粉，滅菌后用無菌注射器接種20 mL 混合菌液，蓋好瓶塞，然后將其放入35℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)50 d，培養(yǎng)過程中定期檢測(cè)瓶?jī)?nèi)甲烷含量變化。

1.3 參數(shù)分析方法

1) CH4含量

從模擬產(chǎn)氣第15 天開始，每隔7 d 測(cè)量厭氧瓶頂部空間中氣體產(chǎn)量的動(dòng)態(tài)變化，用進(jìn)樣針采氣前要將厭氧瓶充分搖勻。每次測(cè)完后用滅菌的無菌針頭插入?yún)捬跗坎⒖焖賹捬跗宽敳靠臻g中氣體放出。采用氣相色譜氣體中CH4含量，氣相色譜條件：美國 Angilent 7890 氣相色譜配Carbonplot 色譜柱(60 m×320 μm×1.5 μm)和TCD 檢測(cè)器，氣密針進(jìn)樣，進(jìn)樣量0.5 mL。色譜進(jìn)樣口溫度150 ℃，柱溫箱溫度30℃，檢測(cè)器溫度200℃。記錄CH4濃度，然后將其換算成物質(zhì)的量(mol)，計(jì)算方法如下：

式中：n為物質(zhì)的量；c為物質(zhì)的量濃度；V為氣體體積，ρ為物質(zhì)密度；w為物質(zhì)質(zhì)量濃度；M為溶質(zhì)的摩爾質(zhì)量。

累積甲烷含量為每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)前甲烷產(chǎn)量之和。

2) VFAs 含量

VFAs 是厭氧消化過程的重要中間產(chǎn)物，通過檢測(cè)VFAs 含量可以了解煤的生物降解過程。產(chǎn)氣結(jié)束后，分別取各實(shí)驗(yàn)組和空白組的反應(yīng)液10 mL，10 000 r/min 離心5 min，保留上清液，按照每1.5 mL樣品加75 μL 的34% 磷酸的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行封存，處理完畢后，用0.22 μm 濾膜過濾，然后密封待測(cè)。采用氣相色譜(島津，GC-2014)對(duì)VFAs 進(jìn)行測(cè)定，色譜分析條件：Stabilwax-DA 30 m×0.53 mm×0.25 m 型毛細(xì)管柱，F(xiàn)ID 檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為150℃。

3) 輔酶F420含量

輔酶F420是一種胞內(nèi)酶，測(cè)定時(shí)需要先破碎細(xì)胞，使得其中的酶釋放出來。本次采用ELISA 方法測(cè)定F420含量，其具體過程如下：用注射器從厭氧瓶中收集培養(yǎng)液2 mL 放入滅菌離心管中，3 000 r/min 離心20 min 后，用移液器取上清1.5 mL 轉(zhuǎn)到新的滅菌離心管，10 000 r/min 離心20 min 后棄掉上清液，用PBS(pH=7.2～7.4)重懸細(xì)胞，顯微計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度達(dá)到107個(gè)/mL左右，然后對(duì)樣品進(jìn)行反復(fù)凍融，破壞細(xì)胞使其釋放出胞內(nèi)成分。用BCA 蛋白法含量測(cè)試盒(ADS-W-DB005)測(cè)定樣品中總蛋白濃度，確保其在20～2 000 μg/mL 范圍內(nèi)。按照試劑盒的操作流程取10 μL 樣品加入酶標(biāo)板孔，用酶標(biāo)儀(芬蘭，Labsystems Multiskan MS)在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中輔酶F420(CoF420)含量。

4) 煤的有機(jī)官能團(tuán)

產(chǎn)氣結(jié)束后，將反應(yīng)后的殘煤真空抽濾收集，冷凍干燥后將煤樣研磨至粒度小于0.074 mm，取少量樣品與KBr 按1∶120 加入用瑪瑙研缽研磨后壓片，用紅外光譜(FT-IR)儀(德國布魯克VERTEX 80 V)分析樣品中有機(jī)官能團(tuán)，測(cè)試掃描波段范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

