嵇威，盛桂華，陳炫宏，董雷超，南希駿，張軍，周泉城*

（1.山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院食品科學(xué)系，農(nóng)產(chǎn)品功能化技術(shù)山東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東淄博 255049）（2.淄博市城鄉(xiāng)規(guī)劃發(fā)展中心，山東淄博 255000）

抑郁癥是一種表現(xiàn)為長(zhǎng)期、持續(xù)的情緒消極，興趣缺乏的情感障礙[1]。隨著人們受到的壓力增大，抑郁癥的患病率也在持續(xù)攀升，據(jù)世衛(wèi)組織數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，預(yù)計(jì)至2030年，抑郁癥總病例數(shù)或?qū)⒊礁黝愋难芗膊〉幕颊邤?shù)量總和[2]。尚未有研究與理論可充分清晰的闡明抑郁癥的發(fā)病原理，目前被廣泛認(rèn)可的理論是單胺學(xué)說(shuō)[3]。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為由于神經(jīng)遞質(zhì)例如5-羥色胺與去甲腎上腺素等的水平降低而引起抑郁，據(jù)此研發(fā)提高兩者水平的抑郁調(diào)節(jié)藥物，但此類藥物僅僅有益于部分患者，并且患者可能出現(xiàn)耐藥性等反應(yīng)[4]。因此，通過(guò)食品中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)干預(yù)調(diào)節(jié)抑郁癥，并開(kāi)發(fā)高效、對(duì)人體無(wú)毒害與副作用的抑郁調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)體系成為了人們關(guān)注的重點(diǎn)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)許多食品例如桔梗[5]、黃花菜[6]、肉豆蔻[7]等具有緩解抑郁癥的功能。

人類腸道中微生物數(shù)量繁多、群落復(fù)雜且種屬豐富，影響著人們的健康[8]。有研究表明，許多疾病的產(chǎn)生都與腸道菌群失衡有關(guān)，其與抑郁癥之間通過(guò)“腦-腸-微生物”軸相互影響[9-11]。據(jù)研究證實(shí)，大腦海馬區(qū)域中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）在腸道菌群變化后也會(huì)發(fā)生一定程度上的改變[12]。BDNF可促進(jìn)腦細(xì)胞與神經(jīng)的生長(zhǎng)，當(dāng)BDNF的表達(dá)下調(diào)時(shí)引起神經(jīng)再生下降，從而導(dǎo)致抑郁相關(guān)癥狀；當(dāng)BDNF表達(dá)水平提高時(shí)，海馬神經(jīng)元的損傷得到恢復(fù)，可改善認(rèn)知和情緒[13]。研究表明乳酸菌與雙歧桿菌可通過(guò)改變腸道組成和腸道菌群多樣性、降低炎癥因子、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等機(jī)制緩解抑郁癥[14]。

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa，簡(jiǎn)稱黑果）是一種食用漿果，多酚含量在現(xiàn)有報(bào)道植物中居于首位，多酚主要為原花青素、酚酸等，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎等多種功效[15,16]。據(jù)報(bào)道多酚可通過(guò)抑制腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)改善慢性不可預(yù)知應(yīng)激引起的小鼠抑郁[17,18]。此外，多酚腸道菌群代謝物還具有促進(jìn)心理狀況的功效[19]。黑果在食品加工行業(yè)中的應(yīng)用主要集中與制作果汁[20]和釀造果酒[21]等，此外有研究表明黑果多酚還具有改善糖尿病[22]、改善高血壓[23]、抗癌[24]等功能，但對(duì)其在抑郁癥腸道菌群與腦神經(jīng)等影響效果和機(jī)制未有報(bào)道。因此，本文以黑果多酚提取物為原料，探究其對(duì)抑郁癥小鼠腸道菌群與BDNF影響作用，揭示其對(duì)抑郁癥小鼠調(diào)節(jié)機(jī)理，探索黑果作為功能性食品的高值化開(kāi)發(fā)價(jià)值和發(fā)展前景，以期為拓寬黑果的應(yīng)用領(lǐng)域，提升其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，更好地為人們的健康提供資源和思路，進(jìn)而創(chuàng)造更大的社會(huì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黑果多酚提取物與試劑

