蒙秋霞,徐全飛,聶建軍,潘保華,馮婉君,牛宇*
(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院省部共建有機旱作農(nóng)業(yè)國家重點實驗室,山西 太原 030031;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟管理學(xué)院,山西 太原 030006)
黃芪為豆科植物蒙古黃芪(Astragalus membranaceus var.mongholicus) 或膜莢黃芪(Astragalus membranaceus)的干燥根[1],其味甘,微溫,無毒,具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、利水消腫、托瘡生肌等功效,可煎服、生用或蜜炙用,食藥用歷史非常悠久,在我國應(yīng)用比較廣泛,暢銷于國內(nèi)外[2-3]。目前已從黃芪中分離鑒定出200多種成分,其中多數(shù)為皂苷、多糖和黃酮類,具有抗氧化、抗腫瘤和提高免疫力等活性[4]。研究表明,黃芪水提物可通過誘導(dǎo)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、降低丙二醛(malondialdehyde,MDA)和自由基水平發(fā)揮抗氧化作用[5]。
黑木耳(Auricularia heimuer)又稱木耳、黑菜等,子實體味道鮮美,富含膠質(zhì)和多種營養(yǎng)成分,是一種既可食用又可藥用的大型真菌[6-7]。目前,對黑木耳中的多糖、蛋白質(zhì)、黃酮類、多酚類和黑色素等活性成分均有研究,其中多糖為含量最高的成分,可顯著提高超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)活性并顯著降低乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LD)活性和丙二醛(MDA)含量,并能清除自由基,且具有抗衰老、抗癌、清除自由基、降低血糖濃度、增強免疫力、護肝、止咳化痰等作用[8-10]。
我國黑木耳資源比較豐富,開發(fā)和利用黑木耳有很大的前景。黑木耳液體深層發(fā)酵相對子實體的培養(yǎng),具備菌絲生長快、生產(chǎn)周期短的優(yōu)勢,且發(fā)酵出來的菌絲菌齡大都一致,也有成本低、效率高、易于工業(yè)應(yīng)用等諸多優(yōu)點[11]。近年來,人們開始探索用生物活性物質(zhì)和微量元素研發(fā)復(fù)合基質(zhì)培養(yǎng)食用菌,通過科學(xué)方法和特殊工藝培育具有保健功能成分的菌類產(chǎn)品。文獻表明,在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加刺五加、天麻等生物活性成分或硒等微量元素,可促進黑木耳菌絲的生長和活性物質(zhì)產(chǎn)生,并增強其生物活性[12-14]。目前,黃芪對黑木耳液體發(fā)酵影響的相關(guān)研究較少,僅張勁松等[15]研究了黃芪水提物對包括黑木耳在內(nèi)的5種食用菌菌絲體生長的影響,深層發(fā)酵基質(zhì)中添加黃芪后黑木耳菌絲體的生長狀況、活性成分和抗氧化能力的變化未見報道。因此,本試驗以黑木耳作為研究對象,在其發(fā)酵基質(zhì)中添加黃芪水提物,探索其對黑木耳菌絲體生長、活性成分含量和抗氧化活性的影響,為新型功能性食藥用菌產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。
黃芪:山西省渾源縣的蒙古黃芪主根;黑木耳菌種(雪梅三號):保存于山西省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)資源與經(jīng)濟研究所。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率檢測試劑盒、羥基自由基測定試劑盒:南京建成生物工程研究所;亞硝酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酵母浸膏、水楊酸:天津市大茂化學(xué)試劑廠;無水乙醇、硝酸鋁、硫酸鎂、磷酸二氫鉀:天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;黃芪甲苷、槲皮素:北京北方偉業(yè)化工技術(shù)研究院;沒食子酸:成都市科龍化工試劑廠;葡萄糖:天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;香草醛、四氯苯醌、苯酚、氯化鐵:南京化學(xué)試劑股份有限公司;福林酚試劑:北京索萊寶科技有限公司;硫酸亞鐵:無錫市晶科化工有限公司;過氧化氫:天津市東方廣誠醫(yī)藥化工有限公司;三氯乙酸:天津市光復(fù)精細化工研究所;鐵氰化鉀:國藥集團化學(xué)試劑有限公司;無水氯化亞鐵:上海依赫生物科技有限公司;氫氧化鈉:天津市大陸化學(xué)試劑廠;亞鐵嗪、硼氫化鈉:美國Sigma-Aldrich公司;蛋白胨、瓊脂粉:北京奧博星生物技術(shù)有限公司;維生素B1:天津力生制藥股份有限公司。