張愛新， 張 卓， 張 杰

(北京市平谷區(qū)醫(yī)院急診科，北京市101200)

脆性骨折又稱骨質(zhì)疏松性骨折，是指輕微外傷所導(dǎo)致的非暴力性骨折[1]。盡管目前有許多方法可以改善脆性骨折的治療，并加快骨折愈合過程，但治療前景仍不能十分滿意[2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小的非編碼RNA，通過與信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)特異性結(jié)合而調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，骨折愈合過程中一些miRNAs通過調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化，在骨形成、吸收、重塑和修復(fù)中起重要的調(diào)節(jié)作用[5]。miR-363可通過減少多發(fā)性骨髓瘤患者骨溶解而抑制腫瘤進(jìn)展[6]，而其在成骨分化中的研究尚未見相關(guān)報道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-363在脆性骨折患者血中的表達(dá)及對小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞(mouse embryonic osteoblast precursor cells，MC3T3-E1)成骨分化及增殖的影響，并探討其對Dickkopf相關(guān)蛋白1(Dickkopf-1，DKK1)與Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)節(jié)作用。

1 資料和方法

1.1 儀器和試劑

普通PCR儀購自美國BIO-RAD公司；LightCycler480熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司。Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑均購自日本Takara公司；RIPA裂解液與Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Life technology公司；雙熒光素酶報告基因試劑購自美國Promega公司；模擬物及陰性對照購自蘇州GenePharma公司；杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清與Opti-MEM均購自美國Gibco公司；兔抗人DKK1與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自美國Abcam公司；噻唑藍(lán)(MTT)與二甲亞砜購自美國Sigma-Aldrich公司；MC3T3-E1細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 外周血標(biāo)本收集

收集2015年1月—2018年12月本院急診科就診的34例脆性骨折患者外周血標(biāo)本各5 mL，其中男20例，女14例，年齡32～74歲，平均(58.22±7.09)歲；收集11例本院體檢的正常健康者外周血標(biāo)本各5 mL，其中男6例，女5例，年齡40～76歲，平均(56.67±5.84)歲；同時收集上述患者術(shù)后1周、2周及4周外周血標(biāo)本各5 mL。采集后的新鮮外周血標(biāo)本立即放入抗凝管中，并置于-80 ℃冰箱中冷凍保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床表現(xiàn)為脆性骨折患者，影像學(xué)診斷明確。排除嚴(yán)重肝腎功能障礙、凝血功能障礙、關(guān)節(jié)炎、全身免疫系統(tǒng)疾病。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并獲得全部參與者的知情同意。

1.3 熒光定量PCR檢測基因表達(dá)

按照Trizol試劑常規(guī)提取標(biāo)本中總RNA，參照試劑盒說明書以RNA為模版進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模版進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下：模版cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，去離子水8 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，隨后98 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。U6與GAPDH為內(nèi)參基因，人miR-363、DKK1、矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)、連環(huán)蛋白β1(catenin beta 1，CTNNB1)和骨髓細(xì)胞瘤癌基因(myelocytomatosis oncogene，MYC)引物序列見表1。每組設(shè)計3個復(fù)孔，獨(dú)立重復(fù)3次，并通過2-ΔΔCt法分析各基因的表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

MC3T3-E1細(xì)胞復(fù)蘇后，采用DMEM培養(yǎng)基與10%胎牛血清在37 ℃、含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鋪板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)90%左右時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染模擬物與陰性對照，6 h后采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.5 MC3T3-E1細(xì)胞誘導(dǎo)成骨分化實(shí)驗(yàn)

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞使用6孔板進(jìn)行細(xì)胞鋪板，每孔細(xì)胞數(shù)約為6×106個，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時，使用添加10 mmol/L β-甘油磷酸和50 mg/L抗壞血酸的DMEM培養(yǎng)基與10%胎牛血清開始誘導(dǎo)分化，分化培養(yǎng)基每3天更新一次，持續(xù)分化處理28天。