黑果取自淄博市鐵山林場(chǎng)。皮質(zhì)酮由江蘇佳爾科藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供；氟西汀由山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司提供；碳酸鈉購(gòu)自阿拉丁化學(xué)試劑公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚試劑等其它常用試劑購(gòu)自上海愛(ài)純生物科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/C雄性健康小鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)SCK(魯) 2014-0007，質(zhì)量18～22 g，7～8周齡，配套標(biāo)準(zhǔn)飼料與墊料由濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

FD-1A-50冷凍干燥機(jī)，杭州聚同電子有限公司；酶標(biāo)儀，飛世爾（上海）儀器有限公司；SDS-PAGE凝膠電泳儀，BIO-RAD公司。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑果多酚提取

以黑果果實(shí)（葉）為原料，提取制備多酚，將新鮮黑果果實(shí)（葉）洗凈，打漿。稱取5 g漿液按照1:5料液比添加適量50%乙醇超聲40 min，抽濾，濾液在50 ℃條件下減壓除去乙醇，經(jīng)凍干后冷凍保存，備用。

1.2.2 黑果多酚含量的測(cè)定

采用福林酚法[25]測(cè)定多酚的含量，并稍做修改，標(biāo)準(zhǔn)液為沒(méi)食子酸，在765 nm處測(cè)定其吸光度。

配制1 mg/mL凍干黑果多酚提取物，其他操作同上。

標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.397x-0.0001，r=0.99測(cè)得黑果果實(shí)和黑果葉子多酚含量分別為19.59、18.60 mg/g。

1.2.3 抑郁癥小鼠模型的建立

90只健康雄性的BALB/C小鼠隨機(jī)平均分為9組。對(duì)照組（D）為健康小鼠以灌胃方式給與0.20 mL的生理鹽水；模型組（M）通過(guò)注射0.20 mL、4 mg/mL皮質(zhì)酮建立抑郁癥小鼠模型；藥物組（陽(yáng)性對(duì)照組Y）皮下注射0.20 mL、4 mg/mL皮質(zhì)酮和0.20 mL氟西汀；黑果果實(shí)多酚提取物低、中、高劑量組分別皮下注射0.20 mL、4 mg/mL皮質(zhì)酮與以灌胃方式給與40、60、80 mg/kg黑果果實(shí)多酚提取物（HGd、HGz、HGg）；黑果葉子低、中、高劑量組分別皮下注射0.20 mL、4 mg/mL皮質(zhì)酮與以灌胃方式給與15、22.50、30 mg/kg黑果葉子多酚提取物（HYd、HYz、HYg）。所有小鼠每天給與一次藥物注射與黑果多酚灌胃，4周后進(jìn)行動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

小鼠于水深12 cm（水溫約為22～25 ℃）容器中。實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)為6 min，記錄3～6 min小鼠累計(jì)不動(dòng)的時(shí)間[26]。

1.2.4.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前48 h對(duì)小鼠先進(jìn)行一次糖水偏好訓(xùn)練。每個(gè)鼠籠中都預(yù)先放置純凈水和1%的蔗糖水，每次間隔0.50 d互換水瓶的位置。訓(xùn)練完畢，小鼠禁止進(jìn)食24 h后，自由飲用6 h，統(tǒng)計(jì)每只小鼠的純水和蔗糖水飲用重量。糖水偏愛(ài)率=糖水消耗重量/(糖水消耗重量+純水消耗重量)×100%[27]。

1.2.4.3 懸尾實(shí)驗(yàn)

將小鼠尾巴末梢固定于桿上，使小鼠處于頭部朝下倒掛，使頭部與地面相差約50 cm，周圍用白色塑料板隔離。實(shí)驗(yàn)時(shí)長(zhǎng)6 min，記錄3～6 min小鼠累計(jì)的不動(dòng)時(shí)間[28]。

1.2.5 大鼠腸道菌群測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，將小鼠糞便存入滅菌EP管中，并置于液氮中凍存。腸道菌群多樣性、菌群群落、主成分等委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)定。

