武建毅 姚曉祥 朱紀(jì)華 朱麟玉 丁昭珩 黃曉東

惡 性 胸 腔 積 液（malignant pleural effusion，MPE）是晚期肺癌最常見的并發(fā)癥之一。目前肺癌合并癌性胸腔積液的治療以胸腔灌注化療為主，但臨床有效率低，相關(guān)副反應(yīng)多[1]。目前對(duì)惡性胸腔積液的基礎(chǔ)研究表明，多種細(xì)胞因子參與其中，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在癌性胸腔積液中作用明顯，它可以改善腫瘤微血管及微淋巴管的通透性，參與胸腔積液形成，抑制VEGF表達(dá)可以抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和胸腔積液形成[2]。另外，水通道蛋白（aquaporins，AQPs）是存在于細(xì)胞膜表面的一類家族蛋白，主要控制水分子等跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。其中水通道蛋白-1（AQPs-1）研究較為深入，文獻(xiàn)[3]報(bào)道其與惡性胸腔積液的發(fā)生關(guān)系密切。黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AsⅣ）是黃芪中的一種主要成分，現(xiàn)代研究表明它具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，阻止腫瘤新生血管生成、阻止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的活性，可以作為治療癌性胸腔積液的有效藥物深入研究[4]。本課題設(shè)計(jì)建立小鼠肺癌合并胸腔積液模型，通過胸腔穿刺灌注治療的方式考察不同濃度的AsⅣ對(duì)Lewis肺癌小鼠惡性胸腔積液的治療效果及抗腫瘤活性，進(jìn)一步明確其機(jī)制，AsⅣ是否對(duì)腫瘤新生血管、水通道蛋白有抑制作用，為肺癌胸腔積液的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

4周齡BALB/C 小鼠 100只，體重 18～22 g，購于中國科學(xué)院細(xì)胞研究所。細(xì)胞株：小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株，購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。藥物與試劑：AsⅣ分子式為C14H68O14，購自成都普瑞法公司。順鉑DDP購自默克公司。細(xì)胞培養(yǎng)血清購于上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，VEGF ELASIA檢測(cè)試劑盒購于上海澤葉生物科技有限公司。小鼠的VEGF、AQP-1、二抗購買于abnova公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞培養(yǎng) 把小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株復(fù)蘇，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色后，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，細(xì)胞活力95%。

1.2.2 小鼠Lewis肺癌惡性胸腔積液動(dòng)物模型建立 用無血清培養(yǎng)基將Lewis肺癌細(xì)胞稀釋后接種于BALB/C小鼠胸腔，第10天處死小鼠并收集胸腔積液，離心取細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度（1.0×106/ml）。取該懸液0.2 ml/只，給100只小鼠胸腔內(nèi)均接種腫瘤，建立小鼠肺癌惡性胸腔積液動(dòng)物模型。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠分組及給藥方法 將100只小鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為五組，每組20只。A組：陰性對(duì)照，注射0.9%生理鹽水（NS）20 ml；B組：陽性對(duì)照組，注射順鉑（DDP）0.5 mg/kg；C組：低劑量黃芪甲苷（l-AsⅣ）0.3 mg/kg；D組：中劑量的黃芪甲苷（m-AsⅣ）1.0 mg/kg；E組：高劑量黃芪甲苷（h-AsⅣ）3.0 mg/kg。接瘤 24 h 后采用胸腔穿刺注射藥物的給藥方式，按照體重給藥，1次/d，連續(xù)給藥 14 d。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

（1）治療效果：比較五組治療效果，包括抑瘤率及細(xì)胞存活率、胸腔積液量、瘤細(xì)胞數(shù)、最大結(jié)節(jié)直徑，用藥結(jié)束24 h后各組半數(shù)小鼠處死，抽取小鼠胸腔積液，記錄胸腔積液量，胸腔積液經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，顯微鏡下計(jì)算瘤細(xì)胞數(shù)、瘤細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=未染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。解剖死亡小鼠，觀察胸腔內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移情況，測(cè)量胸膜轉(zhuǎn)移瘤最大結(jié)節(jié)直徑，測(cè)定抑瘤率，抑瘤率=[A組胸膜轉(zhuǎn)移瘤平均體積-實(shí)驗(yàn)組（B、C、D、E組）胸膜轉(zhuǎn)移瘤平均體積]/A組平均體積×100%。（2）VEGF含量：比較五組VEGF含量，末次給藥24 h后，收集小鼠胸腔積液0.4 ml，離心取上清，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，計(jì)算出每份標(biāo)本中VEGF的濃度。（3）VEGF、AQP-1的表達(dá)水平：比較五組VEGF、AQP-1的表達(dá)水平，對(duì)胸膜轉(zhuǎn)移瘤組織內(nèi)VEGF、AQP-1的表達(dá)水平進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，對(duì)處死小鼠的胸腔進(jìn)行解剖，分離胸膜轉(zhuǎn)移腫瘤的組織，制作石蠟切片，用5%BSA 液封閉，加入一抗：VEGF（1∶100）、AQP-1（1∶100），4 ℃孵育過夜，用PBS漂洗后加入二抗，室溫下孵育30 min，漂洗后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水并透明后封片。用Image-Pro Plus 7.0軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算陽性面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 五組治療效果比較