1.6 茜素紅S染色實(shí)驗(yàn)檢測MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化

收集約1×106個誘導(dǎo)成骨分化28天MC3T3-E1細(xì)胞，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次5 min。將細(xì)胞用冷卻的0.05%戊二醛固定10 min，并用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每次5 min。37 ℃下用40 mmol/L茜素紅S染色5 min。將細(xì)胞用蒸餾水洗滌3次，每次5 min，然后用PBS緩沖液沖洗10 min。采用倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞顯色情況。

1.7 MTT實(shí)驗(yàn)檢測MC3T3-E1細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞使用96孔板進(jìn)行細(xì)胞鋪板，每孔細(xì)胞數(shù)約為4×103個，每孔每天加入16 μL MTT(5 g/L)并室溫孵育4 h后去上清，連續(xù)3天，之后加入130 μL二甲亞砜孵育15 min溶解結(jié)晶。測定各孔450 nm波長時的光密度(optical density，OD)，并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)

通過microRNA.org生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-363靶基因。以psiCHECK2為基礎(chǔ)載體，構(gòu)建psiCHECK2-DKK1-wt野生型報告載體與psiCHECK2-DKK1-mut突變型報告載體。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞使用24孔板進(jìn)行鋪板，每孔細(xì)胞數(shù)約為8×104個，并轉(zhuǎn)染野生型或突變型報告載體。24 h后按照雙熒光素酶報告基因試劑說明書檢測各孔海腎和螢火蟲基因的熒光素酶強(qiáng)度。

1.9 Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測DKK1蛋白表達(dá)

收集約1×106個MC3T3-E1細(xì)胞，采用RIPA裂解液提取總蛋白，常規(guī)定量和變性。制備12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，加入抗DKK1與GAPDH抗體4 ℃孵育過夜，TBS-T緩沖液洗滌3次，每次5 min。37 ℃孵育相應(yīng)二抗1 h，TBS-T緩沖液洗滌3次，每次5 min。暗室添加超敏化學(xué)發(fā)光液孵育20 s并曝光拍照。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 miR-363在外周血中的表達(dá)情況

熒光定量PCR結(jié)果顯示，miR-363在脆性骨折患者外周血中的表達(dá)水平低于正常健康者外周血(P<0.05)；脆性骨折患者術(shù)后1周、2周及4周外周血中miR-363的表達(dá)水平均高于術(shù)前，且呈上調(diào)趨勢，以4周的表達(dá)水平為最高(均P<0.05；表2)。

表2 miR-363 在正常健康者與脆性骨折患者外周血中的表達(dá)水平

2.2 MC3T3-E1細(xì)胞中過表達(dá)miR-363

模擬物組與陰性對照組MC3T3-E1細(xì)胞中可見大量紅色熒光，而空白組中無紅色熒光，提示細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率良好。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分析可見模擬物組MC3T3-E1細(xì)胞中miR-363表達(dá)水平(142.93±14.66)高于陰性對照(1.09±0.09)與空白組(1.00±0.13)(均P<0.05)，而陰性對照與空白組中miR-363表達(dá)水平差異無顯著性(P>0.05；圖1)。

圖1 MC3T3-E1細(xì)胞中過表達(dá)miR-363

2.3 過表達(dá)miR-363促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化與增殖

茜素紅S染色實(shí)驗(yàn)顯示，模擬物組MC3T3-E1細(xì)胞礦化程度高于陰性對照組(P<0.05)。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示，模擬物組MC3T3-E1細(xì)胞中RUNX2及OCN mRNA表達(dá)水平均高于陰性對照組(均P<0.05)。MTT實(shí)驗(yàn)顯示，在細(xì)胞培養(yǎng)后1天、2天、3天，模擬物組MC3T3-E1細(xì)胞增殖均高于陰性對照組(均P<0.05；圖2)。