所用試劑均為分析純。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)固體培養(yǎng)基:馬鈴薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0.3%、硫酸鎂0.2%、磷酸二氫鉀0.2%、瓊脂2%。
液體種子培養(yǎng)基:黃豆芽汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.2%、酵母浸膏0.5%、硫酸鎂0.1%、維生素B10.01%,pH自然。
超凈工作臺(SW-GJ-1FD):上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;恒溫振蕩培養(yǎng)箱(BS-S):國華電器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4):江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠;真空冷凍干燥機(Christ ALPHA 2-4 LD plus)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(HG-9040S):浙江寧波東南儀器有限公司;紫外分光光度計(721型):上海精密科學(xué)儀器有限公司;高速多功能粉碎機(L-500A型):浙江省永康市松青五金工具廠。
1.3.1 黃芪水提物的制備
黃芪主根切片、干燥、粉碎,過60目篩后,按照料液比1∶10(質(zhì)量比)加入蒸餾水,攪拌沸煮1 h,冷卻后用4層紗布過濾,收集濾液,重復(fù)沸煮過濾兩次,合并濾液,減壓濃縮至適當(dāng)體積,分裝置于-20℃冰箱18 h,于冷凍干燥機內(nèi)凍干,用研缽研成粉末,過篩,即得黃芪水提物干粉,置于-20℃冰箱備用。
1.3.2 黑木耳菌種的活化
配制PDA固體培養(yǎng)基,滅菌1.5 h后趁熱倒入平板,冷卻至水汽消失,接種黑木耳菌種,培養(yǎng)一段時間,每天觀察菌種生長情況,選擇長勢良好的菌種用于后續(xù)試驗。
1.3.3 添加黃芪水提物的黑木耳菌絲體生長情況測定
1.3.3.1 平板培養(yǎng)
精密稱取4 g黃芪水提物干粉溶于20 mL雙蒸水中,配制成0.2 g/mL的黃芪水提物母液備用。在50 mL的錐形瓶中分別添加黃芪水提物母液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mL,再向錐形瓶中加入熱的PDA培養(yǎng)基至40 mL,搖勻,配制成黃芪水提物濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/mL 的培養(yǎng)基。高壓蒸汽滅菌90 min后趁熱倒入平板,每個濃度3次重復(fù),冷卻,待培養(yǎng)基水汽消失后用6 mm2打孔器接入活化好的黑木耳菌種。連續(xù)培養(yǎng)6 d后,記錄菌落直徑,計算菌絲平均生長速率。平均生長速率/(mm/d)=(菌落直徑-接種菌餅直徑)÷培養(yǎng)時間。
1.3.3.2 深層培養(yǎng)
錐形瓶中放入黃芪水提物濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/mL 的液體種子培養(yǎng)基 45 mL,在每個錐形瓶中加入5 mL培養(yǎng)好的黑木耳液體深層發(fā)酵母液,3次重復(fù),在恒溫培養(yǎng)箱溫度28℃、轉(zhuǎn)速100 r/min下培養(yǎng)7 d后,將所得深層發(fā)酵液于離心機中3 500 r/min離心20 min,棄上清,用洗瓶搖洗、離心2次,將沉淀置恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60℃干燥至恒重,稱重并計算菌絲體干重。
1.3.4 添加黃芪水提物深層發(fā)酵黑木耳菌絲體的制備
1.3.4.1 黑木耳深層發(fā)酵母液的制備
