蒙秋霞，徐全飛，聶建軍，潘保華，馮婉君，牛宇*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院省部共建有機旱作農(nóng)業(yè)國家重點實驗室，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟管理學(xué)院，山西 太原 030006）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus membranaceus var.mongholicus） 或膜莢黃芪（Astragalus membranaceus）的干燥根[1]，其味甘，微溫，無毒，具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、利水消腫、托瘡生肌等功效，可煎服、生用或蜜炙用，食藥用歷史非常悠久，在我國應(yīng)用比較廣泛，暢銷于國內(nèi)外[2-3]。目前已從黃芪中分離鑒定出200多種成分，其中多數(shù)為皂苷、多糖和黃酮類，具有抗氧化、抗腫瘤和提高免疫力等活性[4]。研究表明，黃芪水提物可通過誘導(dǎo)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）和自由基水平發(fā)揮抗氧化作用[5]。

黑木耳（Auricularia heimuer）又稱木耳、黑菜等，子實體味道鮮美，富含膠質(zhì)和多種營養(yǎng)成分，是一種既可食用又可藥用的大型真菌[6-7]。目前，對黑木耳中的多糖、蛋白質(zhì)、黃酮類、多酚類和黑色素等活性成分均有研究，其中多糖為含量最高的成分，可顯著提高超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性并顯著降低乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LD）活性和丙二醛（MDA）含量，并能清除自由基，且具有抗衰老、抗癌、清除自由基、降低血糖濃度、增強免疫力、護肝、止咳化痰等作用[8-10]。

我國黑木耳資源比較豐富，開發(fā)和利用黑木耳有很大的前景。黑木耳液體深層發(fā)酵相對子實體的培養(yǎng)，具備菌絲生長快、生產(chǎn)周期短的優(yōu)勢，且發(fā)酵出來的菌絲菌齡大都一致，也有成本低、效率高、易于工業(yè)應(yīng)用等諸多優(yōu)點[11]。近年來，人們開始探索用生物活性物質(zhì)和微量元素研發(fā)復(fù)合基質(zhì)培養(yǎng)食用菌，通過科學(xué)方法和特殊工藝培育具有保健功能成分的菌類產(chǎn)品。文獻表明，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加刺五加、天麻等生物活性成分或硒等微量元素，可促進黑木耳菌絲的生長和活性物質(zhì)產(chǎn)生，并增強其生物活性[12-14]。目前，黃芪對黑木耳液體發(fā)酵影響的相關(guān)研究較少，僅張勁松等[15]研究了黃芪水提物對包括黑木耳在內(nèi)的5種食用菌菌絲體生長的影響，深層發(fā)酵基質(zhì)中添加黃芪后黑木耳菌絲體的生長狀況、活性成分和抗氧化能力的變化未見報道。因此，本試驗以黑木耳作為研究對象，在其發(fā)酵基質(zhì)中添加黃芪水提物，探索其對黑木耳菌絲體生長、活性成分含量和抗氧化活性的影響，為新型功能性食藥用菌產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃芪：山西省渾源縣的蒙古黃芪主根；黑木耳菌種（雪梅三號）：保存于山西省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率檢測試劑盒、羥基自由基測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；亞硝酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酵母浸膏、水楊酸：天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇、硝酸鋁、硫酸鎂、磷酸二氫鉀：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；黃芪甲苷、槲皮素：北京北方偉業(yè)化工技術(shù)研究院；沒食子酸：成都市科龍化工試劑廠；葡萄糖：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；香草醛、四氯苯醌、苯酚、氯化鐵：南京化學(xué)試劑股份有限公司；福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；硫酸亞鐵：無錫市晶科化工有限公司；過氧化氫：天津市東方廣誠醫(yī)藥化工有限公司；三氯乙酸：天津市光復(fù)精細化工研究所；鐵氰化鉀：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水氯化亞鐵：上海依赫生物科技有限公司；氫氧化鈉：天津市大陸化學(xué)試劑廠；亞鐵嗪、硼氫化鈉：美國Sigma-Aldrich公司；蛋白胨、瓊脂粉：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；維生素B1：天津力生制藥股份有限公司。所用試劑均為分析純。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0.3%、硫酸鎂0.2%、磷酸二氫鉀0.2%、瓊脂2%。

