曾小波，王婷婷，李學(xué)偉，朱新貴

（李錦記（新會(huì)）食品有限公司，廣東 江門 529156）

大曲是中國傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)過程中重要的發(fā)酵劑，通常以小麥為主，復(fù)合一些其他谷物原料通過生料發(fā)酵得到。大曲是白酒釀造過程中重要的微生物、酶類、香氣物質(zhì)和香氣物質(zhì)前體物質(zhì)的主要來源，密切影響著白酒的品質(zhì)和風(fēng)味[1]。大曲中含有豐富的微生物和酶，這些物質(zhì)促進(jìn)酒香風(fēng)味物質(zhì)的形成[2-3]。

大曲的制備過程一般分為選配原料、潤水破碎、壓制成型、自然發(fā)酵、貯存后熟這五個(gè)階段[4]，其中原料種類、制曲條件和發(fā)酵工藝影響著成品大曲的質(zhì)量。發(fā)酵溫度決定大曲的類型，根據(jù)發(fā)酵頂溫的不同，大曲可分成高溫大曲（60～70 ℃）、中溫大曲（50～60 ℃）和低溫大曲（40～50 ℃）[5]。不同的頂溫控制策略使得大曲的理化指標(biāo)、風(fēng)味物質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)各不相同[6-7]。高溫大曲與中溫大曲相比，細(xì)菌、芽孢菌、霉菌在數(shù)量上要比中溫大曲多得多，但中溫大曲的酵母菌要比高溫大曲多得多，在淀粉酶活力上，中溫大曲比高溫大曲高得多[8-10]。

在醬油發(fā)酵過程中，細(xì)菌主要產(chǎn)酸類物質(zhì)，酵母菌則是形成醬油關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)醇類、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙基苯酚等的關(guān)鍵微生物[11-12]。在廣式高鹽稀態(tài)醬油工藝中，發(fā)酵時(shí)不添加酵母，制曲時(shí)接種純種米曲霉，培養(yǎng)過程中空氣中的其他微生物落入曲料中，也會(huì)進(jìn)行繁殖。但曲料中的絕對(duì)優(yōu)勢菌群是米曲霉（Aspergillus oryzae），這可能造成在醬醪發(fā)酵階段微生物群落，特別是酵母菌菌群不夠豐富，因此采用添加中溫大曲進(jìn)行醬油制曲及發(fā)酵，以提高醬油曲料及醬醪中的微生物特別是酵母菌群豐度，從而有利于醬油關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的形成，提高醬油品質(zhì)。

本研究采用廣式高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵工藝，在醬油制曲及醬醪發(fā)酵階段，添加不同比例的中溫大曲，同時(shí)與正常醬油（不添加大曲發(fā)酵）對(duì)比，通過感官評(píng)價(jià)、理化指標(biāo)檢測、揮發(fā)性成分測定，對(duì)發(fā)酵醬油進(jìn)行評(píng)價(jià)分析；同時(shí)采用擴(kuò)增子測序（16S和ITS），分析添加大曲對(duì)醬油成曲和醬醪中的微生物菌群的影響，為提高醬油品質(zhì)的生產(chǎn)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆、面粉、食鹽、種曲：由李錦記（新會(huì)）食品有限公司；中溫大曲（小麥曲）：容城縣天意酒曲廠；氫氧化鈉、甲醛、鹽酸、葡萄糖、重鉻酸鉀（均為分析純）：中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上海化學(xué)試劑公司；酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）、三氯乙酸（分析純）：廣州化學(xué)分析試劑有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）相關(guān)試劑：日本TOYOBO公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）凝膠提取試劑盒：美國Axygen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1100紫外可見光分光光度計(jì)：北京萊伯泰科儀器有限公司；MA35水分測定儀：德國賽多利斯集團(tuán)；PAL-α糖度汁計(jì)：日本ATAGO公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州普天儀器制造有限公司；794全自動(dòng)滴定儀：瑞士萬通（中國）有限公司；HP-INNOWAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：上海笛柏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；7820-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、DB-wax毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國安捷倫科技有限公司；FIVEEASY pH計(jì)：瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；SKD-800自動(dòng)凱氏定氮儀：上海沛歐儀器有限公司；ETC811 PCR儀：蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；NanoDrop 2000微量分光光度計(jì)：賽默飛世爾科技公司；DYY-6C瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一儀器廠；Tanon-2500凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醬油成曲、醬油醬醪及醬油的制備