1.2.6 BDNF測(cè)定

小鼠脫頸致死，無(wú)菌環(huán)境下取大腦皮層底部海馬組織，采用王賽等[29]的實(shí)驗(yàn)方法并稍做修改測(cè)定小鼠大腦BDNF水平。

試驗(yàn)結(jié)束后按照學(xué)校實(shí)驗(yàn)衛(wèi)生要求，將廢棄物集中暫存在實(shí)驗(yàn)室中，由學(xué)校統(tǒng)一集中處理。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每組做3個(gè)平行。利用SPSS 19數(shù)據(jù)分析，Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

小鼠不同行為學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)M人類在抑郁癥中的絕望狀態(tài)，反映了小鼠抑郁的程度及模型建立是否成功[30]。由圖1數(shù)據(jù)表明，在FST與TST中模型組小鼠的不動(dòng)時(shí)間（與正常組相比）均顯著延長(zhǎng)；對(duì)糖水的偏好率顯著降低，模型組小鼠焦慮性行為顯著增加，表明抑郁癥模型建模成功。與模型組相比，各黑果多酚劑量組均能顯著降低小鼠在FST與TST中的不動(dòng)時(shí)間并顯著提高糖水偏好率，表明黑果多酚可改善抑郁癥小鼠的焦慮性行為。行為不同，抑郁程度與黑果多酚提取物劑量關(guān)系不同，整體呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。結(jié)合劑量、效果和成本等因素綜合考慮，黑果果實(shí)提取物最佳劑量為中劑量組（60 mg/kg）。此外，黑果多酚提取物與模型組、正常組之間均有顯著差異，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中黑果多酚提取物起到了顯著調(diào)節(jié)抑郁行為效果，但還沒(méi)有完全調(diào)整恢復(fù)到正常狀態(tài)。三種行為實(shí)驗(yàn)中黑果多酚提取物最佳劑量不同，這是因?yàn)楦餍袨閷?shí)驗(yàn)涉及小鼠生理、心理等指標(biāo)、作用途徑、機(jī)制等不同。綜上，黑果多酚提取物可以顯著改善抑郁行為，這與文獻(xiàn)所報(bào)道綠茶多酚可以增強(qiáng)抑郁小鼠的自主活動(dòng)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似[31]。

2.2 腸道菌群稀釋曲線分析

稀釋曲線的數(shù)據(jù)序列是隨機(jī)從實(shí)驗(yàn)樣本中抽取的，本次測(cè)序數(shù)據(jù)量是否足夠可根據(jù)曲線是否達(dá)到平緩來(lái)判斷[32]。圖2所示，在所測(cè)序列較少時(shí)，OTUs的數(shù)量顯著增加；隨著所測(cè)序列增加，表明樣品中的大多數(shù)微生物類群在測(cè)序量中得以體現(xiàn)。圖3 Shannon指數(shù)呈現(xiàn)平緩趨勢(shì)，表明取樣合理。從圖2、圖3可以看出，模型組Shannon值與Sobs值顯著高于空白組，表明抑郁癥促使小鼠腸道菌群的多樣性水平上升。與模型組相比，藥物組、HG低、高劑量組與HY中劑量組的Shannon值均顯著降低，這表明藥物與合適劑量的黑果多酚提取物對(duì)降低小鼠腸道菌群多樣性具有積極影響。綜上，藥物與黑果多酚提取物具有調(diào)節(jié)抑郁癥小鼠腸道菌群多樣性的作用，但與正常組Sobs值與Shannon值仍存在顯著差異，表明藥物與黑果多酚提取物并未將抑郁癥小鼠腸道菌群多樣性完全恢復(fù)至正常水平，此外小鼠腸道菌群多樣性與黑果果實(shí)提取物劑量關(guān)系呈現(xiàn)劑量負(fù)相關(guān)。

2.3 Alpha多樣性分析

描述Alpha多樣性的指標(biāo)通常有Chao、Ace、Shannon、Simpson等指數(shù)，Chao、Ace指數(shù)反映樣品中群落的豐富度；Shannon、Simpson指數(shù)反映群落的多樣性[33]。表1結(jié)果顯示，模型組的Ace值（與正常組相比）明顯降低，表明小鼠在抑郁狀態(tài)下的腸道菌群的豐富度低于正常情況時(shí)；而藥物組Ace值與Chao值均顯著低于模型組，表明藥物不具有顯著提高抑郁小鼠腸道菌群豐富度的作用。HG低、中劑量組與HY低劑量組與模型組相比豐富度顯著提高，表明適當(dāng)劑量的黑果多酚具有提高抑郁癥小鼠腸道菌群豐富度的積極作用；藥物組和HG組與空白組豐富度和多樣性仍存在顯著差異，表明藥物和黑果多酚提取物未能將抑郁癥小鼠腸道菌群豐富度和多樣性調(diào)節(jié)至正常水平。黑果果實(shí)多酚提取物與菌群豐富度呈劑量負(fù)相關(guān)，且HG高劑量組的小鼠腸道菌群豐富度和多樣性與空白組接近。