5) 微生物群落結(jié)構(gòu)

將產(chǎn)氣結(jié)束后的培養(yǎng)液搖勻，取40 mL 混合液放入離心管中，在13 000 r/min 下離心20 min，棄去上清液，保留沉淀物質(zhì)1～3 g，將其密封放入-80℃下冷凍24 h，然后用干冰保存寄送到上海美吉生物Illumina高通量測(cè)試平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

細(xì)菌多樣性測(cè)定引物序列：

338F：5'-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3'；806 R：5'-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3'。

古菌多樣性測(cè)定引物序列：

524F：5'-TGYCAGC-CGCCGCGGTAA-3' ；958R：5'-YCCGGCGTTG-AVTCCAATT-3'。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 CH4 產(chǎn)量

不同高嶺土添加量的實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)CH4量和累積產(chǎn)甲烷量曲線如圖1 所示，從圖1a 中可以看出，7 個(gè)梯度實(shí)驗(yàn)組的產(chǎn)氣周期并不完全同步，但是整體CH4產(chǎn)量變化趨勢(shì)基本一致。總的來看，不同添加量的高嶺土可以分為2 組，0～1.0% 和2.0%～8.0%，在這2 個(gè)添加量區(qū)間內(nèi)，大部分添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組在產(chǎn)氣前期(第15-22 天)甲烷產(chǎn)量均高于對(duì)照組，其中0.5%和4.0%添加量在第22 天時(shí)達(dá)到最高后迅速下降，而添加量為6.0%和8.0%時(shí)甲烷產(chǎn)量在(第15-第29 天)仍逐漸上升，然后分別在第29 天和第36 天后下降。大部分添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組在第50 天產(chǎn)甲烷量均超過空白對(duì)照組，并且0～1.0% 添加量和2.0%～8.0% 添加量的累積產(chǎn)甲烷量均有先升后降的趨勢(shì)，其中添加8.0 %高嶺土在第50 天產(chǎn)氣量最高，每克煤達(dá)到87.65 μmol，較空白組高30.56%，說明添加適量的高嶺土在發(fā)酵后期能夠促進(jìn)煤的生物產(chǎn)氣。

圖1 甲烷產(chǎn)量變化趨勢(shì)Fig.1 Change trend of methane production

不同高嶺土添加量的實(shí)驗(yàn)組，累積甲烷產(chǎn)量由高至低的順序?yàn)?.5%、8.0%和4.0%(圖1b)，其中，添加0.5%高嶺土實(shí)驗(yàn)組的累積產(chǎn)甲烷量最高可達(dá)216 μmol/g 煤，較空白組提高55.4%。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，煤的生物產(chǎn)氣量并非與高嶺土添加量成正比，而是在一定區(qū)間內(nèi)波動(dòng)，這可能是因?yàn)槲⑸锏膮捬醍a(chǎn)氣是一個(gè)動(dòng)態(tài)過程，而高嶺土對(duì)不同微生物的影響存在差異，這也會(huì)影響最終產(chǎn)氣量。但是，添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組其平均甲烷產(chǎn)量(159.2 μmol/g)高于對(duì)照組(139.0 μmol/g)，說明添加適量的高嶺土能夠促進(jìn)煤的生物產(chǎn)氣。

M.L.Ali 等[24]研究高嶺土添加量對(duì)牛糞發(fā)酵產(chǎn)甲烷的影響，發(fā)現(xiàn)添加的高嶺土質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí)可以明顯促進(jìn)甲烷的生成，因?yàn)楦邘X土在厭氧消化過程中溶解釋放的微量元素有助于提高微生物的生長(zhǎng)活性，提高微生物之間的協(xié)同作用，促進(jìn)CH4產(chǎn)生。不同高嶺土添加量對(duì)于產(chǎn)氣的影響不同，與微生物對(duì)于無機(jī)礦物的需求有關(guān)。從目前的結(jié)果來看，高嶺土的添加并不是越多越好，這可能與高嶺土對(duì)體系中不同微生物的影響存在差異，由于本次實(shí)驗(yàn)所用的混合菌中含有大量微生物，由于其產(chǎn)生甲烷的途徑并不單一，不同途徑中起作用的微生物不同，所以不同添加量的高嶺土?xí)斐杉淄榭偖a(chǎn)量的差異。