醬油成曲制備：按照制曲方案準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量黃豆、面粉、大曲粉（大曲粉碎后過10目篩）、種曲。黃豆浸泡蒸煮按照相同工藝處理，黃豆浸泡（按照料液比1∶5（g∶mL），在30 ℃下浸泡2 h）至水分52%，在0.1 MPa壓力下，蒸煮8 min。冷卻至38 ℃后，同面粉、種曲、大曲粉混合均勻，送入曲房培養(yǎng)。制曲操作按相同工藝操作，曲料培養(yǎng)48 h。

表1 醬油成曲制備Table 1 Preparation of soy sauce koji

醬油醬醪制備：按照發(fā)酵方案將相應(yīng)數(shù)量醬油成曲、大曲粉（大曲粉碎后過10目篩）、鹽水（17°Be）送入發(fā)酵罐中，采用用廣式高鹽稀態(tài)釀造醬油工藝，定期進(jìn)行循環(huán)澆淋，發(fā)酵時(shí)間為90 d。

表2 醬油醬醪制備Table 2 Preparation of soy sauce mash

醬油制備：將發(fā)酵完成的醬醪，攪拌均勻后單獨(dú)壓榨，獲得各醬油樣品。

1.3.2 樣品取樣及處理

醬油成曲樣品，在曲料培養(yǎng)完成后，各制曲方案曲料各均勻取8個(gè)樣，在無菌條件下混合均勻后，分為兩份，一份用于酶活力檢測，一份用凍干管裝好，再用液氮快速冷凍后，于-80 ℃冰箱保存。

醬醪在發(fā)酵至30 d、60 d、90 d時(shí)，分別在發(fā)酵缸中取醬醪樣品，取樣前先進(jìn)行循環(huán)澆淋30 min，在發(fā)酵缸中取3個(gè)點(diǎn)的醬醪樣品，混合后于無菌條件下，用凍干管裝好，液氮快速冷凍后，于-80 ℃冰箱保存。所有樣品準(zhǔn)備好后，寄送廣州基迪奧生物科技有限公司測序公司進(jìn)行16S及ITS擴(kuò)增子測序。

分別取各醬油樣品用于常規(guī)理化指標(biāo)、揮發(fā)性成分測定、感官品評(píng)。

1.3.3 分析檢測

（1）醬油成曲指標(biāo)測定

成曲水分：采用水分測定儀直接測定；蛋白酶活力（U/g干曲）：參考SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》[13]中的福林法進(jìn)行測定。蛋白酶酶活定義：在40 ℃、pH7.2條件下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為一個(gè)蛋白酶活力單位（U/g）；淀粉酶酶活力（U/g干曲）：參考QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[14]測定。淀粉酶酶活定義：在40 ℃條件下每分鐘水解淀粉產(chǎn)生1 mg麥芽糖，定義為一個(gè)淀粉酶活力單位（U/g）。

（2）醬油常規(guī)指標(biāo)測定

氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）、總氮、總酸、氯化鈉、pH值：按照GB 18186—2000《釀造醬油》[15]；色度：波長530 nm條件下的吸光度值（A530nm值）（稀釋10倍）；還原糖：按照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》[16]；可溶性固形物：采用糖度計(jì)測定；鹽度：采用波美計(jì)測定。

（3）醬油感官評(píng)價(jià)

由10位醬油專業(yè)人員按GB 18186—2000《釀造醬油》的感官評(píng)價(jià)方法進(jìn)行評(píng)定[15]，滿分10分，去掉最高和最低分后，取平均值。

（4）醬油中揮發(fā)性成分測定

固相微萃?。合确Q取1 g氯化鈉于5 mL頂空樣品瓶中，再取2 mL樣品密封于頂空樣品瓶，搖勻后，置于40 ℃水浴中，固相微萃取纖維頂空萃取30 min，250 ℃解吸5 min后進(jìn)樣。氣相色譜條件：DB-wax毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣高純氦氣（He），流速1.0 mL/min；程序升溫，起始溫度40 ℃保持5 min，升溫速率2 ℃/min，溫度至150 ℃，保持0 min，升溫速度5 ℃/min，最終溫度240 ℃，保持0 min；汽化室溫度250 ℃。質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，電子倍增器電壓857 V，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍20～350 amu。

定性定量方法：醬油揮發(fā)性風(fēng)味成分檢測數(shù)據(jù)處理由安捷倫Data Analysis軟件完成，在美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）17譜庫對(duì)未知化合物進(jìn)行檢索并計(jì)算匹配度，只有當(dāng)正反匹配度均＞80%時(shí)才能確證該物質(zhì)。采用面積歸一法定量。