配制液體種子培養(yǎng)基,接入活化的黑木耳菌種,28℃下以轉(zhuǎn)速100 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d,得到黑木耳深層發(fā)酵母液。
1.3.4.2 添加黃芪水提物的深層發(fā)酵
配制50 mg/mL溶解于液體種子培養(yǎng)基的黃芪水提物母液。錐形瓶中加入80 mL液體種子培養(yǎng)基,然后處理組添加10 mL黃芪水提物母液,使其終濃度達到5 mg/mL,對照組添加10 mL液體種子培養(yǎng)基,2次重復(fù),蒸汽滅菌,冷卻后各加入10 mL黑木耳深層發(fā)酵母液,置恒溫振蕩培養(yǎng)箱中,28℃下以轉(zhuǎn)速100 r/min培養(yǎng)7 d。
1.3.4.3 菌絲體干粉及待測溶液的制備
將培養(yǎng)好的處理組和對照組黑木耳深層發(fā)酵液分別于3 500 r/min離心20 min,棄上清,用洗瓶搖洗、離心2次后,將沉淀置恒溫鼓風(fēng)干燥箱中60℃干燥至恒重,研磨稱重,密封保存于-20℃冰箱。
測定活性成分含量時,將菌絲體干粉從冰箱取出靜置至室溫后進行。精密稱取菌絲體干粉,用50%甲醇[固液比 1∶10(g/mL)]浸提 1 h,離心收集上清液,用雙蒸水稀釋得到 2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、20.0、25.0 mg/mL的菌絲體抗氧化活性待測溶液。
1.3.5 菌絲體活性成分含量的測定
總皂苷測定采用濃硫酸/香草醛法[2],標準品為黃芪甲苷;總黃酮測定采用硼氫化鈉/四氯苯醌法[16],標準品為槲皮素;總酚酸測定采用福林酚法[17],標準品為沒食子酸;多糖的提取采用醇析法[18],測定采用硫酸/苯酚法[19],標準品為葡萄糖。
1.3.6 黑木耳菌絲體抗氧化活性的測定
1.3.6.1 DPPH自由基清除能力
配制所需濃度的菌絲體溶液。配制25 mg/L的DPPH-乙醇溶液。按試劑盒說明書所示添加試劑,搖勻,避光靜置1.5 h,在517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除率的按下式計算。
式中:As為添加DPPH和待測樣品的混合液的吸光度;Ar為添加無水乙醇和待測樣品的混合液的吸光度;A0為添加DPPH和無水乙醇的混合液的吸光度。
1.3.6.2 羥基自由基清除能力
配制所需濃度的菌絲體溶液。配制9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液和8.8 mmol/L H2O2溶液。取16支10 mL EP管,先在各管中加入1 mL FeSO4溶液和2 mL水楊酸-乙醇溶液,然后加入2 mL樣品(以雙蒸水作空白對照),混勻,再加入2 mL H2O2溶液,室溫(25℃)反應(yīng)1 h,在510 nm處測其吸光度。羥基自由基清除率按下式計算。
式中:Aa為添加待測樣品和H2O2溶液的混合液的吸光度;Ab為添加待測樣品和雙蒸水的混合液的吸光度;Ac為添加H2O2溶液和雙蒸水的混合液的吸光度。
1.3.6.3 還原力
配制所需濃度的菌絲體溶液。配制0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.6)、1%鐵氰化鉀、10%三氯乙酸和0.1%氯化鐵溶液。取21支2.5 mL EP管,在各管中加入0.2 mL菌絲體溶液(以雙蒸水為空白對照)、0.5 mL磷酸緩沖液和0.5 mL鐵氰化鉀溶液,50℃水浴20 min,加0.5 mL三氯乙酸溶液,靜置反應(yīng)20 min,再加入0.5 mL氯化鐵溶液,靜置10 min,測定700 nm處的吸光度。
1.3.6.4 亞鐵離子螯合能力
配制所需濃度的菌絲體溶液。配制2 mmol/L FeCl2溶液和5 mmol/L亞鐵嗪溶液。先在各管中加入0.5 mL樣品(以雙蒸水作空白對照)和0.1 mL FeCl2溶液,混勻后反應(yīng)5 min,然后再加入0.1 mL亞鐵嗪溶液,靜置10 min,最后在562 nm處測定吸光度。亞鐵離子螯合率按下式計算。
式中:A0為空白對照的吸光度;A1為待測樣品的吸光度。
各試驗設(shè)3個重復(fù),結(jié)果表示為平均值±標準差;用Duncan's多重比較檢驗各個處理數(shù)據(jù)間的差異顯著性;用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。
不同黃芪水提物濃度下黑木耳菌絲體生長情況見圖1。
圖1 不同黃芪水提物濃度下黑木耳菌絲體生長情況Fig.1 Mycelial growth of A.heimuer treated with different concentrations of A.membranaceus aqueous extract