另外，高嶺土等黏土礦物具有較好的緩沖能力和吸附能力，可以調(diào)節(jié)體系的pH 值或者吸附溶液中微生物代謝產(chǎn)生的有毒代謝物，可以較好維持微生物活性，因此對(duì)生長(zhǎng)代謝過程有促進(jìn)作用。Chen Hao等[25]研究認(rèn)為蒙脫石和高嶺石表面可以與細(xì)菌代謝過程中產(chǎn)生的氫離子進(jìn)行交換，此過程可以間接影響微生物的活性，礦物質(zhì)可以通過將微生物所處環(huán)境的pH 值保持在生長(zhǎng)的最佳生理范圍內(nèi)，從而對(duì)附著在上面的細(xì)菌產(chǎn)生刺激作用。Wu Huayong 等[26]研究發(fā)現(xiàn)蒙脫石吸收了惡臭假單胞菌生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的抑制劑，顯著提高其代謝活性。本次研究中高嶺土添加量對(duì)產(chǎn)甲烷量也有促進(jìn)作用，尤其是在發(fā)酵后期生成的酸對(duì)產(chǎn)甲烷菌存在抑制，而高嶺土的添加對(duì)體系具有緩沖作用，促進(jìn)甲烷生成，提高甲烷產(chǎn)量。

2.2 VFAs 質(zhì)量濃度

VFAs 主要指小分子酸類物質(zhì)，它是在有機(jī)質(zhì)降解過程中形成的主要中間代謝產(chǎn)物，通常情況下，VFAs 以乙酸、丙酸和丁酸為主，存在少量的戊酸和異戊酸等物質(zhì)[27]。VFAs 是影響厭氧產(chǎn)氣穩(wěn)定性的重要因素之一，通過測(cè)定產(chǎn)氣末端產(chǎn)物中VFAs 含量，可以判斷產(chǎn)氣原料水解后是否完全轉(zhuǎn)換為乙酸等供給產(chǎn)甲烷菌利用，以及體系是否發(fā)酵完全。一般，體系中的VFAs 濃度需要控制在某個(gè)范圍內(nèi)，當(dāng)VFAs 質(zhì)量濃度高于400 mg/L，厭氧發(fā)酵體系便會(huì)受到輕度抑制，當(dāng)VFAs 高于1 000 mg/L，厭氧發(fā)酵體系受到中度抑制[28]。

由圖2 可知，添加高嶺土的煤樣，其生物產(chǎn)氣體系中，VFAs 水平皆在10 mg/L 以下，對(duì)厭氧發(fā)酵體系均不產(chǎn)生抑制。這也說明在50 d 的發(fā)酵周期中，有機(jī)物的發(fā)酵都比較徹底，沒有過多的VFAs 殘留。隨著體系中高嶺土添加量的增加，丙酸濃度呈先增大后減小趨勢(shì)，而乙酸和VFAs 的變化也存在2 個(gè)變化區(qū)間，在0～1.0%和2.0%～8.0%添加量?jī)?nèi)均呈現(xiàn)先減后增趨勢(shì)，在0.5%和4%時(shí)乙酸和VFAs 含量最低。這可能是由于較低量的高嶺土能夠吸附反應(yīng)體系中產(chǎn)生的毒性物質(zhì)，從而減輕其對(duì)產(chǎn)氣功能菌群的毒害作用，促進(jìn)了酸的生成，而較高含量的高嶺土能夠作為酸堿緩沖劑，改善酸環(huán)境，抑制酸的產(chǎn)生。除了8.0%的實(shí)驗(yàn)組乙酸濃度高于對(duì)照組外，其余均比對(duì)照組低，說明高嶺土的添加提高了乙酸的利用率，高嶺土添加量增加到8.0%后，產(chǎn)氣結(jié)束時(shí)培養(yǎng)液中殘留的乙酸含量較高，這可能是由于產(chǎn)氣結(jié)束時(shí)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)累積了大量甲烷，而甲烷會(huì)抑制產(chǎn)甲烷反應(yīng)過程，故而造成乙酸量累積。在高嶺土添加量為0.5%和4.0%時(shí)乙酸濃度均較小，這可能與2 組發(fā)酵液中產(chǎn)乙酸菌的豐度有關(guān)。