1.3.4 醬油成曲及醬醪中微生物擴(kuò)增子（16S+ITS）測序

DNA提取及PCR擴(kuò)增：微生物DNA的提取使用HiPure Soil DNA提取試劑盒，按照操作指南進(jìn)行。16S rRNA基因的V3-V4區(qū)PCR擴(kuò)增條件：94℃、2min，然后98℃、10s，62℃、30 s（16S V4區(qū)時(shí)，為55 ℃、30 s），68 ℃、30 s進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后68 ℃、5 min使用引物341F：CCTACGGGNGGCWGCAG；806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT[17]。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：包含5 μL 10×反應(yīng)緩沖液，5 μL 2 mmol/L 脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphates，dNTPs），3 μL 25 mmol/L MgSO4，1.5 μL上下游引物（10 μmol/L），1 μL DNA聚合酶，100 ng模板DNA。ITS使用引物ITS3_KYO2：GATGAAGAACGYAGYRAA；ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。

Illumina Novaseq 6000測序：從2%瓊脂糖凝膠中搜集擴(kuò)增子，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒，按照制造商的說明進(jìn)行純化，并使用PCR系統(tǒng)進(jìn)行定量。純化后的擴(kuò)增子根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)操作在Illumina 平臺(tái)上進(jìn)行雙端測序（PE250）。原始讀數(shù)據(jù)上傳在美國國家生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）數(shù)據(jù)庫。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)：用FASTP（版本0.18.0）[17]對(duì)Illumina平臺(tái)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾。過濾后獲得的clean reads用于組裝分析。使用FLASH[18]（版本1.2.11）將clean reads按最小重疊為10 bp，錯(cuò)配率最高2%的閾值合并為tag。依據(jù)文獻(xiàn)的過濾條件[19]，對(duì)低質(zhì)量tag進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的clean tag。參照CAPORASO J G等[20]的Tags質(zhì)量控制流程，進(jìn)行如下操作：①Tags截?。簩aw Tags從連續(xù)低質(zhì)量值（默認(rèn)質(zhì)量閾值為≤3）堿基數(shù)達(dá)到設(shè)定長度（默認(rèn)長度值為3）的第一個(gè)低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截?cái)?；②Tags長度過濾：經(jīng)過截取后得到的Tags數(shù)據(jù)集，進(jìn)一步過濾其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75%的Tags。聚類去嵌合體：使用UPARSE[21]（版本9.2.64）流程將clean tag按＞97%相似度聚類為操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）。使用UCHIME算法[22]進(jìn)行Tag的嵌合體檢查（對(duì)于16S測序分析）。過濾嵌合體后得到的Effective tag進(jìn)行OTU豐度統(tǒng)計(jì)和其他后續(xù)分析。選取豐度最高的Tag序列作為每個(gè)OTU的代表序列。OTU代表序列或擴(kuò)增序列變體（amplified sequence variant，ASV）序列比對(duì)SILVA[23]數(shù)據(jù)庫（版本132）或UNITE[24]數(shù)據(jù)庫（版本8.0）或ITS2[25]數(shù)據(jù)庫（版本update_2015）使用核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）2.2注釋軟件[26]的樸素貝葉斯模型進(jìn)行物種分類注釋，置信閾值設(shè)為0.8～1.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 醬油成曲理化指標(biāo)

醬油成曲理化指標(biāo)檢測結(jié)果見表3。由表3可知，蛋白酶活力最高的為對(duì)照樣成曲，淀粉酶活力最高的為添加大曲2.75%的成曲Koji-2，蛋白酶活力和淀粉酶活力最低的為Koji-4，這可能與面粉用量有關(guān)，為了保證最終發(fā)酵體系中碳氮比和料液比基本相同，制曲時(shí)相應(yīng)減少了面粉的用量（所用大曲為小麥曲，其成分和面粉大致相同），增加了鹽水用量。

表3 醬油成曲理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical indexes of soy sauce koji

制曲時(shí)面粉用量減少的越多，其成曲蛋白酶活力有降低趨勢，這是因?yàn)槊娣塾昧繙p少，會(huì)影響米曲霉的生長、蛋白酶的分泌及孢子的產(chǎn)生。曲料的淀粉酶活力一部分來源于大曲本身，一部分也來源于米曲霉分泌，米曲霉生長不好，影響成曲中的淀粉酶活力。