B、D、E組胸腔積液量均少于A組（P＜0.01），瘤細(xì)胞存活率和瘤細(xì)胞數(shù)均低于A組（P＜0.01），胸膜轉(zhuǎn)移瘤最大結(jié)節(jié)直徑均小于A組（P＜0.01），上述指標(biāo)都存在劑量依賴性。E組胸腔積液量、瘤細(xì)胞存活率、最大結(jié)節(jié)直徑均低于B組，抑瘤率高于B組（P＜0.05），見表1。

表1 五組治療效果比較（±s）

表1 五組治療效果比較（±s）

*與A組比較，P＜0.01；#與B組比較，P＜0.05；△與A組比較，P＜0.05。

組別 胸腔積液量（ml） 瘤細(xì)胞數(shù)（×106/ml） 瘤細(xì)胞存活率（%） 最大結(jié)節(jié)直徑（cm） 抑瘤率（%）A 組（n=10） 8.21±1.15 13.62±5.72 90.20±1.01 0.68±0.02 B組（n=10） 2.83±0.43* 6.92±2.57* 53.42±2.21* 0.32±0.01* 75.43±3.29 C 組（n=10） 5.31±0.65△ 8.15±3.12△ 71.27±1.15△ 0.52±0.02△ 49.27±2.78 D組（n=10） 3.24±0.42* 6.13±2.21* 56.45±0.97* 0.45±0.01* 66.72±3.13 E 組（n=10） 1.88±0.34*# 5.49±1.78* 45.68±0.21*# 0.25±0.02*# 81.25±0.98#

2.2 五組VEGF含量比較

B、C、D、E組 VEGF含量均低于A組（P＜0.01），且存在劑量依賴性，見表2。

表2 五組VEGF含量比較[ng/L，（±s）]

表2 五組VEGF含量比較[ng/L，（±s）]

*與A組比較，P＜0.01。

組別 VEGF A組（n=10） 188.72±2.13 B 組（n=10） 105.42±13.77*C 組（n=10） 140.89±16.10*D 組（n=10） 107.22±12.51*E 組（n=10） 88.95±12.42*

2.3 五組Lewis肺癌小鼠胸膜轉(zhuǎn)移瘤組織VEGF、AQP-1表達(dá)

B、C、D、E組 VEGF表達(dá) 均 低 于 A組（P＜0.01）；C、D、E組AQP-1蛋白表達(dá)均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05、＜0.05、＜0.01），見圖1、圖2、表3。

圖1 五組Lewis肺癌小鼠胸膜轉(zhuǎn)移瘤組織VEGF蛋白表達(dá)（×200）

圖2 五組Lewis肺癌小鼠胸膜轉(zhuǎn)移瘤組織AQP-1蛋白表達(dá)（×200）

表3 五組Lewis肺癌小鼠胸膜轉(zhuǎn)移瘤組織VEGF、AQP-1表達(dá)水平比較（±s）

表3 五組Lewis肺癌小鼠胸膜轉(zhuǎn)移瘤組織VEGF、AQP-1表達(dá)水平比較（±s）

*與A組比較，P＜0.01，#與A組比較，P＜0.05。

組別 VEGF AQP-1 A 組（n=10） 729.47±25.22 725.55±35.02 B 組（n=10） 524.71±24.15* 720.42±50.08 C組（n=10） 673.22±35.75* 657.12±65.82#D組（n=10） 558.22±38.33* 625.11±52.72#E組（n=10） 520.35±52.12* 617.52±33.20*