添加不同濃度黃芪水提物后,平板培養(yǎng)和深層培養(yǎng)中黑木耳菌絲的生長情況均出現(xiàn)明顯差異。由圖1(I)可見,平板培養(yǎng)中各處理黑木耳菌絲為白色絲狀,黃芪水提物的添加不影響菌絲顏色;菌落近圓形。如圖1(II)所示,菌絲體平均生長速率和干重在黃芪水提物濃度為2.5 mg/mL時最大,在5.0 mg/mL時次之,隨后在5.0 mg/L~30.0 mg/mL內(nèi)隨黃芪水提物濃度的升高而呈減小趨勢。平板培養(yǎng)中,菌絲的致密度則隨黃芪水提物濃度的升高而增大,在黃芪水提物濃度為0和2.5 mg/mL時較稀疏,在5.0 mg/mL~30.0 mg/mL時較致密。深層培養(yǎng)7 d后,與對照組相比,黃芪水提物濃度在2.5 mg/mL~10.0 mg/mL時能極顯著促進黑木耳菌絲體生長(P<0.01),在15.0 mg/mL時菌絲體干重與對照組差異不顯著(P>0.01),在 20.0 mg/mL~30.0 mg/mL時抑制了菌絲體生長,菌絲體干重極顯著低于對照(P<0.01)。
由圖1可知,在黃芪水提物添加濃度為2.5 mg/mL和5.0 mg/mL時,可顯著促進黑木耳菌絲的生長,也可使黃芪水提物對菌落大小和菌絲致密度的提升作用發(fā)揮到最大,兩個濃度對菌絲體平均生長速率和干重的影響差異不顯著(P>0.01),且較高的添加濃度還可使更多的黃芪活性物質(zhì)進入培養(yǎng)基,有利于活性物質(zhì)向菌絲體的遷移轉(zhuǎn)化。故而本研究采用5.0 mg/mL作為后續(xù)黑木耳深層發(fā)酵中黃芪水提物的添加濃度。
黃芪水提物對深層培養(yǎng)黑木耳菌絲體活性成分含量的影響見表1。
表1 黑木耳深層發(fā)酵菌絲體活性成分含量Table 1 Contents of active compounds in A.heimuer mycelia in submerged fermentation supplemented with A.membranaceus aqueous extract
由表1可見,添加黃芪水提物深層發(fā)酵后,黑木耳菌絲體中的活性成分含量均有不同程度的提高。其中胞內(nèi)多糖的增加最為明顯,增量達到36.78 mg/g,其次為總酚酸、胞外多糖和總黃酮,說明黃芪水提物對這些成分的影響較大。相比之下,添加黃芪水提物深層發(fā)酵后黑木耳總皂苷的增量較小。
2.3.1 DPPH自由基清除能力
黑木耳菌絲體的DPPH自由基清除能力見圖2。
圖2 黑木耳菌絲體的DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH·scavenging capacity of A.heimuer mycelia
如圖2所示,黑木耳菌絲體對DPPH自由基的清除率隨著其濃度的增加而升高。添加黃芪水提物共發(fā)酵的黑木耳菌絲體(M1)與常規(guī)深層發(fā)酵黑木耳菌絲體(M0)清除DPPH自由基的50%效應(yīng)濃度(EC50值)分別為8.30 mg/mL和20.77 mg/mL。在試驗濃度范圍內(nèi),M1的DPPH自由基清除率與對照M0相比極顯著增強(P<0.01),在菌絲體濃度為 12.5 mg/mL 時,M1與M0的DPPH自由基清除率差異最大,是M0的2.27倍,表明培養(yǎng)基中添加黃芪水提物發(fā)酵可顯著促進黑木耳菌絲體DPPH自由基的清除能力。
2.3.2 羥基自由基清除能力
黑木耳菌絲體的羥基自由基清除能力見圖3。
圖3 黑木耳菌絲體的羥基自由基清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging capacity of A.heimuer mycelia
如圖3所示,經(jīng)常規(guī)深層發(fā)酵或添加黃芪提取物的深層發(fā)酵后,黑木耳菌絲體均對羥基自由基有一定的清除能力,其清除率隨著菌絲體濃度的增加而變大。M1與對照M0清除羥基自由基的EC50值分別為16.55 mg/mL和27.14 mg/mL。在菌絲體濃度為7.5 mg/mL~25.0 mg/mL時,羥基自由基清除率極顯著提高(P<0.01),其中在濃度為10.0 mg/mL時,M1與M0的羥基自由基清除率差異最大,是M0的1.38倍,說明黃芪提取物的添加可顯著提高深層發(fā)酵黑木耳菌絲體羥基自由基的清除能力。
2.3.3 還原力
黑木耳菌絲體的還原力見圖4。
圖4 黑木耳菌絲體的還原力Fig.4 Reducing capacity of A.heimuer mycelia