2.2 添加大曲發(fā)酵對(duì)醬油理化指標(biāo)影響

發(fā)酵醬油理化指標(biāo)檢測結(jié)果見表4。由表4可知，大曲添加量為2.75%的醬油DQSS1氨基酸態(tài)氮含量最高（0.871 g/100 mL），三種添加大曲醬油氨基酸態(tài)氮分別比對(duì)照樣高5.19%，3.62%，2.42%；還原糖含量分別比對(duì)照高35.65%，46.22%，37.16%。添加大曲發(fā)酵的醬油總酸，可溶性固形物也比對(duì)照樣高，pH比對(duì)照樣低，其他指標(biāo)差異不明顯。3種添加大曲的醬油，氨基酸態(tài)氮比未添加大曲的對(duì)照樣高，而全氮差異不明顯，表明添加大曲發(fā)酵有利于提高醬油中的氨基酸態(tài)氮生成率，即有利于氨基酸和小分子多肽的生成。大曲中的淀粉酶有利于還原糖的生成。

2.3 添加大曲發(fā)酵對(duì)醬油感官評(píng)價(jià)影響

發(fā)酵醬油感官評(píng)價(jià)結(jié)果見表5。

表5 發(fā)酵醬油感官評(píng)分結(jié)果Table 5 Results of sensory score of fermented soy sauce

由表5可知，DQSS1發(fā)酵醬油整體評(píng)價(jià)得分最高，達(dá)到8.06分，比對(duì)照樣高。評(píng)價(jià)最低得分的為DQSS3，可能與其總酸較高有關(guān)，滋味偏酸。說明大曲添加量較高后對(duì)醬油的品質(zhì)有負(fù)面影響。DQSS2和DZSS整體評(píng)價(jià)得分差異不大，但其香氣評(píng)分高于對(duì)照樣，滋味評(píng)分低于對(duì)照樣。

2.4 添加大曲發(fā)酵對(duì)醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

采用GC-MS對(duì)醬油進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分分析，各樣品總離子流色譜圖見圖1，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定結(jié)果見表6。

圖1 醬油樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile substances in soy sauce samples analyzed by GC-MS

表6 醬油樣品中揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS分析測定結(jié)果Table 6 Determination results of volatile substances in soy sauce samples analyzed by GC-MS

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

由表6可知，4種醬油樣品中共檢出90種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類28種，酯類18種、醛類13種、酸類14種、酚類6種、其他類11種。DZSS樣品中檢測出63種物揮發(fā)性風(fēng)味質(zhì)，其中醇類22種、酯類12種、醛類7種、酸類8種、酚類6種、其他類8種，其相對(duì)含量分別為醇類78.04%、酯類6.81%、醛類8.79%、酸類3.46%、酚類1.85%、其他類1.05%。DQSS1樣品中檢測出70種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類22種、酯類14種、醛類12種、酸類11種、酚類5種、其他類6種，其相對(duì)含量分別為醇類69.09%、酯類16.9%、醛類8.76%、酸類3.90%、酚類1.02%、其他類0.33%。DQSS2樣品中檢測出68種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類24種、酯類13種、醛類9種、酸類10種、酚類6種、其他類7種，其相對(duì)含量分別為醇類68.15%、酯類19.1%、醛類7.90%、酸類3.71%、酚類0.87%、其他0.27%。DQSS3樣品中檢測出64種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類20種、酯類14種、醛類10種、酸類7種、酚類5種、其他類8種，其相對(duì)含量分別為醇類73.31%、酯類16.72%、醛類6.68%、酸類2.71%、酚類0.3%、其他0.29%。四種醬油樣品中檢出共有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有42種，各樣品中這42種物質(zhì)的總相對(duì)含量分別為97.48%；98.31%、98.71%，98.81%，說明這42種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為醬油中的主體風(fēng)味物質(zhì)。DZSS樣品中檢測出，而DQSS1、DQSS2、DQSS3樣品中沒有檢測出的有9種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，相對(duì)含量為1.39%；3個(gè)樣品同時(shí)中檢測出，而DZSS樣品中沒有檢測出的有12種，相對(duì)含量分別為0.88%，0.96%，0.87%。結(jié)合微生物的多樣性指數(shù)分析，微生物群落豐富度與揮發(fā)性物質(zhì)成分種類的多少有正相關(guān)性[27]。