表1 黑果多酚提取物對(duì)小鼠腸道菌群ALPHA多樣性分析的影響 Table 1 Effects of polyphenol extracts from Aronia melanocarpa on ALPHA diversity analysis of intestinal flora in mice

由上文與表1結(jié)果表明，模型組小鼠的腸道菌群多樣性相較于正常組略有提升，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與蔣海寅[34]實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同，其提高的原因可能為小鼠體內(nèi)有害菌種類增加。上述結(jié)果表明適當(dāng)劑量的黑果多酚提取物具有改善抑郁癥小鼠腸道菌群失調(diào)的功能，與Guo等[35]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同，多酚對(duì)調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，改善健康具有積極作用。

2.4 群落組成測(cè)定分析

在門(mén)水平，空白組腸道菌群主要由擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）組成，總比例達(dá)88.83%，其次為放線菌門(mén)（Actinobacterias）。相關(guān)研究表明，抑郁癥患者腸道菌群與健康人群差異較大[36]。從圖5看出，與空白組相比，模型組小鼠腸道菌群擬桿菌門(mén)豐度顯著提高，厚壁菌門(mén)豐度降低，表明抑郁癥會(huì)改變腸道菌群比例，從而導(dǎo)致菌群失調(diào)，與蔣海寅[34]相關(guān)臨床研究抑郁癥患者的菌群結(jié)構(gòu)變化結(jié)果基本一致。

擬桿菌是一種寄居在人體的腸道中的致病菌，當(dāng)機(jī)體內(nèi)腸道菌群失調(diào)時(shí)，可導(dǎo)致感染與炎癥等疾病的發(fā)生；擬桿菌門(mén)中的致病菌prevotella，該菌屬細(xì)菌表面具有促進(jìn)人體分泌IL-8mRNA的脂多糖，會(huì)加重炎癥[37]。從圖5看出，藥物組、HG組與HY組擬桿菌門(mén)的比例均低于模型組，表明黑果多酚提取物與藥物具有抑制擬桿菌門(mén)的作用；HG高劑量組擬桿菌門(mén)比例與空白組差異不顯著，表明高劑量的黑果可將抑郁癥小鼠擬桿菌比例恢復(fù)至正常水平。厚壁菌門(mén)中的毛螺菌科參與短鏈脂肪酸（SCFAs）的代謝生產(chǎn)，SCFAs 可支持腸道上皮組織細(xì)胞活動(dòng)，降低致病菌經(jīng)由腸粘膜屏障入侵的概率，還可以促進(jìn)5-HT分泌[38]。HG與HY中厚壁菌門(mén)比例均高于模型組，表明黑果中的多酚提取物有益于厚壁菌門(mén)的增殖；黑果劑量組厚壁菌門(mén)比例與空白組存在顯著差異，表明黑果提取物未能將抑郁癥小鼠腸道內(nèi)厚壁菌門(mén)比例調(diào)節(jié)至正常水平；黑果提取物各劑量組厚壁菌門(mén)比例差異較小，表明黑果提取物劑量對(duì)厚壁菌門(mén)豐度無(wú)顯著影響。從圖4可知，與HY組不同，HG組小鼠腸道菌群中均出現(xiàn)疣微菌門(mén)。該屬中的Akkermansia muciniphila能夠產(chǎn)生SCFAs，可為人體提供日?；顒?dòng)所需能量，促進(jìn)腸道內(nèi)部健康[39]。綜上可得，黑果多酚提取物對(duì)腸道菌群組成與豐度具有顯著影響，黑果不同部分提取出的多酚對(duì)小鼠腸道菌群會(huì)產(chǎn)生不同影響，但整體上未能將抑郁小鼠腸道菌群調(diào)節(jié)至正常平衡狀態(tài)。