圖2 高嶺土添加量對(duì)VFAs 質(zhì)量濃度的影響Fig.2 Effect of kaolin addition on VFAs content

根據(jù)圖2 可知，高嶺土質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的實(shí)驗(yàn)組中，發(fā)酵液中VFAs 含量最高，說明煤被生物利用產(chǎn)甲烷的程度也最高，因此，推測(cè)此時(shí)最有利于煤被微生物降解。結(jié)合圖1a 結(jié)果來看，該添加量條件下第36 天之后，產(chǎn)甲烷含量快速上升，第50 天時(shí)與8.0%和0.5% 添加量下產(chǎn)甲烷接近。但是，其累積產(chǎn)甲烷量(圖1b)較低，可能原因有兩點(diǎn)：其一，本研究中僅分析了反應(yīng)50 d 體系中VFAs 的含量，而對(duì)整個(gè)動(dòng)態(tài)過程并沒有進(jìn)行分析，所以僅能表明在該產(chǎn)氣周期內(nèi)，2.0%添加量中VFAs 量最高，但是VFAs 被其他微生物利用產(chǎn)氣存在一定滯后性；其二，生物產(chǎn)氣是微生物協(xié)同作用的過程，高嶺土對(duì)體系中的微生物存在不同程度的影響，在2.0%的添加量體系中產(chǎn)VFAs 的微生物可能較活躍。

2.3 輔酶F420 質(zhì)量濃度

輔酶F420是產(chǎn)甲烷菌特有的物質(zhì)，主要是作為低電位電子轉(zhuǎn)移載體，在甲烷形成過程中起著重要作用，輔酶F420含量作為評(píng)價(jià)厭氧消化器中產(chǎn)甲烷菌的活力指標(biāo)[29]。由圖3 可以看出，輔酶F420含量在添加不同高嶺土實(shí)驗(yàn)組之間波動(dòng)不大，但整體均高于對(duì)照組，并且其波動(dòng)也可分為0～1.0%與2.0%～8.0%2 個(gè)區(qū)間，在添加量區(qū)間內(nèi)呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)。結(jié)合VFAs 變化趨勢(shì)也可發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)420活性高時(shí)，體系中乙酸和VFAs 濃度較低，這說明高嶺土影響發(fā)酵液中產(chǎn)甲烷菌的活性，體系中乙酸和VFAs 的消耗是產(chǎn)甲烷菌消耗所致。另外，高嶺土中含有的微量元素等物質(zhì)是產(chǎn)甲烷過程中各種反應(yīng)所需要酶的重要組成部分，能夠抑制同型產(chǎn)乙酸菌的活性，刺激產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)，使產(chǎn)甲烷菌在混合菌體中有較高的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。在高嶺土添加量為4.0%時(shí)其輔酶F420活性最高，達(dá)到48.93 ng/L，較對(duì)照組提高15.43%，表明在2.0%～8.0%添加區(qū)間內(nèi)，4.0%為高嶺土的最適宜添加量。

圖3 輔酶F420 質(zhì)量濃度隨高嶺土添加量的變化Fig.3 Changes in the concentration of Coenzyme F420 with the content of added minerals