2.5 添加大曲對(duì)醬油成曲及醬醪中微生物群落組成的影響

由圖2A可知，在屬水平上，成曲和醬醪中細(xì)菌群落組成差異較大。成曲中魏斯式菌屬（Weissella）為優(yōu)勢菌屬，添加大曲的成曲樣Koji-3和Koji-4中的魏斯式菌屬（Weissella）相對(duì)豐度（83.47%和62.46%）相比對(duì)照樣（38.99%）大幅提高。加入鹽水后，醬醪中四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）成為優(yōu)勢菌屬，直到發(fā)酵后期。同時(shí)存在的細(xì)菌菌屬有色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、擬桿菌屬（Bacteroides）、腸桿菌屬（Enterobacter）、泛菌屬（Pantoea）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）。

圖2 醬油成曲和醬醪中細(xì)菌（A）及真菌（B）群落在屬水平的分布Fig.2 Distribution of bacterial (A) and fungal (B) community at genus level in soy sauce koji and mash

有研究表明，嗜鹽四聯(lián)球菌、魏斯氏菌廣泛存在于發(fā)酵食品中，如泡菜、豆豉和醬油中，對(duì)食品有機(jī)酸、酯類和短鏈脂肪酸等風(fēng)味物質(zhì)的生成有著重要的意義[27-28]。添加大曲發(fā)酵的醬醪中四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）相對(duì)豐度高于對(duì)照樣醬醪中的相對(duì)豐度，這可能是導(dǎo)致添加大曲醬油的總酸高于對(duì)照樣醬油的原因之一。

由圖2B可知，在屬水平上，成曲中曲霉屬（Aspergillus）為絕對(duì)優(yōu)勢菌，在對(duì)照樣成曲（Koji-1）中相對(duì)豐度甚至達(dá)到95.88%；添加大曲的醬油成曲中曲霉屬（Aspergillus）的相對(duì)豐度降低，而未知微生物（Unclassified）相對(duì)豐度升高。這可能與制曲時(shí)面粉量減少，影響米曲霉生長有關(guān)。醬醪中曲霉屬（Aspergillus）依然保持較高相對(duì)豐度，特別是對(duì)照樣和Ssm-4樣品中。同時(shí)在發(fā)酵前中期，接合酵母屬（Zygosaccharomyces）成為所有醬醪中的另一個(gè)優(yōu)勢菌，已有大量研究顯示魯氏接合酵母是醬油發(fā)酵過程中的重要產(chǎn)香酵母，它將葡萄糖轉(zhuǎn)化成醇，同時(shí)產(chǎn)生呋喃酮、酯類等風(fēng)味物質(zhì)[12]。在添加大曲制曲的醬油成曲中，酵母的菌群相對(duì)豐度并未有提高，而在醬醪發(fā)酵時(shí)期，添加大曲的發(fā)酵醪（Ssm-2-a相對(duì)豐度32.01%，Ssm-2-b相對(duì)豐度38.10%）比對(duì)照樣醬醪中（Ssm-1-a相對(duì)含量18.57%，Ssm-1-b相對(duì)含量18.15%）的酵母相對(duì)豐度有明顯提升。結(jié)合醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測結(jié)果，添加大曲發(fā)酵的醬油樣品中，酯類物質(zhì)的相對(duì)含量由對(duì)照樣中6.81%提高到DQSS1中16.9%。

3 結(jié)論

大曲有豐富的微生物菌群，高溫大曲中的芽孢桿菌和細(xì)菌較豐富，而中溫大曲中的酵母菌霉菌較豐富，因此選擇添加中溫大曲來改善廣式醬油成曲和醬醪中的微生物菌群。結(jié)果表明，從細(xì)菌看，添加大曲的醬油成曲樣中魏斯式菌屬（Weissella）相對(duì)豐度比對(duì)照樣大幅提高；添加大曲發(fā)酵的醬醪中四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）相對(duì)豐度高于對(duì)照樣醬醪中的相對(duì)豐度，這可能是添加大曲醬油的總酸高于對(duì)照樣醬油的原因之一。從真菌看，添加大曲的醬油成曲中曲霉屬（Aspergillus）的相對(duì)豐度比對(duì)照樣低，而未知微生物（Unclassified）相對(duì)豐度升高。在添加大曲制曲的醬油成曲中，酵母菌群的相對(duì)豐度沒有提高；而在醬醪發(fā)酵時(shí)期，添加大曲的發(fā)酵醪中酵母菌群相對(duì)豐度比對(duì)照樣醬醪中的酵母菌群相對(duì)豐度有明顯提升。這可能是導(dǎo)致添加大曲醬油中酯類風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量升高的原因?？傮w上看，添加2.75%大曲的醬油發(fā)酵樣品最優(yōu)，其主要指標(biāo)氨基酸態(tài)氮含量最高，感官評(píng)價(jià)得分最高，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類最豐富。