液體種子培養(yǎng)基：黃豆芽汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.2%、酵母浸膏0.5%、硫酸鎂0.1%、維生素B10.01%，pH自然。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺（SW-GJ-1FD）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（BS-S）：國華電器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）：江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；真空冷凍干燥機（Christ ALPHA 2-4 LD plus）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（HG-9040S）：浙江寧波東南儀器有限公司；紫外分光光度計（721型）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；高速多功能粉碎機（L-500A型）：浙江省永康市松青五金工具廠。

1.3 方法

1.3.1 黃芪水提物的制備

黃芪主根切片、干燥、粉碎，過60目篩后，按照料液比1∶10（質(zhì)量比）加入蒸餾水，攪拌沸煮1 h，冷卻后用4層紗布過濾，收集濾液，重復(fù)沸煮過濾兩次，合并濾液，減壓濃縮至適當(dāng)體積，分裝置于-20℃冰箱18 h，于冷凍干燥機內(nèi)凍干，用研缽研成粉末，過篩，即得黃芪水提物干粉，置于-20℃冰箱備用。

1.3.2 黑木耳菌種的活化

配制PDA固體培養(yǎng)基，滅菌1.5 h后趁熱倒入平板，冷卻至水汽消失，接種黑木耳菌種，培養(yǎng)一段時間，每天觀察菌種生長情況，選擇長勢良好的菌種用于后續(xù)試驗。

1.3.3 添加黃芪水提物的黑木耳菌絲體生長情況測定

1.3.3.1 平板培養(yǎng)

精密稱取4 g黃芪水提物干粉溶于20 mL雙蒸水中，配制成0.2 g/mL的黃芪水提物母液備用。在50 mL的錐形瓶中分別添加黃芪水提物母液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mL，再向錐形瓶中加入熱的PDA培養(yǎng)基至40 mL，搖勻，配制成黃芪水提物濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/mL 的培養(yǎng)基。高壓蒸汽滅菌90 min后趁熱倒入平板，每個濃度3次重復(fù)，冷卻，待培養(yǎng)基水汽消失后用6 mm2打孔器接入活化好的黑木耳菌種。連續(xù)培養(yǎng)6 d后，記錄菌落直徑，計算菌絲平均生長速率。平均生長速率/（mm/d）=（菌落直徑-接種菌餅直徑）÷培養(yǎng)時間。

1.3.3.2 深層培養(yǎng)

錐形瓶中放入黃芪水提物濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/mL 的液體種子培養(yǎng)基 45 mL，在每個錐形瓶中加入5 mL培養(yǎng)好的黑木耳液體深層發(fā)酵母液，3次重復(fù)，在恒溫培養(yǎng)箱溫度28℃、轉(zhuǎn)速100 r/min下培養(yǎng)7 d后，將所得深層發(fā)酵液于離心機中3 500 r/min離心20 min，棄上清，用洗瓶搖洗、離心2次，將沉淀置恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60℃干燥至恒重，稱重并計算菌絲體干重。

1.3.4 添加黃芪水提物深層發(fā)酵黑木耳菌絲體的制備

1.3.4.1 黑木耳深層發(fā)酵母液的制備

配制液體種子培養(yǎng)基，接入活化的黑木耳菌種，28℃下以轉(zhuǎn)速100 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，得到黑木耳深層發(fā)酵母液。

1.3.4.2 添加黃芪水提物的深層發(fā)酵

配制50 mg/mL溶解于液體種子培養(yǎng)基的黃芪水提物母液。錐形瓶中加入80 mL液體種子培養(yǎng)基，然后處理組添加10 mL黃芪水提物母液，使其終濃度達到5 mg/mL，對照組添加10 mL液體種子培養(yǎng)基，2次重復(fù)，蒸汽滅菌，冷卻后各加入10 mL黑木耳深層發(fā)酵母液，置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，28℃下以轉(zhuǎn)速100 r/min培養(yǎng)7 d。

1.3.4.3 菌絲體干粉及待測溶液的制備

將培養(yǎng)好的處理組和對照組黑木耳深層發(fā)酵液分別于3 500 r/min離心20 min，棄上清，用洗瓶搖洗、離心2次后，將沉淀置恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60℃干燥至恒重，研磨稱重，密封保存于-20℃冰箱。

測定活性成分含量時，將菌絲體干粉從冰箱取出靜置至室溫后進行。精密稱取菌絲體干粉，用50%甲醇[固液比 1∶10（g/mL）]浸提 1 h，離心收集上清液，用雙蒸水稀釋得到 2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0、25.0 mg/mL的菌絲體抗氧化活性待測溶液。