圖2 過表達(dá)miR-363促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化與增殖

2.4 過表達(dá)miR-363抑制靶基因DKK1表達(dá)

生物信息學(xué)顯示，DKK1 mRNA 3′-UTR與miR-363存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)顯示，模擬物抑制野生型報告載體熒光素酶強(qiáng)度(P<0.05)，而對突變型報告載體沒有影響(P>0.05)。Western blotting實(shí)驗(yàn)顯示，模擬物組MC3T3-E1細(xì)胞中DKK1蛋白表達(dá)水平低于陰性對照組(P<0.05；圖3)。

圖3 過表達(dá)miR-363下調(diào)靶基因DKK1表達(dá)

2.5 過表達(dá)miR-363促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)基因表達(dá)

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)顯示，模擬物組MC3T3-E1細(xì)胞中CCND1、CTNNB1及MYC mRNA表達(dá)水平均高于陰性對照組(均P<0.05；表3)。

表3 陰性對照組與模擬物組CCND1、CTNNB1及MYC mRNA表達(dá)水平

3 討 論

研究表明，miRNAs在成骨分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[7]。Chen等[8]發(fā)現(xiàn)miR-7-5p調(diào)控趨化因子樣受體1表達(dá)促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)miR-155通過下調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白9表達(dá)誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞成骨分化。Yan等[10]報道m(xù)iR-22通過抑制組蛋白脫乙?；?表達(dá)促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。此外，Ren等[11]報道m(xù)iR-23a-5p通過靶向有絲分裂原激活的蛋白激酶13表達(dá)抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。miR-363位于人基因組Xq26.2區(qū)域，在胃癌、乳頭狀甲狀腺癌、肝細(xì)胞癌和肺腺癌等多種腫瘤中起抑癌作用[12]。本文結(jié)果顯示過表達(dá)miR-363促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化及增殖，初步揭示了miR-363在骨折愈合中的作用。

DKK1是一種分泌型糖蛋白，通過特異性阻斷成骨細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號通路傳導(dǎo)，從而抑制成骨細(xì)胞的發(fā)育和活性[13]。研究發(fā)現(xiàn)，提高DKK1水平與活性可能導(dǎo)致成骨細(xì)胞活性受損和骨質(zhì)流失[14]。此外，全基因組表達(dá)分析已將DKK1確定為一種與婦女絕經(jīng)后骨礦物質(zhì)密度變化相關(guān)的基因，與骨礦物質(zhì)密度呈負(fù)相關(guān)[15]。本研究采用生物信息學(xué)分析miR-36的靶基因，發(fā)現(xiàn)DKK1是miR-363的靶基因，miR-363可與DKK1 mRNA 3′-UTR結(jié)合而抑制其蛋白表達(dá)。該結(jié)果初步表明，miR-363可能通過抑制靶基因DKK1表達(dá)促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化及增殖。

Wnt/β-catenin信號通路是由配體無翅型MMTV整合位點(diǎn)家族蛋白和膜蛋白受體結(jié)合激發(fā)的一組多種下游通道的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在胚胎發(fā)育、組織器官形成以及腫瘤發(fā)生中起重要作用[16]。在胚胎骨骼形成過程中，抑制Wnt/β-catenin信號通路可阻止成骨細(xì)胞分化，從而誘導(dǎo)多能間充質(zhì)細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞[17]。此外，在動物和人類的骨折愈合中，Wnt/β-catenin信號通路的許多下游基因均被激活，包括CCND1、CTNNB1及MYC等[18]。本文結(jié)果顯示過表達(dá)miR-363增加MC3T3-E1細(xì)胞中CCND1、CTNNB1及MYC的表達(dá)水平，初步表明miR-363可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化及增殖。

綜上所述，miR-363促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化與增殖，該機(jī)制可能與調(diào)控靶基因DKK1與Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)。miR-363有希望作為治療骨折愈合的新靶點(diǎn)。