2.4 有機(jī)官能團(tuán)

煤的大分子結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，包括芳香族和脂肪族碳?xì)浠衔镆约暗?、硫和氧的雜環(huán)化合物，煤結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性嚴(yán)重影響微生物的直接作用效率，影響生物煤層氣的產(chǎn)率[30]。研究表明，煤與甲烷的生物轉(zhuǎn)化在很大程度上依賴于煤中有機(jī)組分的生物有效性[31]。

本文利用紅外光譜(FT-IR)技術(shù)對(duì)煤及產(chǎn)氣后殘煤的官能團(tuán)進(jìn)行分析。圖4 中為3 種高嶺土添加量與原煤的FT-IR 譜圖對(duì)比。選取這幾種進(jìn)行測(cè)試是考慮到其之間梯度較大，理論上其變化會(huì)更明顯。整體而言，3 個(gè)添加量實(shí)驗(yàn)組之間，紅外光譜的出峰位置并沒有明顯區(qū)別，說明不同高嶺土添加量的產(chǎn)氣體系中，煤被微生物利用過程中官能團(tuán)的變化大體相同。對(duì)比原煤和產(chǎn)氣后殘煤的紅外吸收光譜，可以看出，實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)氣后殘煤在波長(zhǎng)3 420 cm-1處均未出峰，而在原煤的相同位置確有一寬峰。根據(jù)煤樣的紅外特征吸收峰[32]，3 420 cm-1附近對(duì)應(yīng)醇、酚-OH 及-NH-和-NH2的伸縮振動(dòng)，說明產(chǎn)氣過程中煤相應(yīng)的官能團(tuán)被微生物利用。此外，G-4 的殘煤在1 900 cm-1處未出峰，而原煤和其他組在1 900 cm-1處均有峰，1 900 cm-1附近對(duì)應(yīng)C=O 伸縮振動(dòng)，說明高嶺土添加量為2.0%時(shí)煤中C=O 更易被微生物利用。產(chǎn)氣前后代表礦物質(zhì)(如Si-O-Si、Si-O-Al 等)的吸收峰(1 014、1 018、1 041 cm-1)均未減少，說明產(chǎn)氣過程中礦物并未直接參與反應(yīng)過程。以上分析也表明，煤中的小分子結(jié)構(gòu)易于被產(chǎn)甲烷微生物利用，而大分子芳環(huán)則難以被降解。

圖4 不同高嶺土添加量樣品產(chǎn)氣后紅外光譜吸收峰對(duì)比Fig.4 Comparison of infrared spectrum absorption peaks between samples with different concentration of kaolin

2.5 微生物群落組成的變化

1)多樣性指數(shù)

產(chǎn)氣結(jié)束后，7 組樣品高通量測(cè)序結(jié)果共得到309 071條細(xì)菌和328 252 條古菌16S rRNA 基因序列。細(xì)菌和古菌的序列平均長(zhǎng)度分別是416.87 bp 和429.75 bp。表2 列出了7 組樣品的Alpha 多樣性指數(shù)，從表中可以看出，對(duì)于添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組而言，前3 組(G-1、G-2和G-3) 的細(xì)菌豐度實(shí)際觀測(cè)值、Chao 指數(shù)和Ace指數(shù)均最高，說明前3 組產(chǎn)氣體系中細(xì)菌的豐度較高，由此可以看出當(dāng)培養(yǎng)基中不添加或者添加較少(0.5%，1.0%)的高嶺土?xí)r，產(chǎn)氣體系中細(xì)菌的種類較為豐富。G-3 的古菌豐度實(shí)際觀測(cè)值和Chao 指數(shù)均最高，表明產(chǎn)氣體系中古菌的種類最豐富。同時(shí)，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)說明G-4 細(xì)菌和G-3 古菌多樣性最高。此外，全部樣品的覆蓋度指數(shù)范圍在0.998 以上，表明各樣品中微生物序列均被測(cè)出，可以代表樣品中微生物的種群結(jié)構(gòu)。