2.5 PCA分析

應(yīng)用主要成分分析（Principal Component Analysis，PCA）所研究的對(duì)象是小鼠腸道菌群組成的整體差異，樣本物種組成重合度越高，在PCA圖中距離越近[40]。圖6a表明空白組主要在PC2方向上與其他組產(chǎn)生差異，PC2解釋24.93%的差異性，空白組與藥物組、HGg組的小鼠腸道菌群組成相似性極高。圖6b表明空白組與其他組的差異主要在PC2方向上，PC2可以解釋23.83%的差異性，表明空白組與藥物組、HYg組的小鼠腸道菌群組成相似性極高。綜上，小鼠在抑郁與焦慮狀態(tài)下腸道菌群失衡，藥物與黑果多酚提取物可顯著改善抑郁癥小鼠腸道菌群紊亂狀況，并且高劑量的黑果果實(shí)多酚提取物、高劑量的黑果葉子多酚提取物調(diào)節(jié)抑郁癥小鼠腸道菌群的功效最佳。

2.6 BDNF分析

海馬、前額葉和杏仁核發(fā)揮著調(diào)節(jié)情緒與心理應(yīng)激反應(yīng)等作用，部分人群在患有抑郁癥后，海馬和前額葉活動(dòng)功能受損，杏仁核功能卻得到增強(qiáng)，甚至?xí)斐珊ｑR萎縮[41]。

從圖7、圖8可以看出，模型組BDNF表達(dá)水平相較于空白組明顯降低，抑郁癥使小鼠的腸道菌群失衡，菌群的改變誘發(fā)了精神紊亂，從而抑制了小鼠海馬中BDNF的表達(dá)，使其低于正常水平。從圖7可以看出，與模型組相比，藥物與黑果果實(shí)多酚干預(yù)后，小鼠BDNF水平顯著提高，表明藥物與黑果果實(shí)多酚提取物有利于BDNF的釋放，其中HG中劑量組效果最佳，BDNF水平可顯著提高81.39%；HG劑量組BDNF水平顯著高于空白組，表明黑果果實(shí)多酚提取物還未能將BDNF水平調(diào)節(jié)至正常水平。從圖8看出，與模型組相比，HY組BDNF表達(dá)水平均未得到顯著上調(diào)，表明黑果葉子多酚提取物對(duì)于BDNF的釋放不具有積極影響。綜上可得，黑果果實(shí)多酚提取物對(duì)大腦海馬中BDNF的表達(dá)具有顯著提高作用，周蓉等也發(fā)現(xiàn)多酚可提高抑郁大鼠海馬體中BDNF的表達(dá)水平[42,43]。黑果果實(shí)組小鼠大腦中BDNF水平的提高，可能的原因一方面是由于黑果果實(shí)多酚提取物發(fā)揮一定的抗氧化作用從而減少了氧化應(yīng)激對(duì)腦神經(jīng)造成的損害；另一方面則是因?yàn)楹诠麑?shí)多酚提取物將抑郁小鼠的腸道菌群豐富度與多樣性恢復(fù)到正常水平，因此小鼠大腦中BDNF水平提高了[44]。

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥使得正常小鼠的腸道菌群發(fā)生顯著變化：腸道菌群多樣性顯著降低，擬桿菌門(mén)比例顯著提高31.03%，厚壁菌門(mén)比例降低45.16%；大腦中BDNF水平顯著降低35.23%。黑果果實(shí)、葉子多酚提取物干預(yù)抑郁癥小鼠后，腸道菌群多樣性可顯著提高18.23%；黑果果實(shí)多酚提取物干預(yù)抑郁癥小鼠后，小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)顯著增強(qiáng)81.39%。

3.2 綜上所述，本研究探索了黑果葉子、果實(shí)的多酚提取物調(diào)節(jié)抑郁癥小鼠模型的作用關(guān)系和菌群機(jī)制。結(jié)果表明黑果多酚對(duì)抑郁癥具有一定的調(diào)節(jié)效果，黑果可作為功能性食品干預(yù)調(diào)節(jié)抑郁癥。本文為進(jìn)一步合理利用黑果、提高黑果的科技含量、開(kāi)發(fā)功能性食品提供一定的理論基礎(chǔ)。