3 討論

胸腔積液為晚期肺癌常見并發(fā)癥，此時(shí)癌細(xì)胞侵犯胸膜，胸腔積液中找到腫瘤細(xì)胞。肺癌合并惡性胸腔積液表明疾病已經(jīng)進(jìn)展，患者生活質(zhì)量不佳，預(yù)后較差，平均生存期小于6個(gè)月。肺癌合并惡性胸腔積液時(shí)治療困難，目前以胸腔灌注治療為主，但灌注的藥物效果不理想[5]。尋找有效的胸腔灌注藥物是治療肺癌合并惡性胸腔積液急需解決的難題。AsⅣ是黃芪中的一種主要成分，現(xiàn)代研究表明它具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，阻止腫瘤新生血管生成、阻止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的活性，可以作為治療惡性胸腔積液的有效藥物深入研究[6-8]。本文的研究中發(fā)現(xiàn)胸腔灌注AsⅣ可以使小鼠的惡性胸腔積液明顯減少，B、D、E組胸腔積液量均少于A組（P＜0.01）；惡性胸腔積液中瘤細(xì)胞存活率和瘤細(xì)胞數(shù)均低于A組（P＜0.01），胸膜轉(zhuǎn)移瘤最大結(jié)節(jié)直徑均小于A組（P＜0.01）。E組胸腔積液量、瘤細(xì)胞存活率、最大結(jié)節(jié)直徑均低于B組，抑瘤率高于B組（P＜0.05），表明胸腔注射AsⅣ可以抑制惡性胸腔積液中瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，從而使胸膜轉(zhuǎn)移瘤明顯縮小，這些作用AsⅣ藥物的濃度存在劑量依賴性。表明AsⅣ可以有效抑制瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而減少惡性胸腔積液的生成。

近年來對(duì)惡性胸腔積液發(fā)生機(jī)制的基礎(chǔ)研究表明細(xì)胞因子在惡性胸腔積液的發(fā)生中的起到非常重要的作用。目前研究與惡性胸腹腔積液發(fā)生關(guān)系密切的細(xì)胞因子包括：VEGF和AQPs[9]。VEGF是改善血管、淋巴管通透性重要的細(xì)胞因子。研究表明，惡性胸腔積液的發(fā)生依賴于VEGF水平，抑制VEGF可以抑制癌性胸腔積液的形成，提示VEGF在癌性胸腔積液的發(fā)生中舉足輕重。VEGF促進(jìn)癌性胸腔積液形成的主要機(jī)制就是通過增加胸膜毛細(xì)血管形成，并使毛細(xì)血管通透性增加，導(dǎo)致胸腔積液形成[10]。AsⅣ具有抗腫瘤血管生成的作用，細(xì)胞水平的研究證實(shí)：AsⅣ可以通過抑制肝癌細(xì)胞株VEGF基因的表達(dá)，從而使癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的明顯下降[11]。本文的研究中發(fā)現(xiàn)B、C、D、E組VEGF含量均低于A組（P＜0.01），且存在劑量依賴性，說明胸腔灌注AsⅣ后可以使胸腔積液中的VEGF含量明顯下降，同時(shí)胸膜轉(zhuǎn)移瘤的免疫組化結(jié)論為B、C、D、E組VEGF表達(dá)均低于A組（P＜0.01），AsⅣ可以抑制轉(zhuǎn)移瘤組織內(nèi)VEGF表達(dá)。這可能是AsⅣ抑制Lewis肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，減少癌性胸腔積液生成的重要機(jī)制之一。

AQPs-1是細(xì)胞膜表面控制水分子通過的通道蛋白，它與惡性腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和癌性積液的形成關(guān)系密切[12]。惡性胸腔積液小鼠模型中的研究表明：當(dāng)惡性胸腔積液體積不斷增加時(shí)，肺癌小鼠胸膜組織中AQPs-1基因的表達(dá)也不斷增加，二者呈正相關(guān)。高度提示肺癌合并惡性胸腔積液與AQPs-1關(guān)系密切，抑制AQPs-1的表達(dá)，可以有效減少惡性胸腔積液[9]。本文中發(fā)現(xiàn)C、D、E組AQP-1蛋白表達(dá)均低于A組（P＜0.05、＜0.05、＜0.01），說明胸腔灌注AsⅣ后可以抑制轉(zhuǎn)移瘤組織內(nèi)AQPs-1表達(dá)。這可能是黃芪甲甙抑制Lewis肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，減少癌性胸腔積液生成的另一個(gè)重要機(jī)制之一。

本研究以肺癌惡性胸腔積液為動(dòng)物模型，考察胸腔內(nèi)注射AsⅣ對(duì)小鼠肺癌合并惡性胸腔積液的治療效果。結(jié)果表明AsⅣ胸腔注射后，Lewis肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)得到抑制，惡性胸腔積液的生成減少。這種作用與AsⅣ抑制腫瘤細(xì)胞VEGF和AQPs-1的表達(dá)有關(guān)。本研究為肺癌合并惡性胸腔積液的治療提供了重要的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為惡性胸腔積液發(fā)生機(jī)制的研究和治療給予啟示。