表2 高嶺土實(shí)驗(yàn)組的Alpha 多樣性指數(shù)Table 2 Alpha diversity index of kaolin test group

根據(jù)測(cè)序結(jié)果顯示，細(xì)菌共有291 個(gè)OTU(Operational Taxonomic Unit)，可以分為18 個(gè)門、145 個(gè)屬。圖5 為空白組與添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組中細(xì)菌在門水平和屬水平的群落分布柱狀圖。

圖5 添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Fig.5 Bacteria community histogram of the kaolin test group

2) 細(xì)菌群落組成

由圖5a 可知，在門水平以Firmicutes(厚壁菌門)最為豐富(41.25%～56.94%)，其次分別是Desulfobacterota(脫硫菌門)(14.31%～27.22%)、Bacteroidota(擬桿菌門)(6.13%～16.66%)、Spirochaetota(螺旋菌門)(4.12%～9.99%)、Synergistota(3.99%～9.09%)、Campilobacterota(彎曲菌門)(1.33%～7.49%)、Caldisericota(0.34%～2.13%)等。從結(jié)果來看，高嶺土添加量在0～1.0%和2.0%～8.0%時(shí)，F(xiàn)irmicutes 的豐度先增后減，該菌門中微生物主要參與一些混合酸、醇和中性物質(zhì)的生成，可見高嶺土添加量為0.5% 和4.0% 時(shí)對(duì)提高煤中有機(jī)質(zhì)降解有促進(jìn)作用。Bacteroidota 是一類化能自養(yǎng)型微生物，它們能參與苯酚等有機(jī)物的降解產(chǎn)生琥珀酸、乙酸、甲酸、乳酸和丙酸等過程[33]。

從圖5 可以看出，2.0%高嶺土添加量，第50 天時(shí)該菌門豐度最高，該結(jié)果與VFAs 的變化較為一致，可見該添加量體系對(duì)擬桿菌門的活性有促進(jìn)作用，使得VFAs 含量上升。Desulfobacterota 中大多為硫酸鹽還原菌，利用有機(jī)質(zhì)同時(shí)可將硫酸鹽還原為H2S[34]，大多數(shù)添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組中，該菌門豐度均高于對(duì)照組，說明高嶺土添加可以提高脫硫菌門豐度。

從屬水平來看(圖5b)，群落結(jié)構(gòu)變化規(guī)律并不明顯。由圖中可以發(fā)現(xiàn)，Paraclostridium(梭菌屬)是細(xì)菌中豐度最高的菌屬(13.69%～30.47%)，接下來豐度較高的菌屬依次為Desulforhabdus(桿狀脫硫菌屬)(4.90%～10.62%)、JGI-0000079-D21(3.99%～9.09%)、norank fSpirochaetaceae(未分類螺旋體屬)(3.96%～9.51%)、Clostridium sensu stricto13(狹義梭菌屬13)(5.38%～8.79%)、Geobacter(地桿菌屬)(2.62%～8.76%)、Proteiniphilum(嗜蛋白菌屬)(3.36%～11.28%)、Desulfovibrio(脫硫弧菌屬)(4.53%～6.72%)、Desulfitobacterium(脫硫桿菌屬)(0.24%～6.71%)、Desulfurella(硫還原菌屬)(1.34%～7.49%)等。Paraclostridium在一些淀粉、纖維質(zhì)、幾丁質(zhì)等的解聚、混合酸、醇和中性物質(zhì)的生成中起著重要作用[35]，添加少量高嶺土(0.5% 和1.0%) 可以提高該屬微生物豐度，結(jié)合VFAs 數(shù)據(jù)來看，它們之間沒有明顯的關(guān)聯(lián)，梭菌屬在該體系中參與生成的可能是其他有機(jī)化合物。Geobacter(地桿菌屬)是在厭氧環(huán)境中以膜結(jié)合蛋白和導(dǎo)電Ⅳ型菌毛來進(jìn)行直接胞外電子傳遞的代表性微生物[36]，從結(jié)果來看，添加高嶺土的實(shí)驗(yàn)組中該菌屬豐度大部分高于對(duì)照組，尤其是在1.0%和4.0%添加組中豐度最高。由于高嶺土本身不導(dǎo)電，所以推測(cè)其豐度變化與煤中少量的半導(dǎo)體礦物含量變化有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。Clostridium是厭氧芽孢桿菌屬，在惡劣環(huán)境下能產(chǎn)芽孢，代謝有機(jī)物產(chǎn)生小分子酸或醇等，屬于產(chǎn)酸菌[37]，該菌屬在所有添加高嶺土的實(shí)驗(yàn)組中豐度較為接近，說明這類細(xì)菌豐度受高嶺土影響不大。