1.3.5 菌絲體活性成分含量的測定

總皂苷測定采用濃硫酸/香草醛法[2]，標準品為黃芪甲苷；總黃酮測定采用硼氫化鈉/四氯苯醌法[16]，標準品為槲皮素；總酚酸測定采用福林酚法[17]，標準品為沒食子酸；多糖的提取采用醇析法[18]，測定采用硫酸/苯酚法[19]，標準品為葡萄糖。

1.3.6 黑木耳菌絲體抗氧化活性的測定

1.3.6.1 DPPH自由基清除能力

配制所需濃度的菌絲體溶液。配制25 mg/L的DPPH-乙醇溶液。按試劑盒說明書所示添加試劑，搖勻，避光靜置1.5 h，在517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率的按下式計算。

式中：As為添加DPPH和待測樣品的混合液的吸光度；Ar為添加無水乙醇和待測樣品的混合液的吸光度；A0為添加DPPH和無水乙醇的混合液的吸光度。

1.3.6.2 羥基自由基清除能力

配制所需濃度的菌絲體溶液。配制9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液。取16支10 mL EP管，先在各管中加入1 mL FeSO4溶液和2 mL水楊酸-乙醇溶液，然后加入2 mL樣品（以雙蒸水作空白對照），混勻，再加入2 mL H2O2溶液，室溫（25℃）反應(yīng)1 h，在510 nm處測其吸光度。羥基自由基清除率按下式計算。

式中：Aa為添加待測樣品和H2O2溶液的混合液的吸光度；Ab為添加待測樣品和雙蒸水的混合液的吸光度；Ac為添加H2O2溶液和雙蒸水的混合液的吸光度。

1.3.6.3 還原力

配制所需濃度的菌絲體溶液。配制0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6.6）、1%鐵氰化鉀、10%三氯乙酸和0.1%氯化鐵溶液。取21支2.5 mL EP管，在各管中加入0.2 mL菌絲體溶液（以雙蒸水為空白對照）、0.5 mL磷酸緩沖液和0.5 mL鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20 min，加0.5 mL三氯乙酸溶液，靜置反應(yīng)20 min，再加入0.5 mL氯化鐵溶液，靜置10 min，測定700 nm處的吸光度。

1.3.6.4 亞鐵離子螯合能力

配制所需濃度的菌絲體溶液。配制2 mmol/L FeCl2溶液和5 mmol/L亞鐵嗪溶液。先在各管中加入0.5 mL樣品（以雙蒸水作空白對照）和0.1 mL FeCl2溶液，混勻后反應(yīng)5 min，然后再加入0.1 mL亞鐵嗪溶液，靜置10 min，最后在562 nm處測定吸光度。亞鐵離子螯合率按下式計算。

式中：A0為空白對照的吸光度；A1為待測樣品的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

各試驗設(shè)3個重復(fù)，結(jié)果表示為平均值±標準差；用Duncan's多重比較檢驗各個處理數(shù)據(jù)間的差異顯著性；用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪水提物對深層培養(yǎng)黑木耳菌絲生長的影響

不同黃芪水提物濃度下黑木耳菌絲體生長情況見圖1。

圖1 不同黃芪水提物濃度下黑木耳菌絲體生長情況Fig.1 Mycelial growth of A.heimuer treated with different concentrations of A.membranaceus aqueous extract

添加不同濃度黃芪水提物后，平板培養(yǎng)和深層培養(yǎng)中黑木耳菌絲的生長情況均出現(xiàn)明顯差異。由圖1（I）可見，平板培養(yǎng)中各處理黑木耳菌絲為白色絲狀，黃芪水提物的添加不影響菌絲顏色；菌落近圓形。如圖1（II）所示，菌絲體平均生長速率和干重在黃芪水提物濃度為2.5 mg/mL時最大，在5.0 mg/mL時次之，隨后在5.0 mg/L～30.0 mg/mL內(nèi)隨黃芪水提物濃度的升高而呈減小趨勢。平板培養(yǎng)中，菌絲的致密度則隨黃芪水提物濃度的升高而增大，在黃芪水提物濃度為0和2.5 mg/mL時較稀疏，在5.0 mg/mL～30.0 mg/mL時較致密。深層培養(yǎng)7 d后，與對照組相比，黃芪水提物濃度在2.5 mg/mL～10.0 mg/mL時能極顯著促進黑木耳菌絲體生長（P＜0.01），在15.0 mg/mL時菌絲體干重與對照組差異不顯著（P＞0.01），在 20.0 mg/mL～30.0 mg/mL時抑制了菌絲體生長，菌絲體干重極顯著低于對照（P＜0.01）。