從圖4可見,隨著黑木耳菌絲體濃度的增加,還原力(OD700nm)逐漸增加,呈一定的量效關(guān)系。還原力為0.5時,M1與對照M0的濃度分別為17.25 mg/mL和20.91 mg/mL。添加黃芪提取物發(fā)酵后,在5.0 mg/mL~25.0 mg/mL濃度內(nèi)M1與M0的還原力有顯著差異(P<0.05),其中在濃度為5.0 mg/mL時差異最大,M1還原力是M0的1.58倍,說明添加黃芪提取物發(fā)酵對深層發(fā)酵黑木耳的還原力有一定的提高作用。
2.3.4 亞鐵離子螯合能力
黑木耳菌絲體的亞鐵離子螯合能力見圖5。
圖5 黑木耳菌絲體的亞鐵離子螯合能力Fig.5 Ferrous ion chelating capacity of A.heimuer mycelia
如圖5所示,經(jīng)常規(guī)深層發(fā)酵或添加黃芪提取物的深層發(fā)酵后,黑木耳菌絲體均具有較強的亞鐵離子螯合能力,并表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。M1與對照M0螯合亞鐵離子的EC50值分別為10.01mg/mL和26.94mg/mL??梢?,添加了黃芪提取物發(fā)酵后,M1亞鐵離子螯合能力顯著提高,在菌絲體濃度為5.0 mg/mL時差異最大,是M0的1.97倍,說明添加黃芪水提物可促進深層發(fā)酵黑木耳菌絲體亞鐵離子螯合能力的提高。
本試驗發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)液中黃芪水提物的濃度為2.5 mg/mL~5.0 mg/mL時,對黑木耳菌絲生長的促進作用最大,菌絲體干重最高,之后繼續(xù)增加黃芪水提物濃度,對菌絲生長的促進作用不再明顯,在高濃度范圍內(nèi),菌絲生長反而受到抑制。這一結(jié)果與已有報道一致。陳麗華等[20]研究了丹參、絞股藍、決明子、紅曲、銀杏葉、何首烏、葛根和苦蕎對黑木耳液體培養(yǎng)生物量的影響,認為它們中存在對黑木耳的生長具有促進和抑制作用的兩種因子,促進因子使其菌絲體干重增加,而濃度的提高使抑制因子的作用增強,從而導(dǎo)致菌絲體干重下降。至于其中促進因子和抑制因子的具體成分,及其影響黑木耳菌絲生長的作用機理有待進一步研究。
據(jù)張勁松等[21]報道,添加黃芪水提物可顯著提高深層發(fā)酵香菇菌絲體中的活性成分,其胞外多糖、胞內(nèi)多糖、總酚酸、總黃酮和總皂苷含量分別為常規(guī)發(fā)酵對照的 1.16、1.09、1.66、1.25、2.20 倍。本試驗也有類似發(fā)現(xiàn),添加5 mg/mL黃芪水提物后,深層發(fā)酵黑木耳菌絲體中的活性成分含量顯著增加,其胞外多糖、胞內(nèi)多糖、總酚酸、總黃酮和總皂苷含量分別為對照的1.88、1.24、2.65、1.61、1.85 倍。可見,黃芪水提物能夠促進深層發(fā)酵食藥用菌活性成分的合成與積累。此外,添加5.0 mg/mL黃芪水提物后,深層發(fā)酵黑木耳菌絲體的DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率、還原力和亞鐵離子螯合率分別為常規(guī)發(fā)酵對照菌絲體的2.27、1.38、1.58、1.97倍。該結(jié)果也與其他學(xué)者的報道類似,張穎等[14]研究了刺五加固體栽培基質(zhì)對黑木耳子實體營養(yǎng)成分及其多糖化學(xué)組成、抗氧化性的影響,發(fā)現(xiàn)刺五加的添加明顯提高了黑木耳的營養(yǎng)成分和多酚含量,并改變了黑木耳單糖組成比例,其對氧自由基和ABTS+自由基的清除能力也分別提高了3.2倍和2.7倍。值得一提的是,在其他食藥用菌的培養(yǎng)基質(zhì)中添加生物活性物質(zhì)也取得相似的效果。如辛燕花等[22]報道,添加何首烏深層發(fā)酵后,靈芝菌絲體中多糖、總?cè)坪忘S酮含量分別是對照的2.0、1.5倍和3.2倍;靈芝菌絲體中還原力、超氧陰離子自由基清除率和羥基自由基清除率分別是對照的4.5倍、1.5倍和2.0倍。由此可見,培養(yǎng)基質(zhì)中添加生物活性物質(zhì),改變了黑木耳等食用菌化學(xué)成分的合成代謝途徑,從而促進了其生物量、活性物質(zhì)含量和功能的提升。
本試驗結(jié)果表明,黃芪水提物的添加可促進深層發(fā)酵黑木耳菌絲體的生長,并可提升其活性物質(zhì)含量和抗氧化活性。本研究可為黃芪的開發(fā)利用及新型食藥用菌產(chǎn)品的研發(fā)提供參考。后續(xù)可在黃芪添加對黑木耳和其他食藥用菌子實體的形成、生產(chǎn)性能、化學(xué)成分、生物活性的影響方面展開深入研究。