整體上來看，盡管高嶺土添加對(duì)細(xì)菌種群豐度影響變化不明顯，但是某些門和屬的微生物在產(chǎn)氣第50天后其豐度發(fā)生了變化，并且不同種屬豐度變化呈現(xiàn)明顯差異性，這也進(jìn)一步證實(shí)了高嶺土對(duì)不同微生物的影響不同，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

3) 古菌群落組成

7 組樣品中測(cè)序得到的古菌共有117 個(gè)OTU，可以分為6 個(gè)門、19 個(gè)屬。圖6 為高嶺土實(shí)驗(yàn)組古菌在門水平和屬水平的群落分布?？梢钥闯?，在門水平(圖6a)，Euryarchaeota(廣古菌門)占比最大(57.89%～91.55%)，其次分別是Halobacterota(海拉古菌門)(3.29%～31.75%)、Thermoplasmatota(熱原體門)(3.36%～11.61%) 以及Crenarchaeota(泉古菌門)(0～1.65%)。整體上來看，其菌門豐度變化趨勢(shì)也可分為0～1.0%和2.0%～8.0%2 個(gè)區(qū)間，在2 個(gè)區(qū)間內(nèi)Euryarchaeota 呈先升后降趨勢(shì)，添加高嶺土量為0.5%和4.0%時(shí)Euryarchaeota 豐度最高，對(duì)應(yīng)的累積產(chǎn)甲烷量和F420含量也高于對(duì)照組，說明在這兩種添加量的體系中，細(xì)菌和古菌具有較好的協(xié)同性，能促進(jìn)甲烷生成。而Halobacterota 在高嶺土添加量為1.0%時(shí)豐度雖然最高，但該體系中甲烷產(chǎn)量和F420量在所有實(shí)驗(yàn)組中最低，可見該菌門在體系中貢獻(xiàn)不大。

圖6 添加高嶺土實(shí)驗(yàn)組古菌的群落結(jié)構(gòu)Fig.6 Archaeal community histogram of the kaolin test group at the phylum level and the genus level

從屬水平上(圖6b)，廣古菌門Methanosarcina(甲烷八疊球菌屬)數(shù)量占比最為豐富(56.46%～91.06%)，其余依次為廣古菌門Methanobacterium(甲烷桿菌屬)(3.29%～31.75%)、Methanomassiliicoccus(第七產(chǎn)甲烷古菌目)(3.33%～11.61%)、廣古菌門的Methanoregula(甲烷微菌屬)(0.19%～2.47%) 及Nitrosarchaeum(0～1.37%) 等。添加0～1.0%和2.0%～8.0%高嶺土實(shí)驗(yàn)組，古菌Euryarchaeota 和Methanosarcina豐度變化趨勢(shì)和F420含量變化一致，但和VFAs 變化趨勢(shì)正好相反，其中0.5%和4.0%添加量時(shí)的菌豐度和F420含量均為最高，而乙酸和VFAs 含量卻最低。從屬水平上來看，Methanobacterium變化趨勢(shì)與Methanosarcina正好相反，隨著高嶺土添加量的增加呈先降后升趨勢(shì)，其中0.5%和4.0%時(shí)其相對(duì)含量最低。Methanosarcina和Methanobacterium是較常見的產(chǎn)甲烷菌，其中Methanosarcina是混合營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，既可以利用氫氣產(chǎn)甲烷，也可以利用乙酸產(chǎn)甲烷，Methanobacterium為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌，可利用H2/CO2產(chǎn)生甲烷。