由圖1可知，在黃芪水提物添加濃度為2.5 mg/mL和5.0 mg/mL時，可顯著促進黑木耳菌絲的生長，也可使黃芪水提物對菌落大小和菌絲致密度的提升作用發(fā)揮到最大，兩個濃度對菌絲體平均生長速率和干重的影響差異不顯著（P＞0.01），且較高的添加濃度還可使更多的黃芪活性物質(zhì)進入培養(yǎng)基，有利于活性物質(zhì)向菌絲體的遷移轉(zhuǎn)化。故而本研究采用5.0 mg/mL作為后續(xù)黑木耳深層發(fā)酵中黃芪水提物的添加濃度。

2.2 黃芪水提物對深層培養(yǎng)黑木耳菌絲體活性成分含量的影響

黃芪水提物對深層培養(yǎng)黑木耳菌絲體活性成分含量的影響見表1。

表1 黑木耳深層發(fā)酵菌絲體活性成分含量Table 1 Contents of active compounds in A.heimuer mycelia in submerged fermentation supplemented with A.membranaceus aqueous extract

由表1可見，添加黃芪水提物深層發(fā)酵后，黑木耳菌絲體中的活性成分含量均有不同程度的提高。其中胞內(nèi)多糖的增加最為明顯，增量達到36.78 mg/g，其次為總酚酸、胞外多糖和總黃酮，說明黃芪水提物對這些成分的影響較大。相比之下，添加黃芪水提物深層發(fā)酵后黑木耳總皂苷的增量較小。

2.3 黃芪水提物對深層培養(yǎng)黑木耳菌絲體抗氧化活性的影響

2.3.1 DPPH自由基清除能力

黑木耳菌絲體的DPPH自由基清除能力見圖2。

圖2 黑木耳菌絲體的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH·scavenging capacity of A.heimuer mycelia

如圖2所示，黑木耳菌絲體對DPPH自由基的清除率隨著其濃度的增加而升高。添加黃芪水提物共發(fā)酵的黑木耳菌絲體（M1）與常規(guī)深層發(fā)酵黑木耳菌絲體（M0）清除DPPH自由基的50%效應(yīng)濃度（EC50值）分別為8.30 mg/mL和20.77 mg/mL。在試驗濃度范圍內(nèi)，M1的DPPH自由基清除率與對照M0相比極顯著增強（P＜0.01），在菌絲體濃度為 12.5 mg/mL 時，M1與M0的DPPH自由基清除率差異最大，是M0的2.27倍，表明培養(yǎng)基中添加黃芪水提物發(fā)酵可顯著促進黑木耳菌絲體DPPH自由基的清除能力。

2.3.2 羥基自由基清除能力

黑木耳菌絲體的羥基自由基清除能力見圖3。

圖3 黑木耳菌絲體的羥基自由基清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging capacity of A.heimuer mycelia

如圖3所示，經(jīng)常規(guī)深層發(fā)酵或添加黃芪提取物的深層發(fā)酵后，黑木耳菌絲體均對羥基自由基有一定的清除能力，其清除率隨著菌絲體濃度的增加而變大。M1與對照M0清除羥基自由基的EC50值分別為16.55 mg/mL和27.14 mg/mL。在菌絲體濃度為7.5 mg/mL～25.0 mg/mL時，羥基自由基清除率極顯著提高（P＜0.01），其中在濃度為10.0 mg/mL時，M1與M0的羥基自由基清除率差異最大，是M0的1.38倍，說明黃芪提取物的添加可顯著提高深層發(fā)酵黑木耳菌絲體羥基自由基的清除能力。

2.3.3 還原力

黑木耳菌絲體的還原力見圖4。

圖4 黑木耳菌絲體的還原力Fig.4 Reducing capacity of A.heimuer mycelia

從圖4可見，隨著黑木耳菌絲體濃度的增加，還原力（OD700nm）逐漸增加，呈一定的量效關(guān)系。還原力為0.5時，M1與對照M0的濃度分別為17.25 mg/mL和20.91 mg/mL。添加黃芪提取物發(fā)酵后，在5.0 mg/mL～25.0 mg/mL濃度內(nèi)M1與M0的還原力有顯著差異（P＜0.05），其中在濃度為5.0 mg/mL時差異最大，M1還原力是M0的1.58倍，說明添加黃芪提取物發(fā)酵對深層發(fā)酵黑木耳的還原力有一定的提高作用。

2.3.4 亞鐵離子螯合能力

黑木耳菌絲體的亞鐵離子螯合能力見圖5。

圖5 黑木耳菌絲體的亞鐵離子螯合能力Fig.5 Ferrous ion chelating capacity of A.heimuer mycelia

如圖5所示，經(jīng)常規(guī)深層發(fā)酵或添加黃芪提取物的深層發(fā)酵后，黑木耳菌絲體均具有較強的亞鐵離子螯合能力，并表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。M1與對照M0螯合亞鐵離子的EC50值分別為10.01mg/mL和26.94mg/mL?？梢?，添加了黃芪提取物發(fā)酵后，M1亞鐵離子螯合能力顯著提高，在菌絲體濃度為5.0 mg/mL時差異最大，是M0的1.97倍，說明添加黃芪水提物可促進深層發(fā)酵黑木耳菌絲體亞鐵離子螯合能力的提高。

3 討論與結(jié)論

本試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)液中黃芪水提物的濃度為2.5 mg/mL～5.0 mg/mL時，對黑木耳菌絲生長的促進作用最大，菌絲體干重最高，之后繼續(xù)增加黃芪水提物濃度，對菌絲生長的促進作用不再明顯，在高濃度范圍內(nèi)，菌絲生長反而受到抑制。這一結(jié)果與已有報道一致。陳麗華等[20]研究了丹參、絞股藍、決明子、紅曲、銀杏葉、何首烏、葛根和苦蕎對黑木耳液體培養(yǎng)生物量的影響，認為它們中存在對黑木耳的生長具有促進和抑制作用的兩種因子，促進因子使其菌絲體干重增加，而濃度的提高使抑制因子的作用增強，從而導(dǎo)致菌絲體干重下降。至于其中促進因子和抑制因子的具體成分，及其影響黑木耳菌絲生長的作用機理有待進一步研究。

據(jù)張勁松等[21]報道，添加黃芪水提物可顯著提高深層發(fā)酵香菇菌絲體中的活性成分，其胞外多糖、胞內(nèi)多糖、總酚酸、總黃酮和總皂苷含量分別為常規(guī)發(fā)酵對照的 1.16、1.09、1.66、1.25、2.20 倍。本試驗也有類似發(fā)現(xiàn)，添加5 mg/mL黃芪水提物后，深層發(fā)酵黑木耳菌絲體中的活性成分含量顯著增加，其胞外多糖、胞內(nèi)多糖、總酚酸、總黃酮和總皂苷含量分別為對照的1.88、1.24、2.65、1.61、1.85 倍。可見，黃芪水提物能夠促進深層發(fā)酵食藥用菌活性成分的合成與積累。此外，添加5.0 mg/mL黃芪水提物后，深層發(fā)酵黑木耳菌絲體的DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、還原力和亞鐵離子螯合率分別為常規(guī)發(fā)酵對照菌絲體的2.27、1.38、1.58、1.97倍。該結(jié)果也與其他學(xué)者的報道類似，張穎等[14]研究了刺五加固體栽培基質(zhì)對黑木耳子實體營養(yǎng)成分及其多糖化學(xué)組成、抗氧化性的影響，發(fā)現(xiàn)刺五加的添加明顯提高了黑木耳的營養(yǎng)成分和多酚含量，并改變了黑木耳單糖組成比例，其對氧自由基和ABTS+自由基的清除能力也分別提高了3.2倍和2.7倍。值得一提的是，在其他食藥用菌的培養(yǎng)基質(zhì)中添加生物活性物質(zhì)也取得相似的效果。如辛燕花等[22]報道，添加何首烏深層發(fā)酵后，靈芝菌絲體中多糖、總?cè)坪忘S酮含量分別是對照的2.0、1.5倍和3.2倍；靈芝菌絲體中還原力、超氧陰離子自由基清除率和羥基自由基清除率分別是對照的4.5倍、1.5倍和2.0倍。由此可見，培養(yǎng)基質(zhì)中添加生物活性物質(zhì)，改變了黑木耳等食用菌化學(xué)成分的合成代謝途徑，從而促進了其生物量、活性物質(zhì)含量和功能的提升。

本試驗結(jié)果表明，黃芪水提物的添加可促進深層發(fā)酵黑木耳菌絲體的生長，并可提升其活性物質(zhì)含量和抗氧化活性。本研究可為黃芪的開發(fā)利用及新型食藥用菌產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。后續(xù)可在黃芪添加對黑木耳和其他食藥用菌子實體的形成、生產(chǎn)性能、化學(xué)成分、生物活性的影響方面展開深入研究。