有研究表明石灰石能夠顯著提高細(xì)菌數(shù)量，利于微生物的降解作用[38]，本實(shí)驗(yàn)的微生物多樣性結(jié)果也表明，添加適量高嶺土能提高細(xì)菌和古菌的豐度；從群落結(jié)構(gòu)上也可以發(fā)現(xiàn)，高嶺土的添加增加了對(duì)產(chǎn)甲烷起作用的微生物豐度。有理由推測(cè)是高嶺土對(duì)煤降解過程中微生物的活性和豐度產(chǎn)生促進(jìn)作用，由VFAs結(jié)果可以分析，高嶺土影響了產(chǎn)酸微生物的活性，從而影響甲烷的生成。結(jié)合乙酸、VFAs 和F420變化趨勢(shì)來看，兩者在消耗體系中酸與氫氣產(chǎn)甲烷時(shí)相互抑制。0.5%和4.0%添加量將有利于提高M(jìn)ethanosarcina活性，提升甲烷含量。

3 結(jié) 論

a.高嶺土添加量為0～8.0%體系可以明顯分為2個(gè)區(qū)間，在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加量(0～1.0%)和相對(duì)較高添加量(2.0%～8.0%) 區(qū)間內(nèi)，甲烷產(chǎn)量、累積甲烷量和F420均呈先增后減的變化趨勢(shì)；0.5%和4.0%添加量時(shí)相應(yīng)值均最高，而在添加量范圍內(nèi)，乙酸、VFAs 的變化趨勢(shì)正好相反，呈先減后增趨勢(shì)。高嶺土添加量較低時(shí)(0～1.0%)反應(yīng)第50 天后累積產(chǎn)甲烷量和F420最高分別達(dá)216 μmol/g 煤和48.93 ng/L，較空白組提高55.4%和15.43%。高嶺土添加有利于煤中醇和酚-OH，-NH-和-NH2被微生物利用，當(dāng)高嶺土添加量為2.0%時(shí)煤中C＝O 更易被微生物利用。

b.高嶺土添加對(duì)細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)影響不明顯，而對(duì)古菌影響呈現(xiàn)規(guī)律性變化。在低質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加量(0～1.0%) 和相對(duì)較高添加量(2.0%～8.0%) 區(qū)間內(nèi)Firmicutes、Euryarchaeota 和Methanosarcina和產(chǎn)甲烷量、F420變化趨勢(shì)一致，而Methanobacterium和乙酸和VFAs 變化一致。這說明Firmicutes 和Euryarchaeota 在體系中具有較好的協(xié)同性，能促進(jìn)甲烷生成，而Methanosarcina和Methanobacterium在產(chǎn)甲烷時(shí)存在相互抑制作用。

c.煤的生物產(chǎn)氣體系中微生物種類眾多，代謝過程復(fù)雜，高嶺土是煤中分布較多的代表性礦物，礦物的添加會(huì)影響生物產(chǎn)氣過程。由于本研究中沒有對(duì)整個(gè)產(chǎn)氣過程中相應(yīng)參數(shù)進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)控，且所用微生物為混合菌群，而高嶺土對(duì)不同微生物生長(zhǎng)代謝的影響存在差異，所以目前的結(jié)果還難深入闡明其對(duì)不同微生物的具體影響機(jī)理。但本研究成果對(duì)后階段開展煤中無機(jī)礦物組分對(duì)生物產(chǎn)氣的影響提供了新的思路和參考依